Section 2 RNA結構與功能多樣性

來自生物基因組的所有轉錄物可分為編碼蛋白質的mRNA和非編碼RNA（noncodingRNA，ncRNA）。以往認為ncRNA都是無功能的垃圾基因（genejunk），但事實上它們擔負著重要的功能。目前發(fā)現(xiàn)：生物體越復雜，ncRNA比例越高，人類基因組中編碼蛋白質的基因只占全長的2%，果蠅為75%，酵母30%，大腸桿菌84%；而且人類編碼蛋白質的基因99%與鼠同源。說明：生命形式的多樣性可能是由非編碼部分和未知部分決定的，而不單純是蛋白質序列。一、RNA的種類及功能多樣化：現(xiàn)在是1頁\一共有65頁\編輯于星期一基因組轉錄物mRNAncRNA調控功能RNA(RNA調節(jié)子)持家RNAsnoRNAsnRNArRNARNAasePRNAtRNAtmRNAvRNA(穹窿RNA)gRNA(指導RNA)SRPRNA端粒RNA初級轉錄物加工翻譯和翻譯質控轉錄調節(jié)/染色質結構調節(jié)翻譯調節(jié)蛋白質功能調節(jié)RNA/蛋白質定位調節(jié)其它現(xiàn)在是2頁\一共有65頁\編輯于星期一

真核細胞內RNA的種類及分布種類細胞定位英文縮寫分子大小及沉降系數功能信使RNA胞漿及細胞核線粒體mRNAmtmRNA取決于編碼蛋白質的大小，1000~10,000個核苷酸9~40S蛋白質合成的模板

轉運RNA胞漿及細胞核線粒體tRNAmttRNA4S，74-95個核苷酸3.2~4S轉運氨基酸

核糖體RNA胞漿及細胞核線粒體rRNAmtrRNA28S，5400個核苷酸18S，2100個核苷酸5.8S，160個核苷酸5S，120個核苷酸16S，1650個核苷酸12S，1100個核苷酸

與蛋白質共同構成核糖體

現(xiàn)在是3頁\一共有65頁\編輯于星期一種類細胞定位英文縮寫分子大小及沉降系數功能不均一核RNA胞漿及細胞核hnRNA成熟mRNA及其他RNA的前體

小核RNA胞漿及細胞核snRNA100~300個核苷酸

參與hnRNA的剪接、轉運

小核仁RNA胞漿及細胞核snoRNArRNA的加工與修飾

小胞質RNA胞漿及粗面內質網

scRNA/7SL-RNA129個核苷酸

信號識別顆粒的組成成分，選擇分泌蛋白

（續(xù)表）現(xiàn)在是4頁\一共有65頁\編輯于星期一二、RNA折疊（RNAfolding）DNA折疊通常是在雙螺旋基礎上的折疊，RNA折疊是單鏈回折形成雙螺旋和單鏈交替出現(xiàn)的莖環(huán)結構，其基本單元是發(fā)夾（hairpin）。（RNA單鏈也傾向于形成單鏈螺旋）。多數RNA沒有規(guī)則的二級結構（tRNA除外），統(tǒng)計分析結果顯示，RNA折疊結構的基本模塊為：假結（pseudoknots)；環(huán)（loop）；

