我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析專家講座

我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析試講：張昕亮我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第1頁(yè)【摘要】目標(biāo)

測(cè)定我國(guó)人用狂犬病疫苗株4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白G基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。方法RT-PCR擴(kuò)增3株病毒糖蛋白G基因，分別克隆至pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用DNAstarMegAlign軟件分析3株病毒糖蛋白同源性，AntheProt5.0及DNAstarProtean軟件分析3株病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)及潛在B細(xì)胞抗原表位差異。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第2頁(yè)狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV）引發(fā)人獸共患疾病，一旦發(fā)病，幾乎100％死亡，疫苗接種是預(yù)防該病主要辦法。當(dāng)前，我國(guó)人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株主要有aG、CTN-1V和PV2061株，其中aG株和CTN-1V株為我國(guó)自行分離并傳代適應(yīng)，PV2061株起源于法國(guó)巴斯德株。上述病毒株生產(chǎn)人用狂犬病疫苗經(jīng)臨床應(yīng)用顯示，含有良好保護(hù)效果。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第3頁(yè)

我國(guó)人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用原始種子4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白（Glycoprotein，G）全基因序列進(jìn)行測(cè)定，分析3株病毒糖蛋白氨基酸序列同源性我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第4頁(yè)1.材料與方法

1.1菌毒株

狂犬病病毒原始種子批4aGV、CTN-1V和PV2061均由中國(guó)食品藥品檢定研究院病毒一室保留；感受態(tài)大腸桿菌DH5α。

1.2主要試劑

QIAampViralRNAMiniKit

ReverseTranscriptionSystem

TaKaRaLATaq誖DRR002A

EZNA誖GelExtractionKit

pGEM-Tvectorsystem我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第5頁(yè)1.3引物設(shè)計(jì)及合成

依據(jù)GenBank中登錄aG、CTN、PV株病毒M、L區(qū)基因序列，應(yīng)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)位于M區(qū)及L區(qū)上下游引物，見(jiàn)表1。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第6頁(yè)我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第7頁(yè)1.4病毒G區(qū)基因擴(kuò)增

用QIAampViralRNAMiniKit提取病毒RNA，

ReverseTranscriptionSystem提供隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄

合成cDNA第一鏈，再以其為模板，PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。

反應(yīng)體系為：cDNA2μl，10×buffer5μl，2.5mmol／L

dNTP4μl，上下游引物各2μl（10pmol／L），LATaq

1μl，去離子水補(bǔ)足體積至50μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，53℃30s，72℃2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖

凝膠電泳判定，EZNA誖GelExtractionKit純化回收。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第8頁(yè)1.5克隆測(cè)序

將PCR純化產(chǎn)物與pGEM-Tvector連接，轉(zhuǎn)化

感受態(tài)大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR判定后，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限企業(yè)測(cè)序，每個(gè)片段最少送6個(gè)陽(yáng)性克隆。1.6病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAstar中MegAlign軟件分析3株病

毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列同源性；應(yīng)用

AntheProt5.0及DNAstar中Protean軟件分析3株病毒糖蛋白結(jié)構(gòu)及潛在B細(xì)胞抗原表位差

異。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第9頁(yè)2.結(jié)果2.1病毒G區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物判定應(yīng)用配對(duì)引物分別擴(kuò)增4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒G區(qū)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見(jiàn)約2300bp特異條帶，大小與預(yù)期相符；應(yīng)用3對(duì)引物分別擴(kuò)增4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒G區(qū)基因，僅配對(duì)引物擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)條帶。盡管應(yīng)用aG-MGL-F／R引物對(duì)PV2061株病毒G區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)有條帶出現(xiàn)，但該條帶大小及擴(kuò)增產(chǎn)物濃度均與目標(biāo)片段顯著不符，為非特異性擴(kuò)增。所以3對(duì)引物均含有特異性，與其它毒株無(wú)特異性配對(duì)。見(jiàn)圖1。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第10頁(yè)圖1

4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)

物電泳圖我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第11頁(yè)2.2

4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白基因序列同源性分析4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白測(cè)序結(jié)果已提交到GenBank，登錄號(hào)分別為JN234411、JN234418和JN234424。測(cè)序結(jié)果表明，3株病毒均為基因Ⅰ型狂犬病病毒；其基因組M-G區(qū)間序列長(zhǎng)度均為5bp，CTN-1V株M-G區(qū)間序列為CTTTT，4aGV與PV2061株為CTATT；3株病毒G區(qū)全序列均含有5′端AACA和3′端polyA尾結(jié)構(gòu)，其中CTN-1V、4aGV株G區(qū)基因長(zhǎng)度為2067bp，PV2061株為1675bp，基因同源性為76.0％～88.4％；3株病毒G區(qū)ORF基因均為1575bp，基因同源性為84.4％～91.5％；CTN-1V、4aGV株G-L區(qū)間序列長(zhǎng)度為24bp，PV2061株為423bp。對(duì)推導(dǎo)3株病毒糖蛋白氨基酸序列同源性分析表明，3株病毒糖蛋白均由524個(gè)氨基酸組成，同源性為90.5％～92.2％，見(jiàn)表2。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第12頁(yè)我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第13頁(yè)2.3糖蛋白信號(hào)肽分析

