水產(chǎn)動物基質效應對常用漁藥膠體金檢測法的影響

水產(chǎn)動物基質效應對常用漁藥膠體金檢測法的影響前言水產(chǎn)動物中常用漁藥殘留免疫檢測的現(xiàn)狀及進展水產(chǎn)動物中漁藥殘留檢測的現(xiàn)狀隨著人們對食品安全認識的不斷提高，食品安全檢測也越來越受到重視，藥物殘留情況也越來越受到人們關注。國際食品法典委員會（CAC）對水產(chǎn)品中多種漁藥殘留的最高殘留限量做出了規(guī)定；我國制定的農(nóng)業(yè)部公告的第235號文件也對20種藥物的最大殘留量做出規(guī)定[1]。目前藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、液相色譜-質譜法（LC-MS）以及免疫分析法（IA）等[2]。檢測方法中的儀器檢測準確精密，但其前處理過程復雜，儀器一般為大型儀器且價格昂貴，在現(xiàn)場檢測時受到限制[3]。酶聯(lián)免疫法、膠體金快速檢測法等免疫檢測方法的優(yōu)勢日益凸顯，成為目前及今后的檢測熱點。水產(chǎn)動物中漁藥殘留免疫檢測的進展免疫檢測技術原理是：通過抗原抗體之間的特異性結合作用實現(xiàn)對目標檢測物（抗原或者抗體）的檢測。相對于儀器檢測方法，免疫檢測法具有快速、簡捷、特異性強等優(yōu)點，這使得免疫檢測法適用于藥物殘留的現(xiàn)場檢測[4]。目前，免疫檢測法已經(jīng)被廣泛的應用到水產(chǎn)品的多種藥物殘留檢測的過程中，如氯霉素[5]、孔雀石綠[6]、硝基呋喃[7]等的檢測。整個檢測周期包括樣品前處理和目標物測定兩個階段，目前測定階段的免疫檢測可以達到簡便、快速的效果，膠體金類技術甚至可以縮短到10分鐘以內[8]，但是樣品前處理階段，包含組織搗碎、提取凈化、高速離心等復雜過程，需要完備的設備且耗時長。除此之外，經(jīng)過前處理后的樣品提取物對快速檢測表現(xiàn)出較強的干擾作用[9]，這也限制了免疫檢測法在現(xiàn)場檢測中的應用。因此，對免疫快速檢測的研究，亟需找到優(yōu)化樣品前處理過程的方法，不僅能夠使前處理的時間縮短，還要盡可能的減小樣品提取物在快速檢測中表現(xiàn)出的干擾作用。水產(chǎn)動物中常用漁藥殘留膠體金免疫檢測的應用膠體金快速檢測技術是利用抗原和抗體的特異性結合，進而放大實驗結果，用肉眼直接觀察從而判定檢測結果的一種免疫檢測技術[10]。目前應用于檢驗中的免疫膠體金檢測技術操作過程簡單，可以使許多不同樣品的分析過程變得更加快捷，而且膠體金本身具有其特有的酒紅色，不需要復雜的儀器即可辨別檢測結果，因此在食品現(xiàn)場檢測方面受到大范圍的推廣使用。目前已研發(fā)出的膠體金免疫層析試紙大部分只能用來定性檢測，而且水產(chǎn)樣品中復雜的基質成分對檢測結果的基質干擾較大，使得膠體金檢測技術在應用中受限。因此亟需簡化免疫檢測卡的前處理過程，使其在實際檢測過程中避免繁瑣操作的同時保證檢測卡的有效性。免疫檢測的基質效應概述基質效應是指除被測物質以外的樣本特征，這些樣本特征可以影響到被測物質的檢測過程以及測定結果。常產(chǎn)生基質干擾的成分為生物樣品（如:血清、血漿、尿液、組織等）中的內源性物質，也可能是藥物的代謝產(chǎn)物。而對于免疫快速檢測，尤其是水產(chǎn)品的免疫檢測，基質效應主要來源于樣品及其提取物中的蛋白質、碳水化合物、脂質、小分子和鹽溶液等組分，這些組分是通過影響抗體和抗原（目標檢測物）的特異性結合形成干擾，這種基質效應能降低競爭性免疫檢測方法的靈敏度和可靠性，從而影響檢測結果的準確性[11]。解決基質干擾的重要因素就在于研究水產(chǎn)樣品中基質干擾的影響機理，但目前科研領域針對基質效應的研究還較少，因此對免疫檢測過程中基質干擾的研究具有很大的開發(fā)潛力。實驗研究的目的及意義本論文的研究目的在于：以孔雀石綠、環(huán)丙沙星等常見漁藥為研究對象，分析測定魚類樣本中的基質干擾組分及其對于膠體金免疫檢測法的基質干擾程度，在此基礎上分析研究檢測過程中的主要干擾組分及作用規(guī)律，為相關前處理技術的優(yōu)化完善以及最大程度提高前處理效率提供一定的理論依據(jù)。研究探討水產(chǎn)品中常見漁藥膠體金免疫檢測中的干擾基質及其基質影響程度，分析免疫檢測過程中基質干擾的主要來源，還可以減少和避免膠體金免疫檢測前處理過程的盲目性，從而開發(fā)出更有效、簡便的消除基質效應的方法，為免疫檢測前處理過程的簡化和大規(guī)?，F(xiàn)場檢測中的應用提供借鑒。本論文的研究內容與技術路線研究內容本實驗選用的孔雀石綠和鹽酸環(huán)丙沙星為研究對象，對常見的五種魚（大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚）采用膠體金快速檢測方法檢測兩種藥物殘留，判定基質效應，進一步進行基質組分分析，探索不同基質組分對這兩類藥物的膠體金快速檢測法的影響程度，從而為優(yōu)化膠體金檢測法的前處理過程，為開發(fā)出較為有效、簡便的消除基質效應的前處理方法提供借鑒。具體研究內容如下：（1）判斷基質效應是否存在：探索經(jīng)過前處理后的五種魚樣（大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚）對孔雀石綠和鹽酸環(huán)丙沙星兩類膠體金免疫檢測卡是否存在明顯的基質干擾。（2）干擾基質組分分析：識別和分析五種魚樣中主要的基質干擾組分。分別對樣液中的蛋白質、糖類、脂質和鹽離子等主要組分進行定量定性分析。（3）基質干擾的程度分析：通過單因素分析實驗分別進行去除蛋白質、脂質等組分的基質干擾進行對照試驗，配置類似樣液中糖類和離子強度等組分含量的緩沖液進行對照實驗，從而分析出不同基質組分對膠體金免疫檢測的基質干擾程度。