實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程專家講座

動(dòng)物胚胎工程——轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物和克隆動(dòng)物制作胚胎學(xué)基礎(chǔ)管敏強(qiáng)溫州醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第1頁第一節(jié)動(dòng)物胚胎工程概述當(dāng)代動(dòng)物胚胎工程是指全部對(duì)配子和胚胎進(jìn)行操作技術(shù)方法，它研究重點(diǎn)在雌、雄生殖細(xì)胞到囊胚各個(gè)發(fā)育階段上實(shí)施體外操作技術(shù)。細(xì)胞動(dòng)物體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第2頁工程之一：胚胎移植工程之二：胚胎培養(yǎng)工程之三：胚胎保留工程之四：胚胎分割工程之五：體外受精工程之六:顯微注射工程之七：卵激活與孤雌發(fā)育工程之八：細(xì)胞核移植與克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第3頁工程之一胚胎移植實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第4頁一、概述（一）概念胚胎移植（embryotransfer，ET）：又稱受精卵移植，是將體內(nèi)或體外生產(chǎn)哺乳動(dòng)物早期胚胎移植到同種生理狀態(tài)相同雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)，使之繼續(xù)妊娠發(fā)育為新個(gè)體技術(shù)，也稱借腹懷胎。提供胚胎個(gè)體——供體（donor）接收胚胎個(gè)體——受體（recipient）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第5頁為了使供體♀多排卵，通常采取超排（superovulation）；國(guó)外將常規(guī)胚胎移植稱為超數(shù)排卵胚胎移植或稱為多排卵胚胎移植（multipleovulationandembryotransfer，MOET）；當(dāng)前，用體外生產(chǎn)胚胎（invitroproduction,IVP）技術(shù)或克?。╟loning）技術(shù)等方法也能夠生產(chǎn)胚胎，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)胚胎起源，降低了ET成本。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第6頁二、胚胎移植歷史實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第7頁年代成功事件試驗(yàn)動(dòng)物完成人189019321933

19421951

1952195919701971

19721973197619781981198219831989

19971998胚胎移植胚胎移植胚胎移植

胚胎移植胚胎移植

胚胎低溫長(zhǎng)距離運(yùn)輸體外受精胚胎分割成功第一個(gè)家畜胚胎移植商業(yè)化企業(yè)成立胚胎超低溫冷凍保留國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)成立性別判定胚胎移植成功世界上首例試管嬰兒出世胚胎干細(xì)胞系建立轉(zhuǎn)基因超級(jí)鼠出生哺乳動(dòng)物胚胎細(xì)胞核移植成功經(jīng)過分離X、Y精子控制后代性別取得成功體細(xì)胞核移植成功人胚胎干細(xì)胞系建立基因打靶后體細(xì)胞核移植成功家兔山羊大鼠綿羊小鼠奶牛豬家兔家兔小鼠牛

小鼠哺乳動(dòng)物牛人小鼠小鼠小鼠家兔

綿羊人綿羊WalterHeapeWarwick等Nicholas,JS.Warwick等Fekete和LittleWillett等KvasnichiiAV.Marden&ChangChangMC.Mullen等AlbertaLivestockTransplantsLtd

Whittingham等InternationalEmbryoTransferSocietyHare等Steptoe&EdwardsEvans&KaufmanPalmiter等McGrath&SolterJohnson等

Wilmut等Thomson等&Gearhart等McCreath等表1哺乳動(dòng)物胚胎生物技術(shù)發(fā)展主要事件簡(jiǎn)表

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第8頁1.1初始階段1890-1900W.Heape將安哥拉兔和荷蘭兔受精卵分別移植到比利時(shí)兔輸卵管內(nèi)，分別取得仔兔2只。1.2初級(jí)階段1900-1950主要由英美科學(xué)家在家兔、綿羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。1.3發(fā)展階段1950-1970日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采取非手術(shù)法移植成功。胚胎移植成功率達(dá)70-80%.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第9頁1.4實(shí)用化初始階段1970-1980加美開始成立牛胚胎移植企業(yè)，1973年牛凍胚移植成功（英）.1.5實(shí)用化研究階段1982-大規(guī)模胚胎移植、核移植、嵌合體、胚胎分割、性別判定、體外受精在英美日德廣泛開展?？寺⊙蛘Q生。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第10頁三、胚胎移植意義科研用途：1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因敲除動(dòng)物和克隆動(dòng)物、核移植、胚胎切割、體外受精等取得目標(biāo)動(dòng)物2.動(dòng)物微生物凈化其它用途：1.稀有品質(zhì)動(dòng)物擴(kuò)群（如高產(chǎn)奶牛和瀕危動(dòng)物)2.不孕不育癥治療(顯微受精)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第11頁四、胚胎移植生理學(xué)基礎(chǔ)與基本標(biāo)準(zhǔn)（一）生理學(xué)基礎(chǔ)（二）胚胎移植遵循基本標(biāo)準(zhǔn)（三）開展胚胎移植條件實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第12頁雌性動(dòng)物發(fā)情后生殖器官孕向發(fā)育1早期胚胎處于游離狀態(tài)2移植胚胎含有免疫耐受性341.胚胎移植生理學(xué)基礎(chǔ)

