免疫組織化學(xué)技術(shù)課件

免疫組織化學(xué)技術(shù)Immunohistochemistry,IHCImmunocytochemistry,

ICC基本原理

利用免疫學(xué)中抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)以及組織化學(xué)的原理，在組織或細(xì)胞標(biāo)本中加入特定的標(biāo)記抗體，然后對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行顯示，從而對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進(jìn)行定性、定位或定量研究。免疫酶技術(shù)顯示Caspase-3免疫熒光技術(shù)顯示MOR抗原：可被T、B細(xì)胞識(shí)別，并啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。即抗原可作用于T、B細(xì)胞的抗原識(shí)別受體，促使其增殖、分化，產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）并與之結(jié)合，從而發(fā)揮免疫效應(yīng)?？乖膬煞N特性：免疫原性：即能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體或致敏T細(xì)胞）；抗原性：指能與其所誘生的抗體或致敏T細(xì)胞特異性結(jié)合。完全抗原：同時(shí)具備免疫原性和抗原性半抗原：只具備抗原性而不具備免疫原性影響免疫原性的因素：1.理化特性（大分子蛋白質(zhì)可含有大量不同的抗原決定簇，是強(qiáng)免疫原；多糖是重要的天然抗原，如細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖、血型抗原；核酸多無免疫原性，但與蛋白結(jié)合形成核蛋白則有免疫原性；多肽類激素如胰島素也有免疫原性）、分子量（抗原的分子量一般≥10kD，且分子量越大，免疫原性越強(qiáng)）、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（免疫原性物質(zhì)還須具備復(fù)雜的化學(xué)組成與特殊的化學(xué)基團(tuán)，如含大量芳香族氨基酸）、分子構(gòu)象和抗原決定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：異種性（“非已”－－異種、同種異體、自體抗原－－抗原來源與宿主關(guān)系越遠(yuǎn)，免疫原性越強(qiáng)）、遺傳因素（個(gè)體差異）、年齡、性別與健康狀態(tài)。3.抗原進(jìn)入機(jī)體的方式：抗原的劑量（低劑量和高劑量都不易引起免疫應(yīng)答）、進(jìn)入機(jī)體的途徑（皮內(nèi)＞皮下＞肌肉＞腹腔＞靜脈）、免疫次數(shù)（強(qiáng)的免疫應(yīng)答需要多次注射）、佐劑（可先于抗原或同時(shí)與抗原混合注射動(dòng)物，以增強(qiáng)抗原的免疫原性，即起輔佐抗原作用的物質(zhì)，如弗氏佐劑）。

抗體（antibody,Ab）機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細(xì)胞——漿細(xì)胞合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由兩條相同的重鏈（heavychain,H）和兩條相同的輕鏈（lightchain,L）借二硫鍵連接而成。在氨基端，重鏈的1/4和輕鏈的1/2氨基酸序列變化很大，為可變區(qū)（variableregion,V）；其他部分氨基酸序列相對(duì)恒定，為恒定區(qū)（constantregion,C）。Fab即抗原結(jié)合片段（fragmentantigenbinding），由一條完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1）組成。該片段具有單價(jià)抗體活性，能與一個(gè)相應(yīng)的抗原決定族特異性結(jié)合。Fc即可結(jié)晶片段（fragmentcrystalline），F(xiàn)c段含有兩條重鏈C端的一半，包含CH2和CH3兩個(gè)功能區(qū)，它無抗體活性。Ig在異種間免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同時(shí)Fc段還具有活化補(bǔ)體、親細(xì)胞、通過胎盤和介導(dǎo)與細(xì)菌蛋白結(jié)合等生物學(xué)活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可將其裂解為兩個(gè)完全相同的Fab和一個(gè)Fc片段。由單一克隆B細(xì)胞雜交骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，只識(shí)別一種抗原表位的具有高度特異性的抗體。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、易大量制備。制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得針對(duì)單一表位的漿細(xì)胞克隆，使其在體外擴(kuò)增并分泌抗體。但漿細(xì)胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。于是，將可產(chǎn)生特異性抗體但短壽的漿細(xì)胞與無抗原特異性但長(zhǎng)壽的惡性漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，建立了可產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)。

