RNA在病原微生物檢測中的應用

RNA在病原微生物檢測中的應用2021/10/101摘要主要分子檢測技術(shù)原理及差異RNA擴增技術(shù)用于病原體檢測的優(yōu)勢國內(nèi)外病原體檢測現(xiàn)狀RNA擴增技術(shù)在臨床中應用小結(jié)2021/10/102摘要主要分子檢測技術(shù)原理及差異RNA擴增技術(shù)用于病原體檢測的優(yōu)勢國內(nèi)外病原體檢測現(xiàn)狀RNA擴增技術(shù)在臨床中應用小結(jié)2021/10/103

病原體檢測方法分類以看到“整個病原體”為基礎(chǔ)的方法鏡檢，培養(yǎng)以直接或間接看到“病原體組分－蛋白質(zhì)”為基礎(chǔ)的方法免疫學膠體金，Elisa,化學發(fā)光，etc以看到“病原體組分－核酸”為基礎(chǔ)的方法

分子生物學2021/10/104分子診斷概念和特點概念：利用標本中的核酸作為檢測對象，對感染性疾病、腫瘤、遺傳性疾病等進行診斷和預后判斷的方法。特點：特異性高、靈敏度高診斷范圍廣、適應性強2021/10/105什么是核酸？鏈狀分子DNA(脫氧核糖核酸)

貯存遺傳信息RNA(核糖核酸)

傳遞遺傳信息遺傳信息的傳遞途徑DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄2021/10/106DNAvs.RNA（一）DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，RNA是單鏈結(jié)構(gòu)DNA很穩(wěn)定，RNA很不穩(wěn)定2021/10/107DNAvs.RNA（二）有些RNA在細胞中拷貝數(shù)很多

一個或幾個拷貝DNA104核糖體RNA(rRNA)16SrRNA23SrRNA使用rRNA為靶標，可以大大提高了取樣效率和檢測靈敏度。2021/10/108常見的RNA檢測技術(shù)NASBA（國外）TMA（國外）SAT（國內(nèi)）2021/10/109SAT技術(shù)原理①②③④同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標核酸（RNA）的一個雙鏈DNA拷貝。然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個（100～1000個）RNA拷貝；帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況；同時，每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)。

2021/10/1010SAT與PCR技術(shù)原理比較

RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分鐘內(nèi)擴增1010倍RNADNA2021/10/1011SAT配套儀器(全自動工作站)樣本---提取純化RNA---酶反應混合液（一體化）全封閉生物安全性好快（48個樣本/2.5小時）2021/10/1012摘要主要分子檢測技術(shù)原理及差異RNA擴增技術(shù)用于病原體檢測的優(yōu)勢國內(nèi)外病原體檢測現(xiàn)狀RNA擴增技術(shù)在臨床中應用小結(jié)2021/10/1013DNA用于臨床檢驗的不足“死菌檢測也陽性”，與臨床相關(guān)性差基因型與表型不吻合(耐藥檢測)

不能區(qū)分“潛伏感染”“活動性感性”

易交叉污染

反應易受抑制2021/10/1014SAT檢測靶標為16SrRNA靈敏度更高

RNA在細胞中拷貝數(shù)很多，細菌中16srRNA多達10000-20000個

一個或幾個拷貝DNA10416srRNA2021/10/1015Jensen,1994-16SrRNA具有高度保守性不同來源MG的16SrRNA區(qū)域，PCR產(chǎn)物序列同源性100%，準確區(qū)別不同病原體SAT檢測靶標為16SrRNA檢測特異性高2021/10/101616SrRNA長度適中，適合做探針，檢測更準確其編碼基因長度約為1500bp,包含50個左右功能域2021/10/1017RNA診斷（TMA、SAT）具有非常高的靈敏度和準確度Gen-probe:RNA檢測羅氏:DNA檢測2021/10/1018與DNA相比，RNA檢測更利于療效評估及判愈DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，較穩(wěn)定，不易降解。治愈后仍有“死菌”殘留，人體內(nèi)完全代謝需2-3周時間

<<中國性病診療指南>>中指出，如用PCR方法進行判愈，需在療程結(jié)束后3-4周。RNA單鏈結(jié)構(gòu)，易降解，病原體死亡后2-3天后完全降解與臨床相關(guān)性好，=“培養(yǎng)”，有利于療效評估和及時判愈有些情況下，可以直接診斷“活動性感染”

活動性感染：指示RNA轉(zhuǎn)錄活躍潛伏感染：指示RNA不轉(zhuǎn)錄2021/10/1019能檢測多種樣本類型，比如尿液等，取樣方便。數(shù)據(jù)來源：M.Chernesky,D.Jang,K.Luinstra,etal.2006.HighAnalyticalSensitivityandLowRatesofInhibitionMayContributetoDetectionofChlamydiatrachomatisinSignificantlyMoreWomenbytheAPTIMACOMBO2Assay.J.Clin.Microbiology44(2):400-405.反應不易受抑制2021/10/1020SAT診斷技術(shù)對于病原體檢測中的優(yōu)勢SAT產(chǎn)品特點SAT的優(yōu)勢帶給臨床的益處檢測靶標：16SrRNA靈敏度高,特異性更強活菌檢測反映臨床用藥的療效結(jié)果準確度高早期診斷檢出率高用藥治療后準確及時的判愈擴增產(chǎn)物：RNA產(chǎn)物易降解，減少實驗室污染風險維護實驗室質(zhì)控水平反應不易受抑制檢測樣本多樣化（拭子、尿液）取樣方便提高了醫(yī)生的工作效率減輕了病人取樣帶來的痛苦擴增方式：42℃恒溫降低實驗室設(shè)備要求縮短檢測時間自動化操作更易實現(xiàn)報告更快速、更準確避免了人工操作帶來的誤差2021/10/1021摘要主要分子檢測技術(shù)原理及差異RNA擴增技術(shù)用于病原體檢測的優(yōu)勢國內(nèi)外病原體檢測現(xiàn)狀RNA擴增技術(shù)在臨床中應用小結(jié)2021/10/1022