胚胎遺傳特征不受受體雌性動(dòng)物影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第13頁2.胚胎移植基本標(biāo)準(zhǔn)胚胎移植前后所處環(huán)境同一性同一解剖位置：空間環(huán)境一致性同一生理階段：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上同期性

同一物種：供體和受體在分類學(xué)上相同屬性胚胎發(fā)育期限必須處于周期黃體期內(nèi)。胚胎質(zhì)量胚胎必須是正常，并在處理過程中不受不良原因影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第14頁試驗(yàn)室條件

溫度恒定、空氣潔凈、布局合理；技術(shù)條件胚胎來源包含人員技術(shù)水平及所需設(shè)備；

從優(yōu)良雌性動(dòng)物取得大量胚胎。3.開展胚胎移植條件實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第15頁五、胚胎移植基本步驟供、受體選擇供體超數(shù)排卵與人工授精受體同期發(fā)情胚胎搜集胚胎檢驗(yàn)和評(píng)定胚胎移植實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第16頁胚胎移植程序示意圖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第17頁1.供體和受體選擇供體應(yīng)含有相當(dāng)高育種價(jià)值供體生殖機(jī)能應(yīng)處于較高狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)健壯受體應(yīng)輕易購置，繁殖性能好，對(duì)地方適應(yīng)性強(qiáng)，體型中上等，非優(yōu)良品種受體健康情況良好，已進(jìn)入發(fā)情季節(jié)供受體發(fā)情時(shí)間應(yīng)靠近或一致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第18頁2.超數(shù)排卵

超數(shù)排卵是一個(gè)不正常排卵，經(jīng)外源激素處理雌性動(dòng)物，能夠改變性周期，能夠超常數(shù)排卵，甚至能夠超常數(shù)十幾倍。在施行小鼠、兔子和金黃地鼠超數(shù)排卵研究中，曾有1只KM小鼠取得胚胎83枚，有1只免取得胚胎88枚，有1只金黃地鼠采得72枚胚胎統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第19頁

超排所用激素主要有三類。第一類是FSH（促卵泡激素）及其類似物，第二類是LH（促黃體激素）及其類似物，第三類是外源性促排卵類激素如GnRH

等類似物，以及這些激素復(fù)合制劑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第20頁超數(shù)排卵意義采取超數(shù)排卵可大大增加每次排卵數(shù)量在科研上能夠在短時(shí)間內(nèi)取得大量卵和胚胎，能夠滿足胚胎工程研究、遺傳工程研究和建立胚胎庫需要。大大縮短了研究周期在生產(chǎn)中，能夠提升優(yōu)異動(dòng)物繁殖數(shù)量，提升產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第21頁3.同期發(fā)情

利用外源激素制劑或其它生物學(xué)伎倆人為地控制并調(diào)整一群雌性動(dòng)物發(fā)情周期進(jìn)程，使之在預(yù)定時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情，方便有計(jì)劃地合理地組織配種，稱為同期發(fā)情或同時(shí)發(fā)情。要想使雌性動(dòng)物發(fā)情，則必須控制P濃度，即控制黃體“消”，“長(zhǎng)”——即是控制母畜發(fā)情關(guān)鍵。

消：縮短黃體期PG處理長(zhǎng)：人為延長(zhǎng)黃體期P處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第22頁縮短黃體期前列腺素法(PG法)延長(zhǎng)黃體期孕酮法同期發(fā)情方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第23頁經(jīng)過縮短和延長(zhǎng)黃體期進(jìn)行同期發(fā)情縮短黃體期（PGF2α）延長(zhǎng)黃體期（孕激素）正常發(fā)情周期正常黃體期和卵泡期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第24頁大動(dòng)物如山羊綿羊等動(dòng)物主要采取前列腺素類激素如用15-甲基PGF2α或氯前列烯醇等激素使黃體溶解來到達(dá)同期發(fā)情目標(biāo)。小型嚙齒類動(dòng)物如小鼠可經(jīng)過挑選發(fā)情母鼠與結(jié)扎公鼠交配，來到達(dá)同期發(fā)情目標(biāo)，稱為假孕母鼠.動(dòng)物同期發(fā)情實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第25頁定義：利用沖冼液將胚胎從生殖道內(nèi)沖出，并搜集在器皿中。

