微生物的接種、分離和培養(yǎng)

-.z.實驗六微生物的接種、別離和培養(yǎng)一、目的要求1．理解和掌握微生物接種、別離根本技術(shù)的原理及操作要領(lǐng)。2．熟悉微生物接種、別離的無菌操作過程。3．了解微生物需氧培養(yǎng)的方法。4．學會觀察和描述微生物的各種培養(yǎng)性狀。二、實驗原理1.微生物接種指將微生物純種或含菌材料轉(zhuǎn)移到另一營養(yǎng)基質(zhì)上的過程。根據(jù)不同的目的可采用的不同的接種方法，如平板劃線法、斜面劃線法、浸洗法、涂布法、傾注法、穿刺法、點植法和影印法。2.微生物別離指依據(jù)微生物的特征，采用各種方法從含菌樣品中獲得由單一個體〔如單一菌體或孢子〕或一段菌絲生長繁殖形成的微生物群體的過程。常用的別離方法有：平板劃線法、稀釋涂布平板別離法、稀釋傾注平板別離法和單細胞別離法。平板別離法的根本原理包括兩個方面：〔1〕選擇適合于待別離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或參加*種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物?！?〕微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。值得指出的是從微生物群體中經(jīng)別離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)確實定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列的別離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。3.微生物培養(yǎng)指微生物被接種到營養(yǎng)基質(zhì)后，在一定條件下生長繁殖的過程，分需氧培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。本實驗所做的需氧培養(yǎng)法，是采用生化培養(yǎng)箱和恒溫搖床進展的。4.微生物的培養(yǎng)形狀培養(yǎng)性狀是微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的群體形態(tài)和生長情況。平板菌落特征、斜面和液體培養(yǎng)特征、半固體穿刺培養(yǎng)特征等培養(yǎng)性狀，是鑒定微生物的重要形態(tài)學依據(jù)。菌落是由單個或少數(shù)細胞在固體培養(yǎng)基外表或里面生長繁殖所形成的眼可見的子細胞群體。菌落形態(tài)會因菌種不同或菌種一樣但所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間等條件不同而存在不同程度的差異。假設(shè)所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間等條件一樣，則同一種菌所形成的菌落形態(tài)具有相對的穩(wěn)定性和專一性。三、實驗材料1.菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，啤酒酵母〔Saccharomycescerevisiae〕，熱帶假絲酵母〔Candidatropicalis〕，毛霉(Mucorsp.)，根霉〔Rhizopussp.〕，黑曲霉(A.niger)，青霉(Penicilliumsp.)，混合菌液。2.培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂斜面和平板，半固體營養(yǎng)瓊脂直立柱，PDA斜面和平板。3.接種工具接種環(huán)，接種針，涂布棒，無菌吸管等。4.其他酒精燈，生化培養(yǎng)箱等。四、實驗方法與步驟〔一〕實驗工程接種前的準備：接種的試管、培養(yǎng)皿等應(yīng)做好標記，注明菌種的名稱，日期、接種者等。表6-1實驗工程實驗工程所用菌種所用培養(yǎng)基方法提示名稱用量接種方法1.平板劃線法金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂平板1皿左手拿平板，并負責掀開皿蓋；右手持接種環(huán)，取菌后在平板上劃線。熱帶假絲酵母PDA1皿2.斜面劃線法枯草桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面1管左手拿管，菌種管在外側(cè)；右手持接種環(huán)，取菌后參照圖7—1在斜面上劃線。