紫杉醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝

微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)品介紹及社會(huì)價(jià)值：紫杉醇是一種二萜類(lèi)衍生物，是當(dāng)前公認(rèn)的廣譜、活性強(qiáng)的抗癌藥物之一?。紫杉醇最早是wanj等于1971年從短枝紅豆杉(7Ikusbreviifolia)樹(shù)皮中分離得到的。隨后，schiff等證實(shí)紫杉醇具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制。隨著紫杉醇的臨床應(yīng)用，對(duì)其研究也逐漸深入，其主要抗癌機(jī)制為抑制腫瘤細(xì)胞的微管(Microtllbules)合成，以阻斷細(xì)胞分裂，致使腫瘤體積逐漸縮?。蛔仙即歼€可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另外還有類(lèi)似脂多糖(IPS)的作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。目前國(guó)際市場(chǎng)上的紫杉醇仍依靠從紅豆杉樹(shù)皮提取及半合成，迄今為止尚未見(jiàn)有第三種形式形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。紫杉醇的工業(yè)生產(chǎn)受到了原料和技術(shù)兩方面的制約，短期內(nèi)難以突破。為了解決紅豆杉資源短缺與紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人們對(duì)生產(chǎn)紫杉醇進(jìn)行了多方面的研究，包括化學(xué)全合成、紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)及微生物發(fā)酵。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇因具有明顯優(yōu)勢(shì)，其研究和開(kāi)發(fā)越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。這里提出一種運(yùn)用基因工程，代謝工程，發(fā)酵工程結(jié)合的方法生產(chǎn)紫杉醇，該法首先將杉醇純合成基因克隆至大腸桿菌，讓其高產(chǎn)紫杉二烯，再把它流加至高產(chǎn)紫杉醇酵母的發(fā)酵罐中，運(yùn)用代謝工程手段生產(chǎn)紫杉醇。創(chuàng)新點(diǎn)：運(yùn)用克隆方法，將合成紫杉二烯的代謝過(guò)程酶的結(jié)構(gòu)基因，以及調(diào)控系列克隆至大腸桿菌，讓其表達(dá)，此過(guò)程剛被ParayilKumaranAjikumar及其同事實(shí)現(xiàn)，而運(yùn)用代謝工程手段讓高產(chǎn)紫杉醇酵母利用紫杉二烯這個(gè)前體高產(chǎn)紫杉醇，這是沒(méi)嘗試但可行的。國(guó)內(nèi)外研究：1、分離菌種：最早stierle和strobel等在短葉紅豆杉的枝條上分離到一種內(nèi)生真菌，能夠產(chǎn)生紫杉醇，定名為安德列亞霉。此后，各國(guó)學(xué)者紛紛開(kāi)展產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離工作，陸續(xù)從西藏紅豆杉、云南紅豆杉、東北紅豆杉、歐洲紅豆杉、中國(guó)紅豆杉中分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，其宿主植物幾乎涉及紅豆杉屬的各個(gè)種。周東坡領(lǐng)導(dǎo)的課題組從百年以上的東北紅豆杉的枝條與樹(shù)皮中分離到3株可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，發(fā)酵液中紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá)51．06μg/L～125．70μg／L。王建鋒等也從南方紅豆杉皮層中分離到一株瘤座孢菌，發(fā)酵產(chǎn)物分析表明可產(chǎn)紫杉醇，產(chǎn)量為185．4μg/L。2、菌種改良：誘變：HQD33（周東坡分離）經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)、EMS、60co、NTG等誘變劑順序誘變得到高產(chǎn)突變株NCEU一1，其紫杉醇產(chǎn)量到達(dá)314．07μg/L。原生質(zhì)體融合：趙凱等人發(fā)現(xiàn)最佳的誘變條件為30w紫外燈、30cm距離、照射50s；UV+Licl復(fù)合誘變、照射時(shí)間40s。3、構(gòu)建工程菌：紫杉醇的生物合成途徑為最近ParayilKumaranAjikumar及其同事通過(guò)平衡數(shù)種細(xì)菌和植物的酶來(lái)利用大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物紫杉二烯，其產(chǎn)量為1g/L.工藝流程：載體質(zhì)粒的制備目的基因的獲得基因文庫(kù)的構(gòu)建一、產(chǎn)紫杉二烯工程菌構(gòu)建： 載體質(zhì)粒的制備目的基因的獲得基因文庫(kù)的構(gòu)建重組DNA重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建工程菌的培養(yǎng)與目標(biāo)產(chǎn)物分離表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)工程菌的培養(yǎng)與目標(biāo)產(chǎn)物分離表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)基因文庫(kù)的構(gòu)建：取歐洲紫杉醇提取染色體目標(biāo)基因的獲得：取得合成紫杉二烯酶的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控系列擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建：將紫杉二烯酶的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)控系列連接到質(zhì)粒上二、大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉二烯：培養(yǎng)基原料培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基滅菌工程菌搖瓶種子罐生產(chǎn)罐培養(yǎng)液細(xì)胞分離三、通過(guò)基因工程手段調(diào)整高產(chǎn)紫杉醇酵母產(chǎn)紫杉醇的途徑，使它能利用紫杉二烯高效合成紫杉醇，構(gòu)建工程菌四、酵母發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇培養(yǎng)基原料培養(yǎng)基配制工程菌搖瓶種子罐生產(chǎn)罐培養(yǎng)液細(xì)胞分離無(wú)細(xì)胞上清液產(chǎn)品抽提 產(chǎn)品精制 產(chǎn)品包裝 廢水處理培養(yǎng)基原料：大腸桿菌發(fā)酵液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要活性成分：5β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13－[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯]。按干燥品計(jì)算，含C47H51NO14應(yīng)為98.0－102.0%。性狀：白色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，無(wú)味。在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中幾乎不溶。比旋度取本品，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1ml中含3mg的溶液，依法測(cè)定，比旋度為-48°至-56°。鑒別：（1）取與紫杉醇對(duì)照品，分別加甲醇制成每1ml中的含1.0mg的溶液，照薄層色譜法（試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯-氯仿-甲醇-三乙胺（4∶3∶2∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱10分鐘后檢視，顯紫黑色斑點(diǎn)，供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置應(yīng)與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。（2）在含量測(cè)定項(xiàng)下所記錄的色譜圖中，供試品溶液主成分峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主成分峰的保留時(shí)間一致。（3）紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照品的圖譜一致。經(jīng)濟(jì)效益：產(chǎn)量為2mg/L建十只十立方米的發(fā)酵罐產(chǎn)值2*10*10*365/1000*400000=2920000$各種雜費(fèi)為1460000$[3]利潤(rùn)：1460000$參考文獻(xiàn)：[1]IsoprenoidPathwayOptimizationforTaxolPrecursorOverproductioninEscherichiacoli[2]Isolationandcharacterizationofendophytictaxol-producingfungifromTaxuschinensis