4.胚胎搜集胚胎搜集時(shí)間：普通在配種后3~8d，發(fā)育至4~8細(xì)胞期后；牛胚胎最好在發(fā)育至桑椹胚晚期或胚泡早期進(jìn)行搜集和移植。胚胎沖洗液:沖胚液現(xiàn)多用杜氏磷酸鹽緩沖液（PBS）、合成輸卵管液（SOF）、布林斯特液等。沖胚液可加1-5％牛血清白蛋白，也可不加；培養(yǎng)液需加入0.1-3.2％牛血清白蛋白，或用1-50％犢牛血清代替（用前56℃30min滅活）

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第26頁胚胎搜集方法:手術(shù)法輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚子宮角沖胚非手術(shù)法二通管三通管實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第27頁5.胚胎檢驗(yàn)與判定

胚胎檢驗(yàn)是指在體視鏡下從沖卵液回收胚胎。同時(shí)檢驗(yàn)胚胎數(shù)量和質(zhì)量。對(duì)發(fā)育正常胚胎供移植或體外培養(yǎng)和保留。胚胎檢驗(yàn)項(xiàng)目：

1、受精卵整體形態(tài)和體積大??；2、透明帶形狀，厚度及損傷程度；3、發(fā)育正常胚胎卵裂球應(yīng)該含有整齊外形，大小一致，分布均勻而緊密，發(fā)育速度與胚齡一致；4、卵細(xì)胞表面顆粒狀態(tài)和多少等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第28頁

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第29頁

1（Ａ）級(jí)：優(yōu)異。胚胎細(xì)胞團(tuán)呈均勻?qū)ΨQ球形，單個(gè)卵裂球（或細(xì)胞）大小、顏色、密度一致，胚胎發(fā)育階段與預(yù)期發(fā)育階段一致。不規(guī)則細(xì)胞相對(duì)較少。最少有85%細(xì)胞物質(zhì)是完整、含有活性胚胎細(xì)胞團(tuán)。這些判斷是以在卵周隙中突出細(xì)胞與正常胚胎細(xì)胞百分比為基礎(chǔ)。透明帶必須是光滑而不應(yīng)是凹陷或平坦，不然會(huì)使胚胎黏附于培養(yǎng)皿或細(xì)管上。2（Ｂ）級(jí)：良好。胚胎細(xì)胞團(tuán)大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞顏色和密度存在一定不規(guī)則。最少有50%細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好、具活性胚胎細(xì)胞團(tuán)。3（Ｃ）級(jí)：質(zhì)差。胚胎細(xì)胞團(tuán)大小和形狀以及單個(gè)細(xì)胞顏色和密度存在嚴(yán)重不規(guī)則。最少有25%細(xì)胞結(jié)構(gòu)是完好、含有活性胚胎細(xì)胞團(tuán)。4（Ｄ）級(jí)：死亡或退化。退化胚胎、卵母細(xì)胞或1細(xì)胞胚胎，沒有活力。

胚胎質(zhì)量分級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第30頁6.胚胎移植

胚胎移植也有手術(shù)法和非手術(shù)法兩種方式，手術(shù)法普通用于全部動(dòng)物，主要用于小動(dòng)物。而非手術(shù)法僅適合用于牛、馬及鹿等大動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第31頁