技術路線水產(chǎn)動物基質效應對鹽酸環(huán)丙沙星膠體金檢測的影響引言環(huán)丙沙星為廣譜抗菌劑，屬于喹諾酮類抗菌藥物，殺菌效果好。但是環(huán)丙沙星具有嚴重的肝腎毒性，如果人類長時間攝入還會導致對喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥性，所以2002年我國農(nóng)業(yè)部將該藥列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥[12]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第783號[13]利用液相色譜檢測鹽酸環(huán)丙沙星的殘留，目前利用液相二級質譜[14]（LC-MS-MS）和間接競爭酶聯(lián)免疫檢測[15]的方法都可以測定水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的藥物殘留，能夠檢測環(huán)丙沙星的免疫膠體金檢測卡[16]也已經(jīng)研發(fā)成功。然而在水產(chǎn)樣品的檢測過程中，由于水產(chǎn)動物可食用組織中含有復雜的組分，這些組分在藥物殘留檢測過程中能夠產(chǎn)生嚴重的基質干擾，嚴重影響了檢測結果的準確性。因此本章實驗主要探究五種典型性魚的蛋白質、脂質、糖類、離子強度等樣液組分對環(huán)丙沙星膠體金檢測卡的基質干擾作用，旨在識別和判斷在水產(chǎn)動物藥物殘留膠體金免疫檢測過程中主要的基質干擾組分及其干擾程度。實驗材料實驗儀器設備電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司自動純水儀北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司78-1A型磁力攪拌器金壇市雙捷實驗儀器廠精密pH計上海精密科學儀器0.22μm濾膜密理博生物有限公司低溫冰箱青島海爾電冰柜有限公司組織搗碎機上海標本模型廠渦旋振蕩器廣州儀科實驗室技術有限公司冷凍離心機美國sigma公司電熱鼓風干燥箱（DHG-9070A）上海精宏實驗設備有限公司惠普G4050掃描儀中國惠普酶標儀芬蘭Labsystems公司DYY-7C電泳儀北京六一廠電磁鍋先科集團有限公司材料與試劑冰鮮的沙星類陰性魚肉樣品（大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚）中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所鹽酸環(huán)丙沙星標準品中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所環(huán)丙沙星膠體金層析試紙卡蘇州艾瑞德生物科技有限公司氯化鈉 國藥集團化學試劑有限公司氯化鉀天津市瑞金特化學品有限公司磷酸二氫鉀國藥集團化學試劑有限公司十二水合磷酸氫二鈉天津市瑞金特化學品有限公司十二烷基磺酸鈉（SDS）北京索萊寶科技有限公司牛血清白蛋白(BSA)北京索萊寶科技有限公司考馬斯亮藍R-250Fluka公司TEMEDSigma公司標準蛋白（Marker）北京索萊寶科技有限公司丙烯酰胺國藥集團化學試劑有限公司磺基水楊酸標準品國藥集團化學試劑有限公司其他試劑均為分析純溶液配制磷酸鹽緩沖液（PBS）：稱取1g磷酸二氫鉀、14.5g十二水合磷酸氫二鈉、40g氯化鈉、1g氯化鉀溶解于5L純水中，充分溶解后用牛血清蛋白（BSA）標準溶液：5mg/mL蛋白溶液稀釋50倍至濃度為0.1mg/mL。12%丙烯酰胺溶液：量取2.4mLA液、1.5mLB液、2.1mL純水充分混勻，使用前用真空泵抽氣30min。5%濃縮膠（蛋白質）：量取0.67mLA液、1.0mLC液、2.3mL純水、40uLAP、10uLTEMED充分混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。電泳緩沖液（蛋白質）：稱取1.0gSDS、3.0gTris和14.4g甘氨酸，加純水定容至1L，用精密pH計調節(jié)pH至8.3?？捡R斯亮藍染液：將1ml考馬斯亮藍R250加至50ml甲醇和100ml乙酸的有機溶劑混合液。電泳脫色液（蛋白質）：量取100mL甲醇和100mL乙酸用純水定容至1L。葡萄糖標準溶液：稱取1.0g葡萄糖標準品，用純水定容至1L上層緩沖液（糖）：稱取93g甘氨酸和24.2gTris用純水定容至1L。外室緩沖液（糖）：稱取6.183g硼酸、12.11gTris、0.372gEDTA-Na用純水定容至1L。12%分離膠（糖）：稱取11.25g丙烯酰胺、0.762g甲叉丙烯酰胺、5g蔗糖，用外室緩沖液定容至0.1L。5%濃縮膠（糖）：稱取4.75g丙烯酰胺、0.25g甲叉丙烯酰胺，用外室緩沖液定容至0.1L。50%蔗糖溶液：稱取1.0g蔗糖溶于1mL純水。阿利新藍染色液：將0.5%阿利新藍溶于2%乙酸。電泳脫色液（糖）：配置2%（V/V）乙酸溶液。鹽酸環(huán)丙沙星標準溶液：取1.0mg鹽酸環(huán)丙沙星標準品溶解于10mLPBS，配置成100ug/mL的標準溶液，4℃主要方法魚肉粗提取液的制備取大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚五種魚肉樣本（沙星類陰性樣本）的可食用部分，用高速組織搗碎機將魚肉充分搗碎攪勻，分裝至樣品袋中，于-20℃稱取5.0±0.1g上述組織樣本于50mL離心管中，1:1(M/V)加入pH=7.4的PBS緩沖液，渦旋振蕩充分混合，4132×g、4℃條件下離心10min，取上清。重復上述操作一次，將兩次取得的上清液混勻?；|效應對鹽酸環(huán)丙沙星膠體金免疫檢測影響的確定取1.3.1中魚肉粗提液和PBS緩沖液各100μL，分別用環(huán)丙沙星膠體金檢測卡進行檢測，對照粗提液與PBS緩沖液的檢測結果。