分子生物學(xué)第章分子生物學(xué)研究方法下

6.1基因表達(dá)研究技術(shù)6.1.1基因表達(dá)系列分析技術(shù)6.1.2RNA的選擇性剪切技術(shù)6.1.3原位雜交技術(shù)6.1.4基因定點(diǎn)突變技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)SAGE是以DNA序列測定為基礎(chǔ)定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)。任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標(biāo)簽數(shù)的比例可分析所對應(yīng)基因的表達(dá)頻率。6.1.1基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE）常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)

—標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。

—原理與ShortSAGE方法類似，只是用了不同的IIS類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程序做了相應(yīng)修改。LongSAGE技術(shù)：6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。類型：平衡剪切、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個基因是否存在選擇性剪切。6.1.2RNA的選擇性剪接技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)選擇性剪切的不同類型RT-PCR檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)果蠅Dscam基因可以通過可變剪接產(chǎn)生38000多種可能的mRNA異構(gòu)體6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)原位雜交（ISH）是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的一種手段。分為RNA和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達(dá)產(chǎn)物做出定性定量分析。6.1.3原位雜交技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)mRNA的互補(bǔ)鏈，雜交信號集中于纖維細(xì)胞中。負(fù)對照，mRNA的同義鏈,無雜交信號正對照，UBQ10雜交信號遍布于整個胚珠6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)熒光原位雜交（FISH）首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。6.1.4基因定點(diǎn)突變技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)大引物誘變法示意圖6.1基因表達(dá)研究技術(shù)目前十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.2.基因敲除技術(shù)（geneknock-out）通過一定的途徑使特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用同源片段替代靶基因片段，進(jìn)行精確的定位修飾和基因改造，同染色體一起穩(wěn)定遺傳。6.2.1基本原理6.2.2高等動物基因敲出技術(shù)6.2.3植物基因敲出技術(shù)6.2基因敲除技術(shù)目前十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)經(jīng)典遺傳學(xué)（Forwardgenetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列。現(xiàn)代遺傳學(xué)（Reversegenetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。基因敲除（geneknock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。6.2.1基本原理6.2基因敲除技術(shù)目前十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)基因敲除分兩種：

完全基因敲除、條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動物個體中的靶基因活性。條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。6.2基因敲除技術(shù)目前十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)用取代型（a）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲除實驗6.2基因敲除技術(shù)目前十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞6.2基因敲除技術(shù)目前十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。6.2.2高等動物基因敲出技術(shù)6.2基因敲除技術(shù)目前二十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)模式動物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。6.2基因敲除技術(shù)21目前二十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將一段帶有報告基因的DNA序列標(biāo)簽整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。6.2.3植物基因敲出技術(shù)6.2基因敲除技術(shù)目前二十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)植物基因敲除突變體植株篩選a.引物設(shè)計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物，目的基因片段(設(shè)為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。

b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。6.2基因敲除技術(shù)目前二十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)6.3.3體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)6.3.4細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究6.3.5RNAi技術(shù)及其應(yīng)用6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前二十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)酵母單雜交系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)。特點(diǎn)：可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。

該體系也是分析鑒定細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前二十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)①將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（Pmin）的上游，把報告基因連接到Pmin下游。②將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動子，使報告基因得到表達(dá)。酵母單雜交的基本原理：6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前二十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)

酵母單雜交的基本原理示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前二十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前二十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨(dú)的BD能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄；而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前二十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)