五、胚胎移植存在主要問題胚胎起源有限缺乏熟練技術(shù)人員胚胎冷凍技術(shù)不完善費(fèi)用高、要求高手術(shù)法輕易出現(xiàn)粘連問題實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第32頁傳統(tǒng)胚胎移植主要由以下一些步驟組成：1.超數(shù)排卵2.同期發(fā)情3.胚胎搜集和預(yù)處理4.胚胎移植以小鼠為例：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第33頁1.結(jié)扎公鼠制備為了取得同時(shí)發(fā)情假孕母鼠，要準(zhǔn)備結(jié)扎公鼠，通常選取5周齡公鼠做手術(shù)，分籠喂養(yǎng)，每籠一只。術(shù)后2～3周即完全康復(fù)，可用其生產(chǎn)假孕母鼠。目標(biāo)：為了產(chǎn)生同期發(fā)情母鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第34頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第35頁2.超數(shù)排卵腹腔注射PMSG10U，普通選擇在中午注射，間隔48小時(shí)后注射HCG，光照周期保持12～14h，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第36頁將注射HCG后母鼠與正常公鼠合籠，并于第二天早上檢驗(yàn)陰道栓，假如見栓說明已經(jīng)配上種了，計(jì)做懷孕0天。受體母鼠(普通發(fā)情母鼠)與結(jié)扎公鼠合籠，第二天早上檢驗(yàn)陰道栓，有栓母鼠可用于胚胎移植。3.同期發(fā)情實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第37頁計(jì)算時(shí)間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第38頁4.胚胎搜集和預(yù)處理（1）受精卵搜集和處理見栓當(dāng)日胚胎處于1細(xì)胞期。以脫頸椎法殺死母鼠，暴露子宮、輸卵管；剪下子宮、輸卵管，并置于平皿中；在滅菌平皿中剪下輸卵管置入盛有沖卵液集卵杯中，在體視顯微鏡下撕開壺腹部，釋放受精卵并用用新鮮培養(yǎng)液洗1–2次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第39頁用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第40頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第41頁（2）2～8細(xì)胞胚胎搜集交配后20–60小時(shí)，輸卵管中存在有2–8細(xì)胞期胚胎。此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)脫掉，可用1ml注射器自輸卵管傘口沖得胚胎。其基本步驟以下：取輸卵管，在體視顯微鏡下找到輸卵管傘口，傘口呈平截狀，周圍略顯粗糙。然后，用鑷子輕輕夾住傘口下部位，慢慢將沖卵針插入傘口，再用鑷子輕輕夾住針頭，推壓注射器，胚胎從另一端沖出。洗滌胚胎：搜集沖得胚胎，用新鮮培養(yǎng)液洗1–2次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)過程。沖卵實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第42頁（3）桑葚胚與囊胚搜集交配后60–72小時(shí)，一些致密8細(xì)胞胚胎已進(jìn)入子宮。而桑椹胚和囊胚搜集則一定要從子宮中取得。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第43頁5.胚胎移植（1）輸卵管移植依據(jù)胚胎數(shù)，確定供胚胎移植受體母鼠數(shù)，并做好手術(shù)準(zhǔn)備。手術(shù)切口位于兩側(cè)腰部距背正中線1cm處，左右各一個(gè)相互平行切口。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第44頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第45頁小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手術(shù)剪切開小鼠皮膚、肌肉、打開腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪墊，并用鑷子夾住脂肪組織，把卵巢、輸卵管和一部分子宮角慢慢拉出，經(jīng)過用紗布保護(hù)切口置于紗布上。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第46頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第47頁在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸收胚胎，次序?yàn)槭炗?、空氣?、培養(yǎng)液、空氣泡2、胚胎(盡可能少帶入培養(yǎng)液)?？諝馀?、培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第48頁（2）子宮移植麻醉、剪毛、消毒；背部近中線處，最終肋骨水平上，縱向切開皮膚、腹壁，在白色脂肪體上方開一小口剪開腹膜，用鈍鑷子夾住脂肪體，從切口拉出，繼之卵巢、輸卵管、子宮相繼被拉出，并小心地移入體視顯微鏡下。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第49頁用鈍鑷子輕輕夾往子宮上端，并用針頭其下子宮壁上扎1小孔。注意不要觸及血管。并確保針扎入子宮內(nèi)腔。輕輕拔出針頭，沿該孔將移植管插入約0.5cm，輕輕吹吸管，使培養(yǎng)液后面氣泡到達(dá)吸管末端。這時(shí)，全部胚胎就已移入子宮內(nèi)。子宮、卵巢、輸卵管推回腹腔，復(fù)位、縫合。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第50頁大動(dòng)物胚胎移植實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第51頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第52頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第53頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第54頁工程之二：胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)就是科學(xué)技術(shù)人員，在體外仿造類似于體內(nèi)條件環(huán)境，使胚胎在體外得到與在體內(nèi)一樣正常發(fā)育，這是胚胎工程研究與應(yīng)用中非常主要步驟。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第55頁胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)開始之前，對(duì)試驗(yàn)室和所用培養(yǎng)器具進(jìn)行徹底清洗、滅菌、去除可能殘余細(xì)胞毒性物質(zhì)。培養(yǎng)液組成，包含水、無機(jī)離子、有機(jī)成份、能源物質(zhì)、pH值、滲透壓等對(duì)胚胎發(fā)育都有很大影響。當(dāng)代培養(yǎng)液分為如Whitten氏液、Brinster液、BMOC－3和CZB液等簡(jiǎn)單培養(yǎng)液和TCM－199、CMRL1066、Ham氏液和DMEM液等復(fù)雜培養(yǎng)液兩類。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第56頁胚胎培養(yǎng)方法

即微滴培養(yǎng)法、輸卵管培養(yǎng)法和中間受體培養(yǎng)法。微滴培養(yǎng)法是利用塑料平皿制成50μl培養(yǎng)液小滴數(shù)個(gè)，每滴加入一定數(shù)量胚胎，在上面覆以滅菌且平衡好液體石蠟?；蛳葘⒁后w石蠟倒入平皿中，用注射器吸培養(yǎng)液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后將培養(yǎng)皿放到5％CO2、95％空氣飽和濕度37.5℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需要時(shí)間。假如更換培養(yǎng)液，應(yīng)在實(shí)體顯微鏡下，用注射器或口控微吸管將培養(yǎng)液吸出，并加入新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。輸卵管培養(yǎng)法取發(fā)情動(dòng)物輸卵管洗滌后，置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液面超出輸卵管，將同種或異種動(dòng)物胚胎自傘口注入輸卵管，進(jìn)行培養(yǎng)。中間受體培養(yǎng)法是指，操作后胚胎可將受精卵或早期胚胎移入同種或異種動(dòng)物胚胎，該方法沒有種屬特異性，但為了在培養(yǎng)后輕易找到胚胎和對(duì)胚胎保護(hù)，普通先用瓊脂包埋后再培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第57頁胚胎細(xì)胞計(jì)數(shù)法