RNA錯配區(qū)（mispairingregions）；核苷三聯(lián)體相互作用；四體（quadruplexes）；

U-轉折（U-turn）等?，F(xiàn)在是5頁\一共有65頁\編輯于星期一TypicalRNAhelixSinglestrandbulgeInternalloopHairpinHairpindoublehelix現(xiàn)在是6頁\一共有65頁\編輯于星期一根據單鏈堿基所處的位置，又可將環(huán)分為發(fā)夾環(huán)（hairpinloop）、內環(huán)（internalloop）、膨脹環(huán)（bulgeloop)以及多分支環(huán)（multibranchloop）：RNA折疊速度很快；單鏈區(qū)的存在使自由能升高，構象可能不是能量最低的穩(wěn)態(tài)，而是亞穩(wěn)態(tài)。現(xiàn)在是7頁\一共有65頁\編輯于星期一1。tRNA：呈三葉草形（個別二葉草）氨基酸臂(aminoacidarm)：7bp；富含G；末端為CCA，接受活化的氨基酸二氫尿嘧啶環(huán)(dihydrouridineloop；DHUloop；D-loop)：8~12nt；3~4bp的二氫尿嘧啶臂反密碼環(huán)（anticodonloop):7nt；中部為反密碼子額外環(huán)(extraloop)：也稱可變環(huán)，3~18nt，是tRNA分類的重要指標假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷環(huán)(TCloop)：7nt現(xiàn)在是8頁\一共有65頁\編輯于星期一攜帶氨基酸辨認并結合氨酰tRNA合成酶識別mRNA上的密碼子識別并結合核糖體氨基酸臂DHU環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TΨC環(huán)tRNA中幾乎所有恒定或半恒定核苷酸都出現(xiàn)在環(huán)區(qū)或游離端區(qū)，此處也是蛋白質或其它分子結合部位或功能區(qū)。現(xiàn)在是9頁\一共有65頁\編輯于星期一?tRNA的三級結構：呈倒L形短臂：氨基酸臂+TC環(huán)

長臂：額外環(huán)+D環(huán)

+反密碼環(huán)大?。?57525A通過額外的堿基對形成一些二級結構中沒有的新的氫鍵?tRNA不與蛋白質裝配，無四級結構氨基酸臂TC環(huán)D-環(huán)額外環(huán)反密碼環(huán)現(xiàn)在是10頁\一共有65頁\編輯于星期一原核生物rRNA:23S,16S,5S?5SrRNA：位于大亞基上，無稀有堿基,可與tRNA和蛋白質相互識別和作用

?16SrRNA：位于核糖體小亞基上，與mRNA結合

?23SrRNA：位于核糖體大亞基上，是核酶，催化肽鍵的生成真核生物rRNA：修飾核苷較多大亞基：28S，5.8S，5S，小亞基：18SrRNA二級結構呈三葉形，是核糖體的骨架2。rRNA現(xiàn)在是11頁\一共有65頁\編輯于星期一大腸桿菌16SrRNA的二級結構現(xiàn)在是12頁\一共有65頁\編輯于星期一5SrRNA二級結構現(xiàn)在是13頁\一共有65頁\編輯于星期一5′3′順反子順反子順反子插入順序插入順序先導區(qū)末端順序原核生物：多順反子(polycistronicmRNA)，即一條

mRNA上有多個編碼區(qū)，無修飾堿基(包括噬菌體RNA)5’-3’5’-帽子結構編碼區(qū)3’非編碼區(qū)3’-polyA尾巴

5’非編碼區(qū)3。mRNA：

真核生物：單順反子,有時有極少數甲基化的堿基現(xiàn)在是14頁\一共有65頁\編輯于星期一mRNA（信使RNA，messengerRNA)：約占5%mRNA在真核生物中的初級產物稱為hnRNA。hnRNA內含子(intron)編碼序列mRNA

外顯子(exon)編碼序列3.1mRNA及其前體結構：現(xiàn)在是15頁\一共有65頁\編輯于星期一Pre-mRNA由于存在內含子，因此其二級結構在成熟過程中是變化的。Pre-mRNA的內含子剪切，需要順式作用元件（包括5’和3’剪切位點，以及分支點序列）和反式作用因子的相互作用。5’和3’剪切位點在內含子通常是保守的5’-GU…AG-3’，若其一發(fā)生變化，則激活相鄰的GU或AG，引發(fā)選擇性剪切。分支點一般位于3’-剪切點上游50nt范圍內，酵母中分支點序列為：UACUAAC（其中倒數第三個A為分支點）反式作用因子包括U系列snRNA與蛋白質組成的snRNP，以及U2AF、hnRNP、IBP等參與剪切和調控。現(xiàn)在是16頁\一共有65頁\編輯于星期一

內含子剪切位點與RNA二級結構的關系RNA的空間折疊結構在一級結構的拼接過程中提供重要信息。約90%的5’或3’剪切位點的G，都位于二級結構的環(huán)區(qū)基部或靠近環(huán)端部的莖區(qū)；3’剪切位點附近，通常還有兩個比較靠近的環(huán)。約82%的分支點位于RNA的莖和環(huán)連接部位。5’3’現(xiàn)在是17頁\一共有65頁\編輯于星期一