樣液主要組分對鹽酸環(huán)丙沙星膠體金檢測卡的基質干擾程度分析樣液中蛋白質組分對膠體金檢測卡的基質干擾程度分析采用考馬斯亮藍法測定五種魚樣粗提液中蛋白質的含量，重復三次。以牛血清蛋白溶液（1mg/mL）為標準蛋白溶液，具體操作參照陸[17]的做法如下：制作蛋白質標準曲線：表1-1蛋白標準曲線Tab.1-1Thestandardcurveofprotein編號123456標準蛋白溶液（uL）04080120160200蒸餾水（uL）20016012080400考馬斯亮藍G-250（uL）200200200200200200以牛血清蛋白的濃度（mg/ml）為橫坐標，以吸光度值（595nm）為縱坐標，繪制標準曲線。將樣本粗提液稀釋至蛋白濃度約為1mg/mL，取40uL稀釋液加入200uL考馬斯亮藍，與上述加入考馬斯亮藍的梯度標準蛋白溶液一同置于595nm波長下測定吸光值。從而測定粗提液中蛋白質含量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析粗提液中蛋白質組成。1）準備待測樣本：根據(jù)考馬斯亮藍法檢測到的魚樣粗提液的蛋白濃度，將粗提液蛋白濃度稀釋至約為1mg/mL，取20uL的粗提液稀釋液，加入5uL上樣緩沖液，振蕩均勻，沸水浴加熱7min。2）制備聚丙烯酰胺凝膠：制膠器裝好1mm制膠板并用純水檢漏。將促凝劑（AP:40uL,TEMED:10uL）加入到抽氣完成的12%丙烯酰胺中制成分離膠，迅速混勻后注入膠槽，加水液封；待分離膠凝好后，除去水，將5%濃縮膠迅速加入膠槽并立即插入梳子進行凝膠；待凝膠完成后，加入電泳緩沖液，拔下梳子，將Maker和處理過的待測樣液加入樣品槽中，完成電泳前準備。3）電泳過程：選用80V初始電壓，當示蹤劑到達濃縮膠時，改用120V的電壓。當示蹤劑到達電泳槽底端時終止電泳，回收電泳緩沖液。4）將分離膠從膠板上小心取于培養(yǎng)皿中，使用考馬斯亮藍染色液染色2h，再用脫色液脫色過夜至背景清晰。最后，用掃描儀掃描凝膠，記錄結果。樣液中蛋白質組分去除及其對膠體金檢測卡檢測的基質干擾程度。取樣本粗提液于85℃水浴加熱10min，除去粗提液中的大部分蛋白質[18]使用環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測經(jīng)加熱和酸處理去除蛋白質后的樣液，與原粗提液的檢測結果進行對比，分析粗提液中蛋白質組分對膠體金檢測卡陰性樣本檢測過程中的基質干擾程度。樣液中脂質組分對膠體金檢測卡的基質干擾程度分析使用氯仿-甲醇法檢測樣液中的脂質含量。參考曹等[19]的實驗方法取10mL樣品粗提液于燒杯中，加入60mL甲醇，攪拌2min；加入氯仿30mL攪拌均勻，靜置2min；使用布氏漏斗抽濾，抽濾后的殘渣再用氯仿進行抽提，攪拌均勻后再用布氏漏斗抽濾。將收集的濾液轉移到分液漏斗中，加入35mLZn(AC)2（0.5％），充分振蕩混合，放置24h。取下層含有提取出脂質的氯仿層，100℃樣液中脂質組分的去除及其對膠體金檢測卡陰樣檢測的基質干擾程度。利用硅藻土過濾的方法去除脂質組分：將硅藻土與純水充分攪拌，懸濁液用布氏漏斗抽濾，形成濾餅，再將樣品粗提液進行抽濾，從而除去樣液中的脂肪。使用環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測經(jīng)去除脂質后的樣液，與原粗提液的檢測結果進行對比，分析粗提液中脂質組分對膠體金檢測卡陰性樣本檢測過程中的基質干擾程度。樣液中糖組分對膠體金檢測卡的基質干擾程度分析采用硫酸-苯酚法測定魚樣粗提液中總糖的含量，重復三次。以葡萄糖溶液（1mg/mL）為標準糖溶液，具體操作參考郭等[20]的檢測方法：繪制糖標準曲線：室溫條件下，避光反應30min，于490nm測定吸光值。表1-2糖標準曲線Tab.1-1ThestandardcurveofSugar編號123456789標準糖溶液濃度（ug/mL）102030405060708090苯酚（mL）111111111濃硫酸（mL）555555555以葡萄糖的濃度（ug/mL）為橫坐標，吸光度值（490nm）為縱坐標，繪制標準曲線。取1mL樣本粗提液，加入1mL的苯酚，緩慢加入5mL濃硫酸，與上述反應后的標準糖溶液一同置于490nm波長下測定吸光值。從而測定粗提液中總糖含量。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析糖組分。1）準備待測樣本：根據(jù)氯仿-苯酚法檢測到的魚樣粗提液的總糖濃度，將粗提液糖濃度濃縮至約為20mg/mL，1:1(V/V)加入50%蔗糖溶液，振蕩均勻。2）制備聚丙烯酰胺凝膠：制膠器裝好1mm玻璃板并用純水檢漏。將促凝劑（APS:15uL,TEMED:5uL）加入5mL12%分離膠中，迅速混勻后注射入膠槽中，加水液封，待分離膠液凝聚，除去水；將促凝劑（APS:20uL,TEMED:15uL）加入1.5mL5%濃縮膠中，迅速混勻后注入膠槽中，插入梳子。待完全凝膠后，將上層緩沖液加入膠槽內槽，外室緩沖液加入膠槽外層；拔下梳子，將處理過的待測樣液加入樣品槽中，完成電泳前準備。3）電泳過程：選用200V電壓進行電泳。電泳約30min，終止電泳。4）將分離膠從膠板上小心取下置于培養(yǎng)皿中，用阿利新藍染色液染色1h?；厥杖旧海用撋好撋^夜至背景清晰。最后，掃描儀掃描，記錄結果。魚肉中糖的總量因魚種而異，其中主要的糖類物質是糖原和粘多糖，也含有少量的單糖和二糖，游離糖的成分主要是葡萄糖，魚死后ATP分解還能夠生成游離核糖，磷糖在磷酸戊糖循環(huán)和糖酵解途徑中發(fā)揮重要作用[21]。常見魚種可食部分肌肉主要的糖組成如下表[22]：表1-3魚種可食用部分魚肉的主要糖含量Tab.1-3Themain

