第一代測序技術(shù)2

第一代測序技術(shù)演示文稿目前一頁\總數(shù)三十八頁\編于四點（優(yōu)選）第一代測序技術(shù)目前二頁\總數(shù)三十八頁\編于四點目錄第一代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)（Illumina測序儀，SOLiD測序儀，454基因組測，IonTorrent測序）第三代測序技術(shù)高通量測序技術(shù)目前三頁\總數(shù)三十八頁\編于四點第一代測序技術(shù)的發(fā)明人利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止測定DNA核苷酸序列的方法。是英國劍橋分子生物學(xué)實驗室的生物化學(xué)家FredSanger及其同事在1997年發(fā)明的。目前四頁\總數(shù)三十八頁\編于四點第一代測序技術(shù)傳統(tǒng)的鏈終止法，化學(xué)講解法，以及在它們的基礎(chǔ)上來的各種DNA測序技術(shù)傳統(tǒng)成為第一代DNA測序技術(shù)。目前五頁\總數(shù)三十八頁\編于四點目前六頁\總數(shù)三十八頁\編于四點原理第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相同位置上退火，然后該寡聚核苷酸就充當引物來合成與模板互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3－OH基團，所以可被用作鏈終止試劑）通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組（如下圖）進行，每一組分別用四種ddNTP（雙脫氧核苷酸）中的一種來進行終止，再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。目前七頁\總數(shù)三十八頁\編于四點這有四組試劑，第一組含有A,T,C三種脫氧核苷酸，G這一種雙脫氧核苷酸目前八頁\總數(shù)三十八頁\編于四點測序是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。Sanger法測序的原理就是，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之擴增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。目前九頁\總數(shù)三十八頁\編于四點每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾個至千以上個，相差一個堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。目前十頁\總數(shù)三十八頁\編于四點目前十一頁\總數(shù)三十八頁\編于四點應(yīng)用目前十二頁\總數(shù)三十八頁\編于四點具有代表性的新一代DNA測序儀大規(guī)模平行測序平臺（massivelyparallelDNAsequencingplatform）的出現(xiàn)不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權(quán)”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測序技術(shù)有助于人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項數(shù)據(jù)最近市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀產(chǎn)品，例如美國RocheAppliedScience公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexatechnology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀、美國AppliedBiosystems公司的SOLiD測序儀、Dover/Harvard公司的Polonator測序儀以及美國Helicos公司的HeliScope單分子測序儀。所有這些新型測序儀都使用了一種新的測序策略——循環(huán)芯片測序法（cyclic-arraysequencing），也可將其稱為“新一代測序技術(shù)或者第二代測序技術(shù)”。目前十三頁\總數(shù)三十八頁\編于四點循環(huán)芯片測序法所謂的循環(huán)芯片測序法，簡言之就是對布滿DNA樣品的芯片重復(fù)進行基于DNA的聚合酶反應(yīng)（模板變性、引物退火雜交及延伸）以及熒光序列讀取反應(yīng)。與傳統(tǒng)測序法相比，循環(huán)芯片測序法具有操作更簡易、費用更低廉的優(yōu)勢，于是很快就獲得了廣泛的應(yīng)用。目前十四頁\總數(shù)三十八頁\編于四點目前十五頁\總數(shù)三十八頁\編于四點雖然這些新一代測序儀以及芯片的實際制作過程似乎都和傳統(tǒng)的測序方法有很大的不同，而且各有特點，但實際上它們背后的原理和技術(shù)都是非常相似甚至是相同的（圖1b）。新一代測序法首先也是將基因組DNA隨機切割成小片段DNA分子，然后在體外給這些小片段分子的末端連接上接頭制成文庫，也可以使用配對標簽（mate-pairedtag）制成跨步文庫（jumpinglibraries）。隨后可以通過原位polony（insitupolony，小詞典1）、微乳液PCR（emulsionPCR）或橋式PCR（bridgePCR）（圖5）等方法獲得測序模板。目前十六頁\總數(shù)三十八頁\編于四點上述方法有一個共同點，那就是任何一個小片段DNA分子的PCR擴增產(chǎn)物都是在空間上聚集的：原位polony法和橋式PCR法中所有的產(chǎn)物都集中在平板的某處，在微乳液PCR法（emulsionPCR）中所有的產(chǎn)物都集中在微珠的表面。真正的測序反應(yīng)本身和傳統(tǒng)測序法一樣，是由重復(fù)的聚合酶促反應(yīng)和最后的熒光讀取分析反應(yīng)組成（圖6）。本文討論的所有測序儀都是使用合成測序法（sequencingbysynthesis），即通過聚合酶或連接酶不斷地延伸引物獲得模板序列，最后對每一輪反應(yīng)的結(jié)果進行熒光圖像采集、分析，獲得序列結(jié)果。目前十七頁\總數(shù)三十八頁\編于四點以Illumina測序儀說明二代測序的一般流程（1）文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核苷酸黏性末端。然后將Illumina測序接頭與片段連接。（2）簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測序循環(huán)。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴增使用。通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。（3）測序，分三步：DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標記簇成像，在下一個循環(huán)開始前將結(jié)合的核苷酸剪切并分解。（4）數(shù)據(jù)分析.目前十八頁\總數(shù)三十八頁\編于四點IonTorrent測序IonTorrent個人化操作基因組測序儀（PGMTM）是第一臺基于半導(dǎo)體技術(shù)的測序儀。與其他測序技術(shù)相比，使用該項技術(shù)的測序系統(tǒng)更簡單、更快速、及更易升級。該測序儀與其他高通量測序儀特征互補，可以迅速完成應(yīng)急服務(wù)項目，縮短服務(wù)周期，增加服務(wù)效率。主要應(yīng)用領(lǐng)域：擴增子測序，RNA單鏈測序，基因組及宏基因組測序測序目前十九頁\總數(shù)三十八頁\編于四點IonTorrent測序原理鳥槍法建庫基于油包水PCR的微珠模板擴增微珠加上測序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微傳感器的測序芯片在測序芯片表面，分次分別流過４種dNTP，微珠表面的核酸進行邊合成邊測序的反應(yīng)。