人彈性蛋白的外顯子和內含子結構：現(xiàn)在是18頁\一共有65頁\編輯于星期一mRNA和與其編碼的蛋白質在空間結構上存在著令人驚奇的對應關系，說明核酸傳遞的遺傳信息不僅是線性一維的，還存在空間三維信息的對應傳遞。以人的前尿激酶（humanprourakinase）分子為例：mRNA三級結構轉彎區(qū)，同樣對應于蛋白質的轉彎區(qū)；-螺旋最強或中等形成者都位于mRNA二級結構的莖區(qū)；-折疊中的兩條肽鏈，其mRNA編碼序列一個位于環(huán)區(qū)，另一個一定位于莖區(qū)，并且一級序列相距可能很遠，但在mRNA三級結構中彼此靠近。3.2mRNA與其編碼的蛋白質空間結構對應關系：現(xiàn)在是19頁\一共有65頁\編輯于星期一

人前尿激素酶mRNA結構

打點的區(qū)域對應于蛋白質轉彎區(qū)；

T：turnB：-sheetH：-Helix現(xiàn)在是20頁\一共有65頁\編輯于星期一

根據mRNA與蛋白空間結構關系繪制的人前尿激酶的空間結構圖：現(xiàn)在是21頁\一共有65頁\編輯于星期一4具有催化功能的RNA內含子結構：I類內含子有著非常相似的核心區(qū)結構（由P3-9構成），稱為Michel-Westhof模型。四膜蟲前體rRNA內含子三級結構：Michel-Westhof模型I類內含子的二級結構IGS：內部引導序列剪接部位剪接部位現(xiàn)在是22頁\一共有65頁\編輯于星期一第二類內含子的保守序列為GUGY…AY。催化自我剪切反應

酵母內含子coxl-15：EBS:外顯子結合位點IBS:內含子結合位點現(xiàn)在是23頁\一共有65頁\編輯于星期一第II類內含子的二級結構：錘頭結構錘頭狀ribozyme的三級結構現(xiàn)在是24頁\一共有65頁\編輯于星期一5。其它小分子RNA：5.1snRNA：功能：與20種以上蛋白結合成snRNP參與hnRNA的拼接；特點：富含U；5’-端含有三甲基鳥嘌呤的帽狀結構；

現(xiàn)在是25頁\一共有65頁\編輯于星期一4.2snoRNA：核仁小RNA功能：參與rRNA中核苷酸殘基的修飾（約5%的核糖C2’甲基化修飾，及假尿嘧啶形成），修飾酶種含有C/D類snoRNA。C類：代表A/GUGAUGA保守序列

D類：代表CUGA保守序列4.3siRNA：（smallinterferingRNA）小干擾RNA在體內與mRNA作用，并導致其降解，使特定基因發(fā)生轉錄后沉默，是重要的基因表達調節(jié)方式。特點：通常為20nt左右的雙鏈RNA（dsRNA)現(xiàn)在是26頁\一共有65頁\編輯于星期一三RNA功能多樣性：（1）RNA自身是遺傳信息的攜帶者：RNA病毒（2）RNA在遺傳信息表達中起著決定性的作用：mRNA的信息中介作用、rRNA參與組成核糖體、tRNA搬運氨基酸；（3）RNA具有催化功能：M1RNA等ribozyme（4）多種小分子RNA（snRNA、scRNA、snoRNA）及其蛋白復合物參與RNA的加工和修飾；微小RNA(microRNA)、小片段干擾RNA（siRNA）參與轉錄水平調節(jié)，對基因表達和細胞功能具有調節(jié)作用：（6）RNA在生物進化中具有重要意義：RNA起源學說現(xiàn)在是27頁\一共有65頁\編輯于星期一（一）tmRNA:

tmRNA，也稱10SaRNA，是存在于細菌的一類穩(wěn)定的小RNA，發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代因其同時具備信使RNA和轉錄RNA的功能而在最近引起了研究者的濃厚興趣。tmRNA一半結構類似tRNA，并攜帶一個Ala；另一半可作為mRNA翻譯出一個十肽，識別3’端殘缺的mRNA，使其翻譯產物帶上標志（異常十一肽尾部）而被降解，是細菌體內蛋白質合成中起“質量控制”的物質基礎之一。最近又發(fā)現(xiàn)它與基因的表達調控及細胞周期的調控等生命過程密切相關。因此，關于tmRNA的研究已經引起了研究者的高度重視，它將是RNA組學研究的一個重要內容?，F(xiàn)在是28頁\一共有65頁\編輯于星期一1。tmRNA的結構tmRNA的5’(~50nt)和3’-末端(~70nt)構成tRNA樣區(qū)域,3’末端有CCA保守序列和G:U堿基對；該區(qū)域同樣有結合莖(7bp)、T臂(所有tmRNA都存在tRNATΨC臂的保守序列GTCA/GA)、D環(huán)，沒有反密碼莖環(huán)結構。另一重要區(qū)域是mRNA區(qū)域，內含一段開放閱讀框，負責編碼長10/15aa的信號肽，后面是位于發(fā)夾結構中的終止密碼子。兩個區(qū)域之間有4個假結狀結構(PK1-4)，也有5個和僅有1個的報導。不同細菌的tmRNA的大小在349-411nt之間,E.colitmRNA為363nt，由一個單基因ssrA編碼?，F(xiàn)在是29頁\一共有65頁\編輯于星期一tRNA樣區(qū)域的結構和折疊方式類似典型tRNA的四葉草結構，其結構的維持與D和T環(huán)之間的相互作用有關。雖然tRNA樣區(qū)域沒有密碼子-反密碼子復合體以供核糖體A位識別，有證據表明tmRNA自身或與其結合的蛋白質具有類似核糖體A位識別功能。tRNA樣區(qū)域周圍有高度保守的堿基序列，對tmRNA的空間構像和功能有重要作用，同時tRNA樣區(qū)域同其mRNA區(qū)域也存在著相互作用。四個假結狀結構中，離tRNA樣區(qū)域最近的PK1區(qū)域被認為對維持tmRNA功能有關，其余3個假結狀結構似乎作用不大。PK2區(qū)域在某些細菌中有亞結構存在，可能與tRNA樣區(qū)域和mRNA區(qū)域的相互作用有關?，F(xiàn)在是30頁\一共有65頁\編輯于星期一2。tmRNA作用模型：反式翻譯模型，Karzai等提出

基于缺失終止密碼子的tmRNA作用的模型現(xiàn)在是31頁\一共有65頁\編輯于星期一細菌中蛋白質如在轉錄過程中由于某種蛋白質因子結合在某基因的操縱子區(qū)域而影響了轉錄子的完整性，或是轉錄子在轉錄后加工過程中被不恰當地切斷，都有可能使在翻譯中的mRNA序列缺失終止密碼子。當核糖體移動到不完整的mRNA的3’端時，核糖體不能與mRNA脫離，P位的不完整蛋白質亦不能及時釋放。此時，3’攜有Ala的tmRNA在一系列蛋白因子的幫助下，識別滯留的核糖體，并進入核糖體的A位，通過轉肽反應，將丙氨酸同滯留在P位的蛋白質相連接，隨后tmRNA進入P位，核糖體將從mRNA脫離下來，轉而結合到tmRNA的mRNA區(qū)域，并以mRNA區(qū)域為模板，沿著剛翻譯的多肽C末端繼續(xù)翻譯其編碼的一段10aa的信號肽，由ORF提供終止密碼子。該信號肽的氨基酸序列在細菌中高度保守，為AANDENYALAA，可被水解蛋白識別，從而使融合蛋白被水解?，F(xiàn)在是32頁\一共有65頁\編輯于星期一除缺失終止密碼的情況外，在正常生理情況下，相當多的正常mRNA翻譯出的蛋白質中有少部分C末端連接上了一段十肽，說明觸發(fā)tmRNA活化的機制并非那么簡單?，F(xiàn)將近來研究中發(fā)現(xiàn)的幾種情況列出：1.終止子與稀少的Arg密碼子引發(fā)的tmRNA系統(tǒng)活化：

大腸桿菌正常核糖激酶完整mRNA的翻譯產物中，也有一小部分被加上十肽信號肽的現(xiàn)象，連接部位在核糖激酶C末端的3個氨基位置，Arg307，Arg309，UGA。其中Arg-307和Arg309由AGG編碼不常見，同時UGA作為終止子在大腸桿菌中的效率不高。它們可能使翻譯效率在以上位置下降，致使核糖體在這些位置停留時間相對較長，而使tmRNA系統(tǒng)活化。