sugarcontentofmainediblepartofaquaticproducts魚種(mg/hg)大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚核糖25-4026-3536-5211-1526-36葡萄糖36-5237-4852-7515-2353-67磷酸化核糖21-3425-2718-459-1029-42磷酸化葡萄糖32-4736-3832-8513-1535-56α-乳糖9-118-118-129-118-10驗證糖組分的基質干擾：根據(jù)表中五種魚肉的糖含量情況，用PBS配置類似魚樣粗提液的魚多糖模擬液，用環(huán)丙沙星膠體金檢測卡進行檢測，并與原粗提液檢查結果進行對比，分析粗提液中的糖組分對環(huán)丙沙星膠體金檢測卡陰性樣本檢測過程中的基質干擾程度。樣液中離子強度對膠體金檢測卡的基質干擾程度分析魚肉灰分含量約為0.12~0.18%[23]?；曳种兄饕慕饘匐x子是Na+、Mg2+、Al3+、K+和Ca2+，其含量分別為0.70g/kg-0.94g/kg、0.452g/kg-0.660g/kg、0.052g/kg-0.063g/kg、0.032g/kg-0.041g/kg、0.102g/kg-0.124g/kg[19]。由于不同魚種離子強度差別較小，配置Na+實驗結果與分析膠體金檢測卡判讀方法：膠體金檢測卡是采用競爭法原理檢測。陰性：C線顯紅色，T線比C線顯色深或一樣深；陽性：C線顯紅色，T線比C線顯色淺；無效：C線完全沒有出現(xiàn)，表示測試無效。確定粗提液對環(huán)丙沙星檢測卡的檢測存在基質干擾圖1-1環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測陰性魚樣粗提液的檢測結果。（左起：空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure1-1.ThecolloidalgolddetectioncardresultsforDifferentcrudefishextractsofnegativesamples.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)如圖1-1所示，環(huán)丙沙星膠體金檢測卡對PBS緩沖溶液的檢測結果與陰性魚樣粗提液的檢測結果進行對比，后者的T線明顯變淺，C線大菱鲆略微變淺，出現(xiàn)假陽性結果，從而可以判斷魚肉粗提液的組分對膠體金檢測卡的檢測存在明顯的基質干擾，很可能是粗提液中復雜的組分影響了抗體和抗原（目標檢測物）的特異性結合，因此需要對粗提液中的各個組分進行進一步的分析，并確定其各組分對膠體金檢測的影響程度。魚肉粗提液蛋白組分分析1.考馬斯亮藍法測五種魚樣粗提液的蛋白質含量（見表1-4），并用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析粗提液中蛋白質組分（見圖1-2）。表1-4考馬斯亮藍法測得魚樣粗提液的蛋白質含量(n=3)Table1-4Thetotalproteincontentoffishes