即空氣干燥法和熒光染色法?？諝飧稍锓ㄊ菍⑴咛シ湃?％檸檬酸鈉溶液中低滲10－20分鐘，盡可能少帶液體，將胚胎吸到潔凈載片上，再用固定液固定?？諝飧稍锖螅?jīng)Giemsa染色、計(jì)數(shù)。熒光染色法能夠廣泛應(yīng)用于牛、羊、倉鼠、小鼠、兔子、豬等胚胎計(jì)數(shù)，慣用染料有Hoechest33342，復(fù)染液為用2.3％檸檬酸鈉配制0.1％或0.01％臺(tái)盼藍(lán)（TB）液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第58頁embryoonDay3ofcultureembryoonDay5ofculture實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第59頁工程之三：胚胎保留胚胎保留是指將胚胎在體內(nèi)或體外正常發(fā)育溫度下，暫時(shí)儲(chǔ)存起來而不使其失去活力；或者將其保留于低溫或超低溫情況下，使細(xì)胞處于新陳代謝和分裂速度減慢或停頓，即使其發(fā)育處于暫時(shí)停頓狀態(tài)，一旦恢復(fù)正常發(fā)育溫度時(shí)，又能再繼續(xù)發(fā)育。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第60頁（一）異種活體保留異種活體保留并不是任何一個(gè)動(dòng)物胚胎都能在另一個(gè)動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)存活。試驗(yàn)證實(shí)，家兔輸卵管比較適于其它動(dòng)物早期胚胎保留。（二）常溫保留常溫保留是指胚胎在15～25℃溫度下于培養(yǎng)液中保留。這種溫度下胚胎能保留24h，隨時(shí)間延長(zhǎng)活力下降，此方法只能做短暫保留和運(yùn)輸。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第61頁（三）低溫保留低溫保留是指0～5℃區(qū)域內(nèi)保留胚胎一個(gè)方法。此時(shí)，胚胎卵裂暫停，代謝速度顯著減慢，但還未停頓。這種方法使細(xì)胞一些成份尤其是酶處于不穩(wěn)定狀態(tài)，保留時(shí)間較短。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第62頁

（四）超低溫冷凍保留胚胎冷凍保留是采取特殊保護(hù)辦法和降溫程序，使胚胎在-196℃條件下停頓代謝，而升溫后又恢復(fù)活力一個(gè)長(zhǎng)久保留胚胎技術(shù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第63頁慣用工具：冷凍管實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第64頁方法：防止形成冰晶，破壞胚胎細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)1.慢速降溫法2.快速降溫法（1）三步法（2）兩步法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第65頁保護(hù)劑：甘油，1,2-丙二醇，二甲亞砜(DMSO)儀器（慢速冷凍）：大型凍存儀實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第66頁胚胎凍存意義：能夠使優(yōu)異品種品系(包含珍稀和瀕危動(dòng)物)種質(zhì)得到長(zhǎng)久保留下來，逐步地能夠?qū)⑸锝缛可蜷L(zhǎng)久保留起來，預(yù)防基因丟失。而且能夠隨時(shí)復(fù)蘇、繁殖品系動(dòng)物，在遺傳理論指導(dǎo)下，可改良品種和培育新品種及品系。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第67頁工程之四：胚胎分割因?yàn)榘l(fā)育早期胚胎細(xì)胞含有全能性，采取適當(dāng)方法把胚胎分成兩個(gè)或多個(gè)部分，每一部分都含有發(fā)育成完整個(gè)體能力，為胚胎中單個(gè)卵裂球全能性，培育遺傳型相同動(dòng)物做了初步探索。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第68頁1.概念:2.優(yōu)勢(shì):指借助顯微操作技術(shù)（采取機(jī)械方法）將早期胚胎切割成幾等份，再移植到代孕母子宮，產(chǎn)生同卵多仔后代技術(shù)。后代含有相同遺傳物質(zhì)?？沙杀对黾优咛?shù)量，能夠快速繁殖良種畜。3.特點(diǎn):4、選擇胚胎:發(fā)育良好,形態(tài)正常桑椹胚或囊胚.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第69頁（一）發(fā)展史年代胚胎細(xì)胞數(shù)動(dòng)物19042-細(xì)胞蛙類19302-細(xì)胞家兔19702-細(xì)胞小鼠19804-細(xì)胞、8-細(xì)胞綿羊

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第70頁（二）胚胎分割基本程序分割器具準(zhǔn)備胚胎預(yù)處理胚胎分割分割胚培養(yǎng)分割胚保留和移植體視顯微鏡倒置顯微鏡顯微操作儀桑椹胚之前胚胎分割桑椹胚和囊胚分割實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第71頁（二）胚胎切割技術(shù)