現(xiàn)在是33頁\一共有65頁\編輯于星期一2.終止子的效率不高及序列下游閱讀框的干擾：導致信號肽連接到具有完整功能的蛋白產物的C末端。3.基因斷裂：

細菌的一些不太重要的基因經常因轉座子插入而使該基因編碼的蛋白產物不完整，被tmRNA識別。4.Lac操縱子被Lac抑制子（LacI）所結合：導致LacI的DNA形成特殊結構，使mRNA轉錄子不完整，導致tmRNA活化。5.被有害的翻譯通讀激活：

正常終止密碼可以被抑制型tmRNA通讀，即可以翻譯出一個氨基酸來。同時翻譯產物通常被延伸，這種產物有時是有害的，可被tmRNA識別?，F(xiàn)在是34頁\一共有65頁\編輯于星期一3。與tmRNA作用有關的蛋白因子：tmRNA的產生、加工、儲存、結合到mRNA及核糖體均需要有關的蛋白質因子：丙酰氨tRNA合成酶、延長因子EF-TU、GTP、核糖體蛋白質S1、PrsA、RNaseR和YfbG。

（1）核糖體蛋白質S1:S1存在于大多數細菌中，并與選擇翻譯啟始點有關。S1同假結狀結構PK2，PK3，PK3-PK4結合部相結合，但主要的結合部位在PK1。當S1被清除后，tmRNA不能同核糖體結合。（2）RNaseR:

是RNaseII家族的一員，由3’-5’外切酶區(qū)域和一個S1樣區(qū)域，具體生化性質不詳，推測與被tmRNA代替的mRNA的降解有關?，F(xiàn)在是35頁\一共有65頁\編輯于星期一（3）PrsA:

是一種與核苷酸從頭合成有關的酶，同SsrA結合，位點、作用均不清楚。（4）SAF:由yfbG基因編碼，功能不詳。（5）SmpB:

由160個aa組成，與tmRNA特異性緊密結合形成tmRNA-smpB復合體。smpB能增強tmRNA接受Ala的能力，同tmRNA一起，在翻譯組份存在的條件下足以完成轉錄-翻譯過程。若smpB缺失，則tmRNA不能進入A位。（6）EF-TU-GTP復合體:

同tmRNA結合起到保護丙氨?；痶mRNA酯鍵的功能。現(xiàn)在是36頁\一共有65頁\編輯于星期一4。tmRNA生物學意義（1）

將各種原因導致的滯留核糖體從mRNA上釋放出來，使其加入到下一輪蛋白質的合成。

在細菌的生活周期里，如何保持正確的蛋白質翻譯始終是一個大問題，翻譯錯誤可源于基因的轉錄階段或翻譯階段。導致的后果是結合mRNA的核糖體由于不能及時地同mRNA分離而“滯留”在mRNA上，不能加入下一次循環(huán)，這對核糖體資源有限的細菌來說,是十分不利的，而翻譯錯誤的幾率在細菌應激狀態(tài)下明顯升高。目前證明tmRNA的存在對于淋球菌、肺炎鏈球菌是必需的，而對于大腸桿菌等不是必需的，因大腸桿菌存在一種代謝途徑，作用同tmRNA相仿。

現(xiàn)在是37頁\一共有65頁\編輯于星期一（2）將不完整的/或完整的蛋白產物加上信號肽，使其徹底水解。目前認為這一種功能的生物學意義不及前者，只是對某些基因的表達起微調的作用?，F(xiàn)在是38頁\一共有65頁\編輯于星期一（二）反義RNA:

1。反義RNA（antisenseRNA，asRNA）:

含有與靶mRNA序列互補的RNA序列，天然存在于原核細胞中（真核細胞實現(xiàn)了人工導入），是反義基因或基因的反義鏈轉錄的(分別為反式反義RNA和順式反義RNA)有調節(jié)功能的RNA片段，能通過與互補的靶核酸（包括DNA、前體mRNA和成熟mRNA）形成局部相互作用而阻止DNA的轉錄、前體mRNA的加工和mRNA的有效翻譯，從而調節(jié)基因的表達。最早發(fā)現(xiàn)的反義RNA也被稱為干擾mRNA的互補RNA（mRNAinterferingcomplementaryRNA，micRNA）?，F(xiàn)在是39頁\一共有65頁\編輯于星期一2。性質和意義：天然反義RNA調控系統(tǒng)廣泛存在于原該生物中：*在復制水平上，反義RNA與RNA引物互補結合抑制復制；*當反義RNA與mRNA5’非編碼區(qū)或翻譯起始部位結合時，可使mRNA不能與核糖體結合或阻止核糖體沿mRNA移動；*與真核基因初始轉錄產物各加工位點，如5’-端帽結構形成位點、內含子外顯子結合位點、polyA形成位點等結合時，則影響mRNA的加工成熟和從核內向胞漿轉移，從而達到專一抑制基因表達。意義:已成為尋找低毒、高選擇性抗腫瘤抗病毒藥物途徑。反義RNA可以通過重組DNA技術和人工合成法得到：在合適的啟動子和終止子之間，反向插入靶基因，可構建表達反義RNA的重組體，在細胞內表達反義RNA而抑制靶mRNA的表達?，F(xiàn)在是40頁\一共有65頁\編輯于星期一3。作用方式舉例：滲透壓調節(jié)中的micRNAMuzuno等在研究滲透壓變化對大腸桿菌外膜蛋白基因表達的影響時發(fā)現(xiàn)：有兩種外膜蛋白，OmpC和OmpF，的合成受滲透壓調節(jié)。高滲條件下，OmpC合成增加而OmpF減少，低滲時反之，且兩種蛋白合成總量始終保持不變。后發(fā)現(xiàn)：在OmpC基因啟動子前有一段CX28區(qū)域，當OmpC基因轉錄時，CX28以反方向轉錄出一種6SRNA(174nt)，稱為micF，這個小RNA有很大一部分序列與OmpF的mRNA5’-端互補，二者可結合并導致OmpF的mRNA失活，因此是一個轉錄后水平的反義RNA?，F(xiàn)在是41頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是42頁\一共有65頁\編輯于星期一（二）微小RNA（microRNA，miRNA）：

1。miRNA（microRNA）：發(fā)現(xiàn)于1993年（Ambros等），是內源性發(fā)夾結構轉錄產物衍生而來的一種長19-35nt的單鏈RNA（singlestrandRNA，ssRNA)，可作為一種引導性分子，通過堿基配對與靶mRNA結合，在轉錄后水平上引起靶mRNA的剪切或是翻譯的抑制。在每種高等生物中，存在200種以上的miRNA（人類426種，擬南芥118種），約占基因組的1%，是最大的基因家族。miRNA可以在不同途徑發(fā)揮作用，包括發(fā)育的時序控制、造血細胞分化、細胞凋亡和增殖以及器官形成等；還發(fā)現(xiàn)部分雙鏈DNA病毒(卡波氏肉瘤病毒等）可編碼產生miRNA，可能與病毒的致病性及與宿主的相互作用有關?，F(xiàn)在是43頁\一共有65頁\編輯于星期一2。miRNA的生物學特征：目前認為：miRNA是一種平均22nt的單鏈RNA，3’-端可有1-2個nt的長度變化，是由一種局部發(fā)夾結構的內源性轉錄物，經RNaseIII——DCR（Dicer）加工而成。miRNA廣泛存在于真核生物，不編碼蛋白質。核酸組成具有一定的特征，為miRNA所獨有：末端為5’-P和3’-OH；