extractdeterminedbytheCoomassiebrilliantbluemethod.(n=3)樣液種類大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚蛋白質濃度(mg/ml)21.5±0.718.4±1.023.5±0.924.6±1.030.3±0.4圖1-2魚樣粗提液蛋白電泳圖譜（蛋白條帶分別代表：M：標準蛋白，1-5分別代表不同的魚樣粗提液中蛋白條帶：大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚。）Figure1-2SDSoffishextracts.（ImagesofSDSlanesshowingM:marker,1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

proteinbands:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）由表1-4和圖1-2所示，蛋白質含量較高，種類較多。在免疫檢測過程中，魚樣粗提液中的蛋白質組分能與免疫球蛋白之間發(fā)生非特異性相互作用，引起空間位阻效應、失去活性位點，降低抗體與抗原的結合能力[18]。從而，蛋白質對于抗原抗體反應影響比較大，所以推斷蛋白可能也是影響膠體金免疫反應的主要因素。2．粗提液85度水浴加熱10min去除蛋白質組分，用考馬斯亮藍法檢測加熱處理后的樣液中蛋白質含量（見表1-5）以及聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其蛋白組分（見圖1-3）。表1-5考馬斯亮藍法測粗提液加熱后的蛋白含量Table1-5Thetotalproteincontentof

theheattreatedsamplesolution

determinedbytheCoomassiebrilliantbluemethod.樣液種類大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚蛋白濃度（mg/mL）6.9±0.33.3±0.37.2±0.74.9±0.55.1±0.4圖1-3加熱處理后不同樣本中蛋白質的電泳圖譜（蛋白條帶分別代表：M：標準蛋白，1-5分別代表不同的魚樣粗提液經(jīng)加熱后的蛋白條帶：大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚）Figure1-3SDSoffishextractsafterheating.（ImagesofSDSlanesshowingM:marker,1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

proteinbandsafterheating:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）圖1-4加熱處理后的樣液的檢測結果（左起：空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure1-4.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforheattreatedcrudefishextracts.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)據(jù)表1-5以及1-3電泳圖可知，85度處理后粗提液中蛋白質含量明顯下降，蛋白條帶明顯減少，因此說明：在經(jīng)過85度水浴加熱10min的加熱處理后，粗提液中的大部分蛋白質已經(jīng)去除，僅有少量殘留。大菱鲆樣液中的蛋白質在116.0kD和35.0kD附近有少量殘留，其他魚種樣液中的蛋白質在35.0kD附近均有少量殘留。由圖1-4所示，用膠體金檢測卡對經(jīng)加熱處理去除大部分蛋白質之后的樣液進行檢測，與PBS緩沖液的檢測結果相比仍有嚴重的基質干擾。由此分析基質效應可能為殘留的少量蛋白質產(chǎn)生，或者由樣液中的其他組分產(chǎn)生。需進行進一步的蛋白質去除實驗驗證分析。3．利用2%磺基水楊酸溶液進一步去除經(jīng)熱處理后樣液中的蛋白質，用考馬斯亮藍法檢測酸處理后樣液中蛋白質含量（見表1-6）以及聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其蛋白組分（見圖1-5）。表1-6考馬斯亮藍法測粗提液經(jīng)加熱和酸處理后的蛋白含量Table1-5Thetotalproteincontentof

theheatandacidtreatedsamplesolution

determinedbytheCoomassiebrilliantbluemethod.樣液種類大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚蛋白濃度（mg/mL）0.06±0.010.05±0.030.06±0.010.06±0.010.06±0.03圖1-5酸處理后樣液中蛋白質的電泳圖譜（蛋白條帶分別代表：M：標準蛋白，1-5分別代表不同的魚樣粗提液經(jīng)酸處理后的蛋白條帶：大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚。）Figure1-5SDSofacidtreatedsamplesolution.（ImagesofSDSlanesshowingM:marker,1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