對(duì)4aGV、CTN-1V和PV2061株糖蛋白信號(hào)肽分析發(fā)覺(jué)，三者前19位氨基酸均存在潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，其中第19位氨基酸為三者潛在信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)，4aGV株病毒糖蛋白第17位氨基酸為潛在信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第14頁(yè)我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第15頁(yè)2.4糖蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析對(duì)4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，結(jié)果顯示，3株病毒糖蛋白分別在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潛在可折疊螺旋疏水性區(qū)域，可判斷為顯著跨膜區(qū)域，見(jiàn)圖3。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第16頁(yè)圖3

4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV2061株（C）糖蛋白潛在跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第17頁(yè)2.5糖蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用AntheProt5.0軟件中Gibrat法對(duì)4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，4aGV、CTN-1V和PV2061株糖蛋白氨基酸殘基均富含潛在α螺旋、β折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，其百分比分別為30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，3株病毒糖蛋白發(fā)生扭曲、折疊幾率較高，易形成豐富二級(jí)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第18頁(yè)我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第19頁(yè)2.6糖蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)合4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白一級(jí)、二級(jí)及局部特殊結(jié)構(gòu)，選取各株病毒糖蛋白親水性強(qiáng)，無(wú)α螺旋、β片層規(guī)則結(jié)構(gòu)，并含有β轉(zhuǎn)角可塑性較大區(qū)域及表面可能性和抗原指數(shù)高區(qū)域，分別得到3株病毒株糖蛋白潛在B細(xì)胞抗原表位區(qū)域，三者表位位置與數(shù)量相同，見(jiàn)圖5和表3。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第20頁(yè)我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第21頁(yè)我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第22頁(yè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移（定位）N-末端氨基酸序列，其最少含有1個(gè)帶正電荷氨基酸，中部有一高度疏水區(qū)以經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜，并含有種屬特異性。4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒在N-末端前19位氨基酸均存在潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，可引導(dǎo)病毒糖蛋白在細(xì)胞膜上表示。另外，3株病毒潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)氨基酸同源性僅為78.9％～94.7％，這可能是在傳代減毒過(guò)程中，病毒對(duì)不一樣傳代基質(zhì)細(xì)胞適應(yīng)表征，反過(guò)來(lái)也間接影響了3株病毒在Vero細(xì)胞中適應(yīng)程度。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第23頁(yè)Benmansour等［11］經(jīng)過(guò)對(duì)中和單克隆抗體逃逸株點(diǎn)突變研究，對(duì)糖蛋白中和抗原位點(diǎn)進(jìn)行了初步定位，證實(shí)了糖蛋白含有3個(gè)中和抗原位點(diǎn)，且均為空間依賴型抗原位點(diǎn)，但當(dāng)前仍缺乏病毒糖蛋白線性表位研究資料，所以本研究對(duì)4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入分析，結(jié)果顯示，3株病毒糖蛋白均易發(fā)生扭曲、折疊，在多個(gè)區(qū)域存在α螺旋、β折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，形成豐富二級(jí)結(jié)構(gòu)，并在多個(gè)位點(diǎn)存在潛在B細(xì)胞抗原位點(diǎn)。盡管當(dāng)前尚無(wú)準(zhǔn)確率較高抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法，但本研究分析結(jié)果仍可作為確定糖蛋白潛在優(yōu)勢(shì)表位參考。另外，本研究應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增不一樣株病毒糖蛋白全基因，并結(jié)合對(duì)應(yīng)糖蛋白編碼區(qū)序列同源性分析，可初步實(shí)現(xiàn)病毒株快速判定。我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第24頁(yè)研究結(jié)果4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均屬基因Ⅰ型狂犬病病毒；其糖蛋白G區(qū)基因同源性為76.0％～88.4％，G區(qū)ORF基因同源性為84.4％～91.5％，氨基酸序列同源性為90.5％～92.2％；3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，其中第19位氨基酸為三者潛在信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)，第17位氨基酸為4aGV株病毒糖蛋白潛在信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)；3株病毒糖蛋白分別在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潛在可折疊螺旋疏水性區(qū)域，為顯著跨膜區(qū)域；

4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸殘基均富含潛在α螺旋、β折疊及卷曲結(jié)構(gòu)，其百分比分別為30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，易發(fā)生扭曲、折疊，形成豐富二級(jí)結(jié)構(gòu)；

3株病毒糖蛋白潛在B細(xì)胞抗原表位位置與數(shù)量相同我國(guó)人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息學(xué)分析第25頁(yè)

糖蛋白含有