5’-端的第1個堿基對U有強烈傾向性，而排斥G；第2-4堿基則缺乏U；除了第4個堿基外，其它位置都缺乏CmiRNA的確認必須符合相應的表達標準和生物發(fā)生標準。現(xiàn)在是44頁\一共有65頁\編輯于星期一3。miRNA的發(fā)生和成熟過程：包括核內Pri-miRNA的產生、Pre-miRNA輸出以及成熟miRNA形成過程?，F(xiàn)在是45頁\一共有65頁\編輯于星期一miRNA成熟過程中的要素：微處理器：在核內使Pri-miRNA（primarytranscriptofmicroRNA）轉變?yōu)?0nt的莖環(huán)狀前體Pre-miRNA（microRNAprecusor），該過程需要RNaseIII的作用（擬南芥中是DCL1，動物、線蟲和果蠅為Drosha蛋白)。核輸出素-5（exportin-5，Exp-5）：在Ran和GTP參與下，將Pre-miRNA由核轉運到細胞質。Dicer(DCR)：另一種RNaseIII，在進化中高度保守，是干擾性小RNA產生的關鍵性蛋白，特異性作用于雙鏈RNA。在Dicer作用下，Pre-miRNA被切割成21~25nt的miRNA雙鏈中間體。AGO：Argonaute蛋白，在幾乎所有真核細胞中保守存在，負責剪切miRNA雙鏈中間體中的miRNA的反義鏈，使miRNA成熟，含有PAZ和PIWI兩個特征結構域。現(xiàn)在是46頁\一共有65頁\編輯于星期一4。miRNA的效應過程：關鍵是RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）的生成與作用，其生成貫穿著小RNA產生后的全部過程。RISC復合體最大的特征是含有單鏈小分RNA和AGO蛋白，它的生成需要經RISC轉載復合體（RISCloadingcomplex，RLC）的作用。在細胞質中Pre-miRNA在DCR作用下成熟，miRNA單鏈整合到DCR復合體內，轉變?yōu)閙iRLC，并進一步組裝為RISC復合體，其總體過程和機制尚待進一步了解。現(xiàn)在是47頁\一共有65頁\編輯于星期一4.1miRISC的組裝：現(xiàn)在是48頁\一共有65頁\編輯于星期一RISC復合體主要成分在不同生物物種中有較大的出入：現(xiàn)在是49頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是50頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是51頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是52頁\一共有65頁\編輯于星期一4.2miRNA的成熟和效應途徑現(xiàn)在是53頁\一共有65頁\編輯于星期一

不同的AGO蛋白與miRNA或siRNA組裝成為兩類RISC：（1）（2）現(xiàn)在是54頁\一共有65頁\編輯于星期一（三）RNA干擾：

1.RNA干擾（RNAinterference，RNAi）：

1995年發(fā)現(xiàn)，一些外源的小RNA能夠關閉線蟲中的有關基因的表達，與植物中已知的所謂基因沉默（genesilence）相似，是RNA對基因功能干擾和調節(jié)的結果，被稱為RNAi。1998年證實，干擾是由雙鏈RNA（dsRNA）而非單鏈反義RNA介導的，被稱為小的干擾RNA（smallinterferenceRNA,siRNA)。RNAi可以在兩個水平上發(fā)生：1。轉錄水平：抑制基因轉錄，稱為轉錄基因沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS）2。轉錄后水平：結合并引導特異mRNA降解，稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）現(xiàn)在是55頁\一共有65頁\編輯于星期一

盡管隨著研究的深入，siRNA與miRNA的界限也來越不明顯，但還是存在諸多不同。目前有人認為，miRNA可能是siRNA的進化形式。2。siRNA與miRNA的差別：現(xiàn)在是56頁\一共有65頁\編輯于星期一現(xiàn)在是57頁\一共有65頁\編輯于星期一miRNA和siRNA的不同作用途徑現(xiàn)在是58頁\一共有65頁\編輯于星期一RNAi的作用機制

RDE-1和4：都是AGO蛋白

現(xiàn)在是59頁\一共有65頁\編輯于星期一3。細胞核內RNAi途徑：3.1RNA指導的DNA甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM）RdDM是發(fā)現(xiàn)的第一個基因組水平的RNA指導的表觀遺傳學修飾，在植物中，包含有與啟動區(qū)域同源序列的dsRNA可以通過RNAi導致啟動子的甲基化和轉錄水平基因沉默。(Dicer-like)(RdRP-II)(DdRP-II)RNA信號甲基轉移酶HDA6：組蛋白去乙酰酶SUVH4：也稱kryptonite（沉默抑制子1）(Demeter)MET1識別（非CG區(qū)）現(xiàn)在是60頁\一共有65頁\編輯于星期一3.2RNAi和異染色質形成：裂殖酵母著絲粒重復區(qū)兩條鏈可轉錄產生dsRNA，或在RdRP催化下生成雙鏈形式。后者在Dicer作用下產生siRNA。siRNA引導組蛋白甲基轉移酶（HMT）到染色質專一性修飾組蛋白H3的Lys-9（H3K9），使