proteinbandsafteracidtreating:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）圖1-6磺基水楊酸對膠體金檢測卡的影響圖1-7蛋白質去除前后對照圖左起：空白；（1）2%磺基水楊酸（調pH=7.0）；（左起為去蛋白前；空白；去蛋白；（2）2%磺基水楊酸（未調pH）1-3分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚）Figure1-6.Effectof

sulfosalicylicacid

Figure1-7.Thecontrol

chart

of

proteinon

colloidalgolddetection

card.removingbefore-and-after.(Fromleft:blanksampleaddingsulfosalicylic(Fromleft:sampleextractionsolution,acidadjusts

pHto7,sampleaddingsulfosalicylicblank,samplewithoutprotein.1-3,acidwithoutadjustingpH)representdifferentkindsof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish)據(jù)表1-6和圖1-5所示，用2%磺基水楊酸處理加熱過程后的樣液，樣液中蛋白質含量極少，可以證明原有蛋白基本已經(jīng)被除去（即由樣液中的蛋白質組分對膠體金檢測卡的檢測產(chǎn)生基質干擾的可能性基本去除）。用環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測蛋白質基本去除的樣液，檢測結果如下（見圖1-7）。由圖1-6所示，2%磺基水楊酸（pH=0.65）對環(huán)丙沙星膠體金檢測卡的正常檢測有嚴重干擾，甚至導致膠體金滯留現(xiàn)象，T線、C線均不顯示，試劑卡無效。但將其pH調至7.0左右時，不再存有滯留現(xiàn)象，說明pH值過低對膠體金檢測卡的正常檢測具有顯著影響。因此，用磺基水楊酸處理去除樣液中的蛋白后，需將樣液的pH調至7.0左右，再用膠體金檢測卡檢測。由圖1-7所示，在蛋白質組分基本去除的情況下（右）T線仍明顯變淺，但與未去除蛋白粗提液的檢測結果（左）進行對照，T線已有所加深，即假陽性減弱，樣液對膠體金檢測的基質干擾有所減弱，但仍然存在顯著的基質干擾。綜上：粗提液中的蛋白質組分是環(huán)丙沙星膠體金檢測卡陰性樣品檢測過程中的基質干擾因素，但非最主要的基質干擾因素。魚肉粗提液中脂質組分分析采用氯仿-甲醇法對粗提液中的脂質含量進行檢測，檢測結果如下（見表1-7）。由表1-7所示，粗提液中的脂質含量較少，采用硅藻土過濾的方法去除粗提液中的脂質組分后，再采用氯仿-甲醇法檢測驗證樣液中脂質組分的去除情況（見表1-8）。用膠體金檢測卡檢測去除脂質后的樣液，檢測結果(見圖1-8)。表1-7氯仿-甲醇法檢測粗提液中的脂質含量Table1-7Thetotallipidcontentof

thefishes

extracttestedbytheChloroform-MethanolMethod.樣液大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚脂質含量(mg/mL)1.42±0.052.39±0.050.84±0.050.52±0.050.76±0.05表1-8氯仿-甲醇法檢測去除脂質后的樣液中脂質含量Table1-7Thetotallipidcontentof

samplesolution

thathaveremovalof

lipidtestedbytheChloroform-MethanolMethod.樣液大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚脂質含量(mg/mL)0.23±0.050.14±0.050.10±0.050.31±0.050.12±0.05圖1-8膠體金檢測卡檢測去脂肪后樣液檢測結果（左起：空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure1-8.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforsamplesolution

thathaveremovalof

lipid.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fishincrudeextractof

proteinbandsafterremovinglipid:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)由表1-8可得，魚樣粗提液經(jīng)硅藻土過濾后，提取液中的脂質含量很少，可以證明脂質組分基本去除。由圖1-8所示，C線顯色正常，而T線顯色較淺，即假陽性現(xiàn)象顯著。由此可知，環(huán)丙沙星膠體金檢測卡對去除脂質后的樣液的檢測結果和未去除脂質的樣品粗提液的檢測結果（圖1-1）差別不大，即樣液中的脂質組分并不是造成膠體金檢測卡假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)的主要因素。綜上：魚樣粗提液中的脂質組分并非環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測過程中引起基質干擾的主要因素。魚肉粗提液中糖組分分析采用硫酸-苯酚法檢測五種魚樣粗提液的總糖含量（見表1-7），并用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析糖組分（見圖1-8）。表1-9硫酸-苯酚法檢測粗提液的糖含量Table1-9Thetotalsugarcontentof

thefishes

extracttestedbytheSulfuricacid-PhenolMethod樣液大菱鲆鯉魚鱖魚鳙魚草魚糖含量(mg/mL)0.98±0.160.82±0.271.59±0.180.72±0.401.39±0.50圖1-9魚樣粗提液糖電泳圖譜（糖電泳條帶1-5分別代表不同的魚樣粗提液中糖條帶：大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚。）Figure1-9SDSoffishextracts.（ImagesofSDSlanesshowing:1-5,representfivedifferentkindsof