國內(nèi)外RNA診斷產(chǎn)品監(jiān)管機構(gòu)認可情況國外：FDA或CE認證產(chǎn)品（TMA）國內(nèi)：SFDA認證產(chǎn)品（SAT）沙眼衣原體（CT）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）淋病奈瑟菌（NG）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）解脲脲原體（UU）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）生殖支原體（MG)核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）結(jié)核分枝桿菌（TB）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）腸道病毒71型（EV71）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）柯薩奇病毒A16型（CA16）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）腸道病毒（EV）通用型核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）肺炎支原體（MP）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增）......為什么我們必須熟悉和了解RNA檢測技術(shù)？（一）2021/10/1023

為什么我們必須熟悉和了解RNA檢測技術(shù)？（二）血液篩查市場美國中國RNA診斷RNA診斷傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)其他傳染病市場（優(yōu)生優(yōu)育：CT/NG為例）RNA診斷傳統(tǒng)技術(shù)傳統(tǒng)技術(shù)美國中國100%進口！有部分國產(chǎn)

國內(nèi)外RNA診斷產(chǎn)品應用情況2021/10/1024RNA用于CT/NG的檢測（TMA）是目前行業(yè)公認的“金標準”

為什么我們必須熟悉和了解RNA檢測技術(shù)？（三）TMA（APTIMACombo2）被廣泛的應用于CT/NG檢測。在美國，85%的頂級醫(yī)院使用TMA進行CT/NG檢測沒有競爭對手可以超過TMA，是目前市場上最好的CT/NG檢測產(chǎn)品新方法學CT/NG的產(chǎn)品臨床試驗都必須選擇TMA（APTIMACombo2）做參比試劑數(shù)據(jù)來源于Internaltraining，Gen-probe2021/10/1025RNA用于TB的檢測（TMA）進入多國診療指南2009：美國CDC更新NAAT法在TB實驗室診斷中應用的指南——所有疑似TB的初診病人，除了做涂片之外，都必須用TMA檢測至少一份樣本。（TMA獲得FDA認證可檢測涂陰、涂陽標本，PCR只獲得FDA認證可檢測涂陽標本）為什么我們必須熟悉和了解RNA擴增技術(shù)？（四）UpdatedGuidelinesfortheUseofNucleicAcidAmpflicationTestintheDiagnosisofTuberculosis(2009)UnitedStates

2021/10/1026摘要主要分子檢測技術(shù)原理及差異RNA擴增技術(shù)用于病原體檢測的優(yōu)勢國內(nèi)外病原體檢測現(xiàn)狀SAT擴增技術(shù)在生殖道支原體檢測優(yōu)勢結(jié)論2021/10/1027國內(nèi)唯一上市MG診斷試劑結(jié)果準確

檢測靶標—16SrRNA，靈敏度高，特異性強取樣方便女性：陰道拭子、宮頸拭子、尿液

男性：尿道拭子、尿液療效判愈

檢測靶標為RNA

只有“活菌”RNA才能被檢測

治愈后2-3天，RNA在體內(nèi)完全降解

上市時間—2014年4月2021/10/1028SAT檢測MG陽性的患者與測序基本一致對女性尿液和宮頸拭子同時檢測進行

SAT檢測結(jié)果與測序結(jié)果分析如下測序結(jié)果合計陽性陰性尿液和宮頸拭子SAT結(jié)果陽性43043陰性5249254合計48249297陽性符合率=43/（43+5）*100%=89.58%陰性符合率=297/（297+0）*100%=100%準確度=（43+249）/297*100%=98.32%2021/10/1029SFDA唯一批準可用于尿液檢測的核酸試劑對女性同一患者的尿液樣本和宮頸拭子樣本同時檢測與尿液和陰道拭同時檢測SAT檢測結(jié)果對比分析如下尿液和陰道拭子MG-SAT結(jié)果合計陽性陰性尿液和宮頸拭子MG-SAT結(jié)果陽性39443陰性5249254合計44253297女性同一患者樣本一致性符合率=(39+249)/297*100%=96.97%2021/10/1030SAT檢測利于用藥監(jiān)測與判愈RNA很快降解用藥監(jiān)測和判愈提高醫(yī)院診療水平降低患者診治成本檢測方法可否監(jiān)測原因鏡檢法否不能判斷是否活菌培養(yǎng)法是盡管活菌才能培養(yǎng)，但靈敏不足金標法否假陰性率偏高PCR否有效治療后,細菌DNA至少需要3周降解SAT是有效治療后,細菌2021/10/1031SAT—MG檢測給臨床帶來意義

特點獲益兼顧拭子及尿液樣本檢測1擴大了患者類型（孕婦、未婚女性及未成年人）2減輕病人痛苦，保護隱私（男性患者）3降低了醫(yī)生的工作量4無創(chuàng)式取樣，減少取樣帶來的風險靶標為16SrRNA靈敏度高、特異性強，保證了結(jié)果的準確性，提高了醫(yī)院的診療水平，避免了診斷錯誤帶來的醫(yī)療糾紛病原體死亡，RNA很快降解:與臨床相關(guān)性好1可以