單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）免疫組織化學(xué)方法熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)酶聯(lián)免疫組織化學(xué)直接法：用酶或其他標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉積在抗原抗體反應(yīng)的部位，即可對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位以至定量研究。TissueAntigenLabeledAntibody酶聯(lián)免疫組織化學(xué)ABC法S-P法親合素–生物素–過氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,ABC法）1.生物素與親合素有很高的親和力2.一個(gè)親合素分子上有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)3.將親合素作為“橋”將生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶連接起來，使抗原與抗體反應(yīng)信號(hào)放大，以增強(qiáng)敏感性鏈霉親合素–生物素–過氧化物酶復(fù)合物法（streptavidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,SABC法）

此法為上述ABC法的改良，是用鏈霉親合素（streptavidin）代替ABC法中的親合素（avidin）Streptavidin鏈霉親合素avidin親合素鏈霉親合素為蛋白質(zhì)，非糖蛋白，不與其它分子結(jié)合，可降低背景。親合素是糖蛋白，含有約7%的糖類，可與組織中含糖基的物質(zhì)起反應(yīng)，造成背景著色。免疫組織化學(xué)酶類標(biāo)記物滿足條件：酶催化底物必須是特異的，并容易被顯示（產(chǎn)物易于鏡下觀察）；酶反應(yīng)形成的終產(chǎn)物必須是穩(wěn)定的沉淀，不能從酶活性部位向周圍組織彌散；容易獲取（純）；中性pH值時(shí)，具有穩(wěn)定性；酶標(biāo)記至抗體上不影響酶和抗體的活性。常用酶類標(biāo)記物辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）H2O2和DAB（diaminobenzidine,

二氨基聯(lián)苯胺）為其常用底物，產(chǎn)物為穩(wěn)定的棕黃色沉淀堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）：BCIP

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽)和NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四唑氮藍(lán)）是AP的常用底物組合，其中，NBT作為氧化劑,BCIP作為AP底物。BCIPBCIP被AP水解成一種藍(lán)色的中間物，后者然后被NBT氧化形成二聚體（不溶性紫藍(lán)色沉淀）。免疫組織化學(xué)技術(shù)的基本要求1、有高度特異性；2、有高度敏感性；3、不引起受檢物質(zhì)的移位和丟失；4、不影響抗原和抗體的免疫活性；5、不損傷組織和細(xì)胞的本來結(jié)構(gòu)；6、免疫結(jié)合物借標(biāo)記物明顯可見免疫組織化學(xué)標(biāo)本的制備一、組織的固定

1、目的：固定抗原的定位保存組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

2、常用固定劑和固定液：甲醛、多聚甲醛、戊二醛等

3、作用和缺點(diǎn)：固定組織和保存抗原抗原易被掩蓋三、組織包埋和切片（一）石蠟包埋切片（二）恒冷箱切片

（一）石蠟包埋切片（二）恒冷箱切片：防冰晶

1、驟凍

2、10?30%蔗糖溶液異戊烷干冰組織塊冰凍切片包埋模具配套O.C.T包埋劑使用

染色程序:

組織采用石蠟切片或恒冷箱切片,片厚5～10m或者10～

15m

。

若石蠟切片則脫蠟到水

1、PBS漂洗,10min；染色程序:

2、10%NSS（或者3%BSA）,30min；

3、1%TritonX-100,3%H2O2處理，30min;4、

兔抗血清孵育過夜；

4、PBS漂洗,35min；

5、生物素化羊抗兔IgG

孵育,60min；

6、PBS漂洗，35min；載玻片標(biāo)簽組織切片生物素化二抗生物素染色程序:7、ABC復(fù)合物孵育,60min；8、PBS漂洗,35min；9、DAB?H2O2顯色液顯色，至深棕色為止，約5～10min；（DAB?H2O2臨用前配制）ABC標(biāo)簽組織切片ABC染色程序:10、先后經(jīng)自來水沖洗和雙蒸水浸洗；11、常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。染色結(jié)果：鏡下觀察。陰性對(duì)照試驗(yàn)：

1、常用空白試驗(yàn)：即用稀釋一抗的稀釋液，如10% NSS等，或PBS替代一抗，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；2、替代試驗(yàn)：正常兔血清或正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反應(yīng)應(yīng)呈陰性；3、吸附試驗(yàn)：一抗血清經(jīng)相應(yīng)抗原預(yù)吸附處理后孵育組織切片，反應(yīng)應(yīng)呈陰性。切片載玻片的清潔：

切片粘合劑的使用：

（1）多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度涂片。

（2）APES干凈載玻片→丙酮5min→用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml+50ml丙酮）1～3次→純丙酮洗二次→干燥玻片(37℃過夜)→用鋁箔包好，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。?）鉻礬明膠液：鉻礬0.5g明膠5gH2O1000ml