fishincrudeextractof

sugarbands:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp.）由表1-7所示，粗提液中總糖含量較小。對糖電泳圖譜進行分析：電泳圖未能完全將電泳條帶顯現(xiàn)出來的原因可能有兩個，一是提取液中的部分分子量較小的糖分子已經(jīng)跑出，未在條帶上顯示出來；二是原粗提液濃縮程度仍不夠，糖濃度含量太低。根據(jù)表1-3中魚種可食用部分魚肉的主要糖含量，用PBS配置類似魚樣粗提液中糖含量的魚多糖模擬液，用膠體金檢測卡檢測，檢測結果如下（見圖1-10）。由圖1-10所示，T線顯色明顯，按照膠體金檢測卡的判讀方法，該檢測結果表示檢測樣本為陰性，由此證明：魚多糖模擬液中的糖組分并未在膠體金檢測卡檢測過程中引起明顯的基質干擾，由此推及到樣品粗提液中的糖組分并非引起環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測陰性樣品過程中基質干擾的主要因素。綜上:魚樣粗提液中的糖組分并非環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測陰性樣品過程中引起基質干擾的主要因素。圖1-10魚多糖模擬液膠體金快速檢測卡檢測結果（左起：空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure1-10.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforfish

polysaccharide

solution.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentfivekindsof

kindof

sugar

solution:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)魚樣粗提液中離子強度分析由于不同魚種離子強度差別較小，配置Na+、Mg2+、Al3+、K+和Ca2+五種離子含量分別為0.8g/kg、0.5g/kg、0.06g圖1-11離子強度模擬液膠體金檢測卡檢測結果Figure1-11.Thecolloidalgolddetectioncardresultsforfishionicstrength

solution.由圖1-11所示，C線顯色正常，T線明顯變淺，假陽性明顯，即粗提液的離子強度模擬液在膠體金檢測卡檢測過程中能夠引起明顯的基質干擾，由此推及到樣品粗提液中的離子強度可能是引起環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測陰性樣品過程中基質干擾的主要因素。進一步驗證離子強度是主要基質干擾因素（見圖1-12）。圖1-12梯度鹽溶液對膠體金檢測卡檢測結果的影響（左起：空白；1-5分別代表離子強度模擬液的不同稀釋倍數(shù)：0、5、10、50、100）Figure1-12.The

colloidalgolddetectioncardresultsforThegradientof

saltsolution.(Fromleft:blank;1-5,representdifferenttheionicstrength

simulation:0,5,10,50,100)由圖1-12所示，對離子強度模擬液進行5、10、50、100的梯度稀釋，檢測結果中T線顯色逐漸加深，假陽性現(xiàn)象逐漸減弱，膠體金檢測卡的檢測結果與樣液中鹽離子含量的變化線性相關性較強?？勺C離子強度是主要基質干擾因素。圖1-13單一鹽離子緩沖液對膠體金檢測卡檢測結果的影響（左起：空白；1-5分別代表不同種類鹽離子模擬液：鉀、鈉、鎂、鋁、鈣）Figure1-13.The

colloidalgolddetectioncardresultsforsingle

saltsolution.(Fromleft:blank;1-5,representthe

differentkindsof

salt

simulation:K,Na,Mg,Al,Ca)圖1-14梯度鎂溶液對膠體金檢測卡檢測結果的影響（左起：空白；1-5分別代表鎂離子模擬液的不同稀釋倍數(shù)：0、3、6、30、100）Figure1-14.The

colloidalgolddetectioncardresultsforthegradientof

Magnesiumsolution.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentthesimulationofliquid

magnesium:0,3,6,30,100)由圖1-13所示，對鉀、鈣、鈉、鎂、鋁五種鹽離子做單因素檢測，其中鉀、鈣、鈉、鋁鹽離子的檢測結果與空白相近，T線與C線均顯色，且顯色程度相同；而鎂離子檢測結果出現(xiàn)明顯假陽性，T線顯色明顯變淺，因此可推出在樣液離子強度模擬液中鎂離子對膠體金檢測卡有較明顯的基質干擾，并通過圖1-14進一步驗證了鎂離子在環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測過程中的基質干擾作用。綜上:魚樣粗提液中的離子強度是環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測陰性樣品過程中引起基質干擾的主要因素，并且在五種大量鹽離子中鎂離子在環(huán)丙沙星膠體金檢測卡檢測過程中的基質干擾作用明顯。水產(chǎn)動物基質效應對孔雀石綠膠體金檢測的影響引言孔雀石綠是一種有毒的三苯甲烷類有機化學物，既可以作染料，也可以作為一種高效殺蟲劑[24]，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應用，但長期超量使用可致癌[25]，國家明令在無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖領域禁止添加。作為一種抗菌、殺蟲劑，孔雀石綠在水產(chǎn)動物體內能夠通過一系列新陳代謝等生化過程，使其絕大部分轉化為隱色孔雀石綠，這種無色孔雀石綠是脂溶性的，能夠在生物體內積累，所以在魚組織藥殘檢測時我們所檢測到的殘留物是隱色孔雀石綠。由于孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的藥物殘留危害很大，我國政府部門對孔雀石綠和無色孔雀石綠的最高殘留限量做出嚴格規(guī)定，其殘留限量不能超過1ug/kg。目前檢測孔雀石綠的膠體金已經(jīng)研制出來并已投入現(xiàn)場檢測中，然而利用膠體金免疫檢測陰性樣本時檢測結果常出現(xiàn)假陽性[26]。因此本章實驗主要探究五種典型魚種待測液對孔雀石綠膠體金檢測卡的基質干擾作用。實驗材料實驗儀器設備氮吹儀Autoscience公司其他儀器設備見前一章材料與試劑冰鮮的孔雀石綠陰性魚肉樣品（大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚）中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所隱色孔雀石綠標準品Sigma公司孔雀石綠膠體金層析試紙卡深圳市三方圓生物科技有限公司其他試劑均為化學純溶液配制隱色孔雀石綠標準溶液：取1.0mg隱色孔雀石綠標準品用純水定容至10mL，配置成100ug/mL的標準溶液。主要方法魚樣待測液的制備取大菱鲆、鯉魚、鱖魚、鳙魚、草魚五種魚肉樣本（孔雀石綠陰性樣本）的可食用部分，用高速組織搗碎機將魚肉充分搗碎攪勻，分裝至樣品袋中，于-20℃參照三方圓生物科技有限公司孔雀石綠（組織）快速檢測卡使用說明書，對魚肉樣品進行以下處理：稱取3±0.05g陰性魚肉樣本于15mL離心管中。加6mL提取劑A，振蕩均勻后再加入2g提取劑B，振蕩5min使其充分混勻，在20℃取4mL上層有機相至15mL離心管中，加入20uL氧化劑，振蕩均勻后再加入4mL凈化劑，振蕩均勻，靜置1min。取3mL下層的紫紅色溶液于5mL離心管中，在55℃確定待測液對孔雀石綠檢測卡的檢測存在基質干擾取2.3.1中陰性樣本待測液和PBST溶液各100μL，分別用孔雀石綠膠體金檢測卡進行檢測，對比待測液與PBST溶液的檢測結果。樣液中蛋白質組分對膠體金檢測卡的基質干擾程度分析采用考馬斯亮藍法測定五種魚樣待測液中蛋白質的含量，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析待測液中蛋白質組成。具體操作方法同樣液中離子強度對膠體金檢測卡的基質干擾程度分析孔雀石綠陰性魚肉樣本經(jīng)前處理過程所得的待測液中的鹽離子種類及含量需進一步開展實驗研究分析，驗證1.4所得結果：離子強度是膠體金檢測卡的檢測過程中主要的基質干擾因素。實驗結果與分析確定待測液對環(huán)丙沙星檢測卡的檢測不存在明顯的基質干擾圖2-1孔雀石綠膠體金檢測卡檢測陰性待測液的檢測結果（左起：0代表空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure2-1.Thecolloidalgolddetectioncardresultsfornegativesamplesthattobechecked.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)圖2-2待測液加標0.2ppb檢測結果。（左起：0代表空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure2-2.Thecolloidalgolddetectioncardresultsfornegativesamplesthattobecheckedwithstandard

to0.2ppb.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)圖2-3待測液加標0.5ppb檢測結果（左起：0代表空白；1-5分別代表：大菱鲆；鯉魚；鱖魚；鳙魚；草魚）Figure2-3.Thecolloidalgolddetectioncardresultsfornegativesamplesthattobecheckedwithstandard

to0.5ppb.(Fromleft:blank;1-5,representdifferentkindof

fish:Scophthalmusmaximus,Cyprinoid,Mandarinfish,Aristichthys,Grasscarp)如圖2-1所示，孔雀石綠膠體金檢測卡對陰性魚樣待測液的檢測結果和PBST緩沖溶液的檢測結果進行對比，T線均顯色明顯，其檢測結果為樣本陰性，未出現(xiàn)明顯的基質干擾現(xiàn)象，可以判斷魚肉待測液的組分對膠體金檢測卡的檢測并不存在明顯的基質干擾。加標實驗進一步驗證待測液對孔雀石綠膠體金檢測卡的檢測不存在明顯基質干擾。如圖2-2、圖2-3所示，在規(guī)定的孔雀石綠檢出最高限量1ug/kg（1ppb）內，進行0.2ppb、0.5ppb加標實驗，孔雀石綠膠體金檢測卡對加標待測液的檢測結果為：T線顯色情況與空白T線相近（孔雀石綠膠體金免疫層析檢測卡的檢出限為0.2ppb），即與隱性孔雀石綠標準溶液檢測結果無明顯區(qū)別，可以驗證待測液組分對孔雀石綠膠體金檢測卡的檢測不存在明顯的基質干擾。根據(jù)1.4的實驗結果分析，待測液對膠體金檢測卡的檢測沒有明顯基質干擾的原因有可能是待測液中的蛋白質、離子強度等基質干擾的因素在孔雀石綠陰性樣本待測液中含量較少，因此需對待測液中蛋白質組分、離子強度等因素進行驗證分