酵母雙雜交的基本原理示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株b.研究的獵物(或稱靶蛋白)蛋白的基因與編碼AD的序列結(jié)合c.誘餌(bait)蛋白的基因與編碼BD的序列結(jié)合,形成兩段融合基因d.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于選擇培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白（激活報告基因表達(dá)）的陽性菌落。酵母雙雜交主要實驗過程：6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用：發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能研究抗原和抗體的作用（細(xì)胞內(nèi)）篩選藥物的作用位點(diǎn)建立基因組蛋白連鎖圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.3.3體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)FarWestern印跡技術(shù)GST融合蛋白沉降技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等離子表面共振技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)FarWestern印跡技術(shù)用32P標(biāo)記的體外表達(dá)蛋白作探針,直接檢測與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達(dá)該蛋白的cDNA。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。GST融合蛋白沉降技術(shù)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)GST融合蛋白沉降技術(shù)目前三十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點(diǎn)檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點(diǎn)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前三十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)蛋白質(zhì)芯片的制備目前三十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米級厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。等離子表面共振技術(shù)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)該技術(shù)不需要標(biāo)志物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)是需要專門的儀器。目前三十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)等離子表面共振技術(shù)示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前四十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。免疫共沉淀技術(shù)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前四十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)免疫共沉淀示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前四十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：①給體與受體在合適的距離（1～10nm）；②給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定

的重疊（這是能量匹配的條件）；③給體與受體的偶極具有一定的空間取向

（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。6.3.4細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究——

熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前四十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A與B不發(fā)生相互作用時，其相對距離較大，無FRET現(xiàn)象；而蛋白質(zhì)A與Ｂ發(fā)生相互作用時，其相對距離較小，發(fā)生FRET。目前四十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)RNAi技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名來源于安德魯·法爾1998年在《自然》雜志上的論文。研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經(jīng)過Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的外源雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效定位目標(biāo)mRNA。6.3.5RNAi（RNA干涉）技術(shù)及其應(yīng)用6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前四十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介。siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5’端磷酸基團(tuán)和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核糖體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)目前四十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)RNAi作用機(jī)制示意圖目前四十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析6.4.1基因芯片技術(shù)原理6.4.2基因芯片的點(diǎn)制過程6.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前四十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)基因芯片（DNAchip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的實驗手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。6.4.1基因芯片技術(shù)原理6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前四十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)基因芯片技術(shù)流程圖6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.4.2基因芯片的點(diǎn)制過程簡易基因芯片

大規(guī)?；蛐酒?/p>

微珠芯片技術(shù)6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)簡易基因芯片使用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化。也可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達(dá)模式。6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)基因芯片可用于進(jìn)行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號圖，用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，確定哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。6.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)可靠性分析

生物學(xué)意義分析——差異表達(dá)的生物學(xué)意義6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.5利用酵母鑒定靶基因的功能6.5.1酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與形狀互補(bǔ)6.5.3外援基因在酵母中的功能鑒定6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.5.1酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡介具有和動植物細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)特征和細(xì)胞生長

發(fā)育過程；很多基因在酵母和動植物細(xì)胞中高度保守；容易進(jìn)行生物化學(xué)與分子生物學(xué)操作；具有快速生長、無性繁殖、簡便的平板影印能力；酵母是最早完成基因組DNA全序列測定的單細(xì)胞

真核生物，有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞；酵母單倍體和二倍體細(xì)胞在形態(tài)上有相似性，但

存在重大差異：

①二倍體細(xì)胞的直徑大約是單倍體的1.3倍；②二倍體細(xì)胞呈長形或卵圓形，單倍體接近圓形；③二倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞的出芽方式不同。6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與形狀互補(bǔ)利用整合型質(zhì)?？梢詫湍富蚪M中的任意

基因進(jìn)行精確的敲除（置換），并通過孢子

繁殖中的四分體分析技術(shù)進(jìn)行觀測和研究。基因置換一般在二倍體中進(jìn)行；基因置換方法有兩種：

一步置換法

二步置換法6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)6.5.3外援基因在酵母中的功能鑒定將外源基因克隆于酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化

野生型或突變酵母菌株，通過觀察酵母的

表型變化或分析細(xì)胞中化學(xué)成分的變化，

推測該基因的生物學(xué)功能。因為酵母細(xì)胞中有與動植物細(xì)胞比較接近

的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，許多在大腸桿

菌中不產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)的動植物基因在酵

母中表達(dá)后往往具有生物學(xué)功能。6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點(diǎn)目前五十八頁\總數(shù)六十三頁\編