每次發(fā)生聚合反應(yīng)，釋放出H+離子，微珠周圍微環(huán)境中的PH值發(fā)生改變。微電極檢測PH值的改變，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的堿基信號，最后得到DNA序列目前二十頁\總數(shù)三十八頁\編于四點Roche454的測序原理鳥槍法建庫基于油包水PCR的微珠模板擴增微珠加上測序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微傳感器的測序芯片在測序芯片表面，分次分別流過４種dNTP，微珠表面的核酸進行邊合成邊測序的反應(yīng)。每次發(fā)生聚合反應(yīng)，釋放出焦磷酸焦磷酸被焦磷酸酶水解，釋放出光子光通過光纖被傳遞到光探頭光信號被轉(zhuǎn)換成堿基信息，得到DNA序列。目前二十一頁\總數(shù)三十八頁\編于四點SOLiD測序SOLiD使用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時校正測序錯誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點。目前二十二頁\總數(shù)三十八頁\編于四點SoLID測序原理鳥槍法建庫油包水PCR，得到長了DNA片段的珠子珠子放到測序芯片上加入4種熒光色的寡聚物探針進行雜交，探針上有2個位置的堿基是特定的，別的位置是簡并的堿基加入連接本酶，把能夠雜上的寡聚物連到測序引物上洗掉過量的探針目前二十三頁\總數(shù)三十八頁\編于四點激光掃描看熒光重復(fù)4~7步驟，得到延長36~50個堿基的長度洗掉第一次的測序延長鏈錯位加入熒光探針，重復(fù)4~8的過程把錯位的熒光信號排列組合，得到DNA序列目前二十四頁\總數(shù)三十八頁\編于四點應(yīng)用目前二十五頁\總數(shù)三十八頁\編于四點目前二十六頁\總數(shù)三十八頁\編于四點高通量測序高通量測序技術(shù)（High-throughputsequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation"sequencingtechnology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序（MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)、聚合酶克?。≒olonySequencing）、454焦磷酸測序（454pyrosequencing）、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiDsequencing、離子半導(dǎo)體測序（Ionsemiconductorsequencing）、DNA納米球測序（DNAnanoballsequencing）等。目前二十七頁\總數(shù)三十八頁\編于四點高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。目前二十八頁\總數(shù)三十八頁\編于四點實驗過程1.樣本準備（samplefragmentation）2.文庫構(gòu)建(librarypreparation)3.測序反應(yīng)(sequencingreaction)4.數(shù)據(jù)分析(dataanalysis)目前二十九頁\總數(shù)三十八頁\編于四點技術(shù)應(yīng)用測序技術(shù)推進科學(xué)研究的發(fā)展。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。這邊需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標序列捕獲測序技術(shù)（TargetedResequencing）。目前，高通量測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。以上我們盤點了2010年第二代測序技術(shù)的最新進展和相關(guān)應(yīng)用。但是除了第二代測序之外，還有另外一種以單分子實時測序和納米孔為標志的第三代測序技術(shù)也正在如火如荼的發(fā)展中，只是還沒有正式發(fā)布。所以目前科學(xué)界所說的高通量測序還指的是第二代測序。目前三十頁\總數(shù)三十八頁\編于四點意義高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降,以人類基因組測序為例,上世紀末進行的人類基因組計劃花費30億美元解碼了人類生命密碼,而第二代測序使得人類基因組測序已進入萬(美)元基因組時代。如此低廉的單堿基測序成本使得我們可以實施更多物種的基因組計劃從而解密更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時在已完成基因組序列測定的物種中,對該物種的其他品種進行大規(guī)模地全基因組重測序也成為了可能。目前三十一頁\總數(shù)三十八頁\編于四點目前三十二頁\總數(shù)三十八頁\編于四點第三代測序技術(shù)第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)。DNA測序時，不需要經(jīng)過PCR擴增，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序。目前三十三頁\總數(shù)三十八頁\編于四點原理第三代測序技術(shù)原理主要分為兩大技術(shù)陣營：第一大陣營是單分子熒光測序，代表性的技術(shù)為美國螺旋生物(Helicos)的SMS技術(shù)和美國太平洋生物(PacificBioscience)的SMART技術(shù)。脫氧核苷酸用熒光標記，顯微鏡可以實時記錄熒光的強度變化。當熒光標記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二大陣營為納米孔測序，代表性的公司為英國牛津納米孔公司。新型納米孔測序法（nanoporesequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動單個分子逐一通過納米孔來實現(xiàn)測序的。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，而ATCG單個堿基的帶電性質(zhì)不一樣，通過電信號的差異就能檢測出通過的堿基類別，從而實現(xiàn)測序。目前三十四頁\總數(shù)三十八頁\編于四點第三代測序技術(shù)解決關(guān)鍵技術(shù)第一：因為在顯微鏡實時記錄DNA鏈上的熒光的時候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標記的脫氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。這種強大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。PacificBiosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-modewaveguides(ZMWs)]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當某一種熒光標記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團被DNA聚合酶切除為止。第二：共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時進行記錄。目前三十五頁\總數(shù)三十八頁\編于四點第三代測序技術(shù)特點

它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍.它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個反應(yīng)就可以測