啤酒酵母PDA斜面1管3.涂布法大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂平板1皿取0.1mL菌液參加到平板上→用滅菌涂布棒涂開涂勻4.穿刺法枯草桿菌半固體營養(yǎng)瓊脂各一管用接種針取少許菌→垂直由下而上扦入半固體培養(yǎng)基→原路退針金黃色葡萄球菌5.點植法毛霉、根霉PDA各一皿取少許菌→分點點在斜面或平板上黑曲霉、青霉別離方法1.平板劃線別離法混合菌滴營養(yǎng)瓊脂平板2皿左手拿平板，并負責開啟皿蓋，右手持接種環(huán)，取菌少許后在平板上作分區(qū)劃線。別離方法2.稀釋傾注平板別離法大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂平板1皿取稀釋好的菌液1mL參加滅菌的空平皿參加15mL45℃的融化瓊脂，水平轉(zhuǎn)動平皿3.稀釋涂布平板別離法大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂平板1皿取稀釋好的菌液0.1mL參加到平板上→用滅菌涂布棒涂開涂勻〔二〕各種接種方法的操作步驟所有待接種的培養(yǎng)基在接種前都要先貼好標簽，整個接種過程都必須在酒精燈旁進展。1．斜面接種斜面接種是從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一支新鮮斜面培養(yǎng)基上的一種接種方法。具體操作如下：〔1〕操作前，先用75%酒精擦手，待酒精揮發(fā)后才能點燃酒精燈?！?〕用斜面進展接種時，將原菌種管和待轉(zhuǎn)接斜面試管夾在左手的大拇指和其它四指之間，斜面朝上，并處于水平位置?！矆D6-1，1〕123456圖6-1斜面劃線接種示意圖〔3〕先將原菌種管和待轉(zhuǎn)接斜面試管的硅膠塞旋轉(zhuǎn)一下，以便接種時便于拔出。〔4〕右手拿接種環(huán)〔與日常拿筆一樣〕在火焰上將環(huán)金屬絲局部燒紅滅菌，然后將其余要伸入試管局部的金屬柄也反復通過火焰滅菌。〔圖6-1，2〕〔5〕用右手小指、無名指或手掌將原菌種管和待轉(zhuǎn)接斜面試管的硅膠塞同時拔出并把硅膠塞握住，不得任意放在桌上或與其它物品相接觸，再以火焰燒管口〔圖6-1，3〕。〔6〕將上述在火焰上滅菌過的接種環(huán)伸入菌種管，接種環(huán)在接觸菌種前先在試管壁上或未長菌落的培養(yǎng)基面上接觸一下，使接種環(huán)充分冷卻，以免燙死菌種，然后用接種環(huán)輕輕沾取少量菌苔，接著將接種環(huán)自菌種管抽出。抽出時勿與管壁相碰，也勿通過火焰〔圖6-1，4〕?！?〕迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面試管中，自斜面培養(yǎng)基底部向上劃線，使菌體沾附在培養(yǎng)基的斜面上，劃線時環(huán)要平放，勿用力，否則會使培養(yǎng)基外表劃破〔圖6-1，5〕〔8〕接種完畢后將接種環(huán)抽出，灼燒一下管口，塞上硅膠塞，塞棉塞時勿要用試管口去迎棉塞，以免試管在移動時納入不潔空氣?！矆D6-1，6〕?！?〕接種環(huán)放回原處前要在火焰上徹底滅菌，接種致病菌時更要注意這點。將棉塞旋緊。注意：棉塞與火焰的距離要適當，以免棉塞燃燒。2．穿刺接種〔1〕操作方法見圖6-2，可以水平穿刺，也可以垂直穿刺，所使用的接種針要筆直。〔2〕將接種針自培養(yǎng)基中心刺入，直到接近管底，但勿穿透，然后沿原穿刺途徑慢慢拔出。圖6-2穿刺接種示意圖3．平板接種〔1〕劃線接種見別離劃線法?！?〕涂布接種用無菌吸管吸卻菌液注入平板后，用滅菌的玻璃在平板外表作均勻涂布〔圖7-3〕。〔3〕三點接種法①標明三點位置：欲使點接的三點分布均勻，可用記號筆先在平板底部以等邊三角形狀標上三點。②取接種針：拿接種針，先在火焰上燒紅滅菌，并在平板培養(yǎng)基的邊緣冷卻且蘸濕。③沾取孢子：將滅過菌并蘸濕的接種針伸入菌種管,用針尖沾取少量霉菌孢子。④點接：操作方法根本同穿刺接種，以垂直法或水平法把接種針上沾著的孢子以垂直的方向輕輕的點接到平板培養(yǎng)基外表預(yù)先做好標記的部位。注意在點接時切勿刺破培養(yǎng)基。4．別離方法〔1〕涂布平板別離法涂布平板別離法是樣品經(jīng)過適當稀釋后，用無菌吸管吸取0.1mL于固體培養(yǎng)基平板中，用無菌玻璃涂棒將稀釋液均勻地涂布，使樣品中的菌體