細(xì)胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0度保存。細(xì)胞涂片制作離心將細(xì)胞收集出來，用預(yù)冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS將細(xì)胞重懸。吸取30－50ul（可根據(jù)細(xì)胞量調(diào)整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風(fēng)干以后加4％多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞，固定2－4小時(shí)。在細(xì)胞上加一層甘油放-20℃保存。細(xì)胞離心涂片機(jī)是利用液動(dòng)與氣動(dòng)原理,將收集的細(xì)胞樣本進(jìn)行了細(xì)胞分散,過濾從其混懸液中分離出來,均勻的噴涂在玻片上?？乖迯?fù)免疫組織化學(xué)方法成功與否關(guān)鍵在于抗原決定簇的保存和暴露。組織經(jīng)甲醛固定，甲醛的醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)，使抗原決定簇被掩蓋，從而影響對(duì)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。要充分暴露抗原決定簇，通常用到抗原修復(fù)。加熱抗原修復(fù)法酶消化法高壓加熱修復(fù)法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，連同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4min;

⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。電爐加熱修復(fù)法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，當(dāng)達(dá)92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時(shí)，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10min左右;

⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

Steamingtemperaturebetween95oC-98oCwhichisoptimalformostofantigens.settheTimerfor40minutesthatissufficientforretrievingmostantigens(someantigensneedlongersteamingtimesooptimalsteamingtimeshouldbedeterminedbyuser).

IHC-TekTMEpitopeRetrievalSteamerSet

微波修復(fù)法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理10min;

③蒸餾水洗;

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10min;

⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。

Heat-inducedEpitopeRetrieval(HIER)HIERisbelievedtoreversesomecross-linksandallowsforrestorationofsecondaryortertiarystructureoftheepitope.Theprotocolmustbeoptimizedforeachtissue,fixationmethod,andantigentobestudied.Ingeneral,HIERhasamuchhighersuccessratethanPIER.HIERisperformedusingmicrowaveovens,pressurecookers,vegetablesteamers,autoclaves,orwaterbaths.MicrowavesareanincreasinglypopularapplianceforHIER.Theseprotocolstendtoinvolve5minuteperiodsofheatfollowedbyreplacementofthebuffer.ForallHIERmethods,slidesmustbecooledbeforecommencingIHC/ICCincubations.HIERisespeciallytime-,temperature-,buffer-,andpH-sensitive,andthebestmethodmustbedeterminedempirically.R&DSystemsoffersreagentstoimprovetissueantigendetectionandenhanceimmunoreactivity.Duringinitialoptimization,investigatorscancomparesamplestreatedwithneutralpH7.0UniversalAntigenRetrievalSolution(Catalog#CTS015)withaslideofthesametissuewithoutantigenretrieval.Subsequenttestsusingacidicorbasicantigenretrievalsolutionsmaybenecessarydependingonthetissue.AtR&DSystems,wefindthattreatmentwithBasicAntigenRetrievalreagent(pH9.5,Catalog#CTS013)isfrequentlysuccessful.WealsoofferAcidic(pH5.0,

Catalog#CTS014)andSampler(Catalog#CTS016)AntigenRetrievalReagents.Acidicandbasicantigenretrievalsolutionsaremorelikelytoaffecttissuemorphologythananeutralsolution.Thetime,temperature,andpHmustalsobeoptimizedforeachappliance(i.e.5-10minutesat92-95°Cinawaterbath,versus1-5minutesat120°Cinapressurecooker).胃蛋白酶消化法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④PBS洗3次;

⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20min左右;

⑥PBS沖洗3次;

⑦按選擇好的免疫組化該法進(jìn)行染色。

Protease-inducedEpitopeRetrieval(PIER)InthePIERmethod,enzymesincludingProteinaseK,Trypsin,andPepsinhavebeenusedsuccessfullytorestorethebindingofanantibodytoitsepitope.Themechanismofactionisthoughttobethecleavageofpeptidesthatmaybemaskingtheepitope.ThedisadvantagesofPIERarethelowsuccessrateforrestoringimmunoreactivityandthepotentialfordestroyingbothtissuemorphologyandtheantigenofinterest.胰蛋白酶消化法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④PBS洗3次;

⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20min左右;

⑥PBS洗3次;

⑦按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

注意事項(xiàng)一、抗體的保存

濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在4℃冰箱內(nèi)，保存時(shí)間可達(dá)1-3年。即用型抗體：理論上在4℃冰箱內(nèi)可保存半年左右。

PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般只可放置1-2個(gè)月。二、出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因

組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作為判斷陽(yáng)性的依據(jù)。出血和壞死：紅細(xì)胞的內(nèi)源性過氧化物酶，壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性過氧化物酶均可出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)?？贵w的交叉反應(yīng)。三、出現(xiàn)假陰性的原因

固定時(shí)間過長(zhǎng)，浸蠟、烤片溫度過高，導(dǎo)致抗原丟失，無法補(bǔ)救。固定液不合適或濃度不對(duì)，導(dǎo)致固定不佳。最好使用10%中性福爾馬林?？贵w濃度過低。孵育時(shí)間太短，或孵育溫度太低。緩沖液pH值不正確。四、必須嚴(yán)格設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。五、DAB有致癌性，用后不應(yīng)隨處倒棄。1.Antigenretrieval

ProteolyticenzymemethodandHeat-inducedmethod2.Inhibitionofendogenoustissuecomponents

3%H2O2,0.01%avidin3.Blockingofnonspecificsites10%normalserum

pretreatmentPositiveControlItistotestforaprotocolorprocedureused.Itwillbeidealtousethetissueofknownpositiveasacontrol.

NegativeControl

Itistotestforthespecificityoftheantibodyinvolved.

Controls

Example1.Prepareandfixtissue2.Antigenretrieval3.Suppressendogenousperoxidaseactivity4.Blocknonspecificsitesinthetissues5.Incubatethetissueswiththeprimaryantibody6.Incubatethetissueswiththesecondaryantibody7.IncubatethetissueswithSP8.AddDABandincubateuntildesiredstainingisachieved

Troubleshooting1.WeakorNo

Staining

2.Over-staining

3.HighBackground

WeakorNoStaining

Sources

Solutions

InadequatedeparaffinizationDeparaffinizesectionslongerorchangefreshxyleneInactiveprimaryantibodiesReplacewithanewbatchofantibodiesAntibodiesdonotworkduetoimproperstorageAliquotantibodiesintosmallervolumesandstoreinfreezer(-20to-70℃)andavoidrepeatedfreezeandthawcycles.AntibodyconcentrationwastoolowIncreasetheconcentrationofantibodies.OrrunaserialdilutiontesttodeterminetheoptimaldilutionthatgivesthebestsignaltonoiseratioInadequateantibodyincubationtimeIncreaseantibodyincubationtimeInadequateorimpropertissuefixationIncreasedurationofpostfixationortrydifferentfixativesWeakorNoStaining

Sources

Solutions

TissueoverfixationReducethedurationofpostfixationorperformanappropriateantigenretrievalprocedureIncompatiblesecondaryandprimaryantibodiesUsesecondaryantibodythatwillinteractwithprimaryantibody.InactivesecondaryantibodyorotherreagentsReplacewithanewbatchofreagentsInadequatesubstrateincubationtimeIncreasethesubstrateincubationtimeIncorrectmountingmediumChooseacorrectmountingmediumReagentsappliedinwrongorderorstepsomittedChecknotesorprocedureusedOver-staining

Sources

Solutions

TheconcentrationofantibodieswastoohighReduceantibodyconcentrationorperformatitrationtodeterminetheoptimaldilutionforprimaryandsecondaryantibodiesIncubationtimewastoolongReduceincubationtimeIncubationtemperaturewastoohighReduceincubationtemperatureSubstrateincubation

timewastoolongReducesubstrateincubationtimeSectionsdriedoutAvoidsectionsbeingdriedoutHighBackground

SourcesSolutions

InadequatewashingofsectionsWashatleast3timesbetweenstepsTissuecontainsendogenousenzymeBlockendogenousenzymeactivitiesTissuecontainsendogenousbiotinactivityBlockendogenousbiotinactivityusingtheavidin/biotinblockingreagentpriortoincubationofprimaryantibodies.Non-specificbindingofprimaryantibodiestotissueorhighantibodyconcentrationNon-specificbinding

maybereducedbyusinghigherdilutionofprimaryantibodies

Non-specificbindingofsecondaryantibodiestotissueTreattissuewithnormalserumblockfromthesamespeciesassecondaryantibodiesDiffusionoftissueantigenduetoinadequatefixationIncreasedurationofpostfixation免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)將熒光作為標(biāo)記物的免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光（fluorescence）當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光（通常波長(zhǎng)在可見光波段）；而