1.切割器具準(zhǔn)備

胚胎分割需要器械有體視顯微鏡，倒置顯微鏡和顯微操作儀。在進(jìn)行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割針，固定管要求末端鈍圓，外徑與所固定胚胎直徑相近，內(nèi)徑普通為20～30μm。切割針當(dāng)前有玻璃針和微刀兩種，玻璃針普通用實(shí)心玻璃拉成，微刀是用尖銳金屬刀片與微細(xì)玻璃棒粘在一起制成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第72頁2.胚胎預(yù)處理

為了降低切割損傷，胚胎在切割前普通用鏈霉蛋白酶進(jìn)行短時(shí)間處理，使透明帶軟化并變薄或去除透明帶。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第73頁3.胚胎分割

在進(jìn)行胚胎切割時(shí)，先將發(fā)育良好胚胎移入含有操作液滴培養(yǎng)皿中，操作液慣用杜氏磷酸緩沖液，然后在顯微鏡下用切割針或切割刀把胚胎一分為二。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第74頁

不一樣階段胚胎，切割方法略有差異：（１）桑椹胚之前胚胎這一階段胚胎因?yàn)槁蚜亚蜉^大，直接切割對(duì)卵裂球損傷較大。慣用方法是用微針切開透明帶，用微管吸收單個(gè)或部分卵裂球，放入另一空透明帶中，空透明帶通常來自未受精卵或退化胚胎。（２）桑椹胚和囊胚分割對(duì)于這一階段胚胎，通常采取直接切割法。操作時(shí)，用微針或微刀由胚胎正上方遲緩下降，輕壓透明帶以固定胚胎，然后繼續(xù)下切，直至胚胎一分為二，再把裸露半胚移入預(yù)先準(zhǔn)備好空透明帶中，或直接移植給受體。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第75頁4.分割胚培養(yǎng)

為提升半胚移植妊娠率和胚胎利用率，分割后半胚需放入空透明帶中或者用瓊脂包埋移入中間受體在體內(nèi)或直接在體外培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第76頁5.分割胚胎保留和移植

胚胎分割后能夠直接移植給受體，也能夠進(jìn)行超低溫冷凍保留。為提升冷凍胚胎移植后受胎率，分割胚胎需要在體內(nèi)或體外培養(yǎng)到桑椹或囊胚階段，再進(jìn)行冷凍。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第77頁（三）胚胎分割技術(shù)進(jìn)展

哺乳動(dòng)物胚胎分割技術(shù)在近20年取得了較大進(jìn)展，主要表現(xiàn)為操作方法趨于簡(jiǎn)化，效率提升。在牛胚胎移植生產(chǎn)中，胚胎分割已用于提升胚胎移植總受胎率和克服異性孿生不育。另外，胚胎分割取樣已用于胚胎性別判定和轉(zhuǎn)基因陽性胚胎早期選擇。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第78頁應(yīng)用：1.與核移植相結(jié)合，在試驗(yàn)動(dòng)物方面能夠培育出超純系動(dòng)物2.對(duì)小鼠、家兔、山羊等試驗(yàn)動(dòng)物胚胎分割后，能夠取得同卵孿生后代3.對(duì)瀕臨滅絕珍惜動(dòng)物也能夠采取這項(xiàng)新技術(shù)進(jìn)行搶救實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第79頁方法：1.用玻璃管拉成細(xì)絲，再制成切割刀，在顯微操作儀機(jī)械手上施行分割或分散胚胎。2.如條件較差，可徒手制成玻璃細(xì)絲，成為切割刀，在解剖鏡下徒手切割。顯微操作儀切割徒手切割實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第80頁四.胚胎分割當(dāng)前存在問題

1.初生重低2.遺傳一致性不一樣3.同卵多胎不足

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第81頁歸納小結(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第82頁工程之五：體外受精在試驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行體外受精，普通都著眼與基礎(chǔ)理論研究性質(zhì)，如為受精生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和繁殖學(xué)基礎(chǔ)研究提供試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｒ驗(yàn)槁炎雍途邮芫^程是在試驗(yàn)室中完成，故經(jīng)過這一技術(shù)而產(chǎn)下動(dòng)物又稱為“試管動(dòng)物”，如“試管鼠”、“試管豬”、“試管嬰兒”等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第83頁體外受精技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

動(dòng)物報(bào)道時(shí)間報(bào)道者兔小鼠大鼠人牛豬恒河猴狒狒綿羊山羊狨猴馬貓犬19591968197419781982198619841984198519851988199019701976ChangWhittinghamToyodaSteptoeBrackettChengBavisterBamaceda花田章花田章LopataZhangHammerMahi實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第84頁1、發(fā)展簡(jiǎn)史

1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞學(xué)者Austin分別發(fā)覺了精子獲能（capacitation）現(xiàn)象，使動(dòng)物體外受精研究進(jìn)入了新紀(jì)元。1959年張明覺在世界上首先取得了體外受精哺乳動(dòng)物—試管兔，推進(jìn)了體外受精研究工作開展。1978年首例人類試管嬰兒路易斯·布朗（LouiseBrown）誕生。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第85頁

直到20世紀(jì)80年代，動(dòng)物體外受精技術(shù)才取得突破，尤其是牛體外受精技術(shù)發(fā)展快速。1981年Brackett等用體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞取得試管牛犢，隨即Hanada等（1985）取得綿羊和山羊體外受精后代，并于1986年取得體外成熟卵母細(xì)胞體外受精第一頭犢牛。我國(guó)學(xué)者盧克煥（1987）在愛爾蘭取得全體外過程試管牛犢。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第86頁

（1）研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)理。

（2）在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效伎倆，對(duì)充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加緊品種改良速度等有主要價(jià)值。

（3）在人類，IVF技術(shù)是治療一些不孕癥和克服性連鎖病主要辦法之一。（4）體外受精技術(shù)還是哺乳動(dòng)物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等當(dāng)代生物技術(shù)不可缺乏組成部分。

2、體外受精意義實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第87頁試管小鼠(Whit-tingham，1968)大鼠(Toyoda和Chang，1974)嬰兒(Steptoe和Edwards，1978)牛(Brackett等，1982)山羊(Hamda，1985)綿羊(Hanada，1985)豬(Chang等，1986)牛（Parrish等，1986）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第88頁實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第89頁3、技術(shù)程序

體外受精包含以下步驟：卵母細(xì)胞采集和成熟培養(yǎng)、精子獲能、卵母細(xì)胞受精和受精后體外胚胎培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第90頁(一).卵母細(xì)胞采集和成熟培養(yǎng)對(duì)不一樣動(dòng)物,采集卵母細(xì)胞方法不一樣。試驗(yàn)動(dòng)物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等卵細(xì)胞采集：

最慣用方法是卵巢經(jīng)過

處理，詳細(xì)做法是給供體注射

，使一頭母畜一次排出比自然情況下多幾倍到十幾倍卵子，之后從

中沖取卵子，直接與獲能精子在體外受精。超數(shù)排卵促性腺激素輸卵管實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第91頁大家畜或大型動(dòng)物，如牛，卵細(xì)胞采集：

從屠宰場(chǎng)已屠宰母畜

中采集卵母細(xì)胞，也能夠借助

、

或

等工具確定卵泡位置，直接從活體動(dòng)物中吸收泡卵液（連同卵母細(xì)胞）取出，在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)，使其成熟。卵巢超聲波(B超)探測(cè)儀內(nèi)窺鏡腹腔鏡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第92頁卵母細(xì)胞普通檢測(cè)

得到卵母細(xì)胞后，可依據(jù)卵泡發(fā)育不一樣時(shí)期，在顯微鏡下檢驗(yàn)核和胞質(zhì)發(fā)育情況，如核形態(tài)、位置和所處時(shí)期。排出卵母細(xì)胞，有多層卵丘細(xì)胞包圍，除去卵丘細(xì)胞后，能夠見到卵周隙增大，內(nèi)有第一極體，核處于第二次成熟分裂中期。多數(shù)試驗(yàn)動(dòng)物卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈透明狀，但因?yàn)榘|(zhì)中富含大量脂滴和空泡，所以在鏡下呈暗色。各種不一樣動(dòng)物，按照不一樣分類標(biāo)準(zhǔn)，卵分類能夠分為優(yōu)異、普通、不良和異常卵。進(jìn)行體外受精卵母細(xì)胞，普通以卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體外面完整地包有3－4層卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)無斑塊者為佳。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第93頁鏡檢卵母細(xì)胞

假如新鮮或固定后要作整體觀察，能夠取凡士林石蠟（1：1）融化后滴于載片中部四角，在鏡下用微吸管自平皿中吸收卵母細(xì)胞，滴到4滴凡士林石蠟滴中央，蓋上蓋片并輕壓之，即可置于相差顯微鏡下觀察。假如要觀察細(xì)節(jié)，需要染色、切片后觀察。普通在卵固定后水洗染色，用瓊脂與石蠟進(jìn)行雙重包埋，最終進(jìn)行切片、脫臘和封固，進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第94頁1）培養(yǎng)液：用于卵母細(xì)胞體外成熟最為廣泛基礎(chǔ)培養(yǎng)液是M199。培養(yǎng)時(shí)尚要加入一定血清和激素。2）溫度和氣相：牛、豬、羊和馬等家畜卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)溫度普通為38～39℃。全部哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)氣相普通要求在含5％C02空氣和最大濕度環(huán)境。3）培養(yǎng)時(shí)間：牛和羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間普通為22～24h，而馬為30～36h，豬為40～44h。4）培養(yǎng)方法：卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)方法普通采取微滴法、封閉法和開放法三種。（二）、卵母細(xì)胞體外成熟（IVC）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第95頁4.成熟培養(yǎng)系統(tǒng)大致可分為三大類。

①開放培養(yǎng)系統(tǒng)：將1－2ml成熟培養(yǎng)液直接置于平面皿內(nèi)或五孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后放入50－200枚卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，上面不覆蓋石蠟油。②微滴培養(yǎng)系統(tǒng)：將成熟培養(yǎng)液先在組織培養(yǎng)皿中做成50－500μl微滴，上覆石蠟油，然后將卵母細(xì)胞置于其中培養(yǎng)。在普通情況下，這種培養(yǎng)液用在卵母細(xì)胞數(shù)量尤其少情況下采取。③密閉培養(yǎng)系統(tǒng)：將卵母細(xì)胞置于含有1－2ml成熟培養(yǎng)液試管中，加蓋膠塞，然后在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中培養(yǎng)；如若采取培養(yǎng)皿或微滴培養(yǎng)，則可將其裝入一個(gè)密閉塑料袋內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第96頁(三)精子獲能處理

哺乳動(dòng)物精子獲能方法有培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方法。1.精子獲取

精子起源比較方便，大、中型試驗(yàn)動(dòng)物，普通經(jīng)過人工按摩采精或假陰道采精，都能取得成熟精子，小型試驗(yàn)動(dòng)物都是經(jīng)過手術(shù)，從駐精囊和輸精管內(nèi)取得成熟精子。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第97頁2.精子分離與制備是體外受精技術(shù)中一個(gè)關(guān)鍵步驟精液中精子獲能抑制因子冷凍精液中防凍劑和蛋黃等成份

影響和干擾受精完成過多留在受精液中死精子

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第98頁①懸浮法（swimup）：是篩選高活力精子最為有效一個(gè)方法。②玻璃棉（glasswool）過濾法：該法可有效地濾除品質(zhì)較差精液中死精子，大提升精子受精穿透率。③BAS/哌可（Percoll）密度梯度離心法：采取不連續(xù)BSA密度梯度能夠分離得到形態(tài)正常高活力精子。④離心洗滌法：對(duì)于精子活力很好精液可采取直接離心洗滌法制備用于體外受精精子。精子制備方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第99頁3.精子獲能原理雌性動(dòng)物生殖道內(nèi)獲能因子中和精子表面去能因子精子質(zhì)膜膽固醇外流Ca2+進(jìn)入精子內(nèi)部膜通透性增加獲能完成

膜蛋白重新分布，膜穩(wěn)定性下降cAMP濃度升高激活腺苷酸環(huán)化酶抑制磷酸二酯酶實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第100頁當(dāng)前精子獲能處理方法主要有：

①與血清白蛋白溶液長(zhǎng)時(shí)間孵育：原理是血清中白蛋白含有很強(qiáng)結(jié)合膽固醇和鋅離子能力，可除去質(zhì)膜中部分膽固醇和鋅離子，改變精子質(zhì)膜穩(wěn)定性，造成精子獲能。②用高離子強(qiáng)度溶液處理精子：精子表面去能因子（被膜蛋白），當(dāng)用高離子強(qiáng)度溶液處理精子時(shí)，將從精子表面脫落，從而造成精子獲能。③與含有卵泡液培養(yǎng)液進(jìn)行孵育：在培養(yǎng)液中添加一定濃度卵泡液將有可能誘發(fā)精子獲能。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第101頁④使用鈣離子載體A23187：

直接誘發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部，提升細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而造成精子獲能。⑤使用肝素：是一個(gè)高度硫酸化氨基多糖類化合物，當(dāng)它與精子結(jié)合后，能引發(fā)Ca2+進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部而造成精子獲能。是一個(gè)靠近于體內(nèi)獲能生理性方法，已經(jīng)成為動(dòng)物體外受精應(yīng)用最廣一個(gè)精子獲能方法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第102頁精子入卵三道屏障：擴(kuò)展卵丘透明帶卵質(zhì)膜弱精、畸精、少精癥患者精子極難穿越三道屏障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第103頁人為使得精子獲能能夠利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。而雌性生殖道獲能沒有種屬特異性，因而能夠由屠宰場(chǎng)取任何動(dòng)物子宮或在試驗(yàn)室內(nèi)取小動(dòng)物子宮給所需動(dòng)物精子獲能。另外，能夠利用人工配制培養(yǎng)液使得精子獲能。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第104頁（3）.受精獲能精子和培養(yǎng)成熟卵子，普通情況下在或中完成受精過程。獲能溶液專用受精溶液實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程第105頁（4）、胚胎早期培養(yǎng)概念：是應(yīng)用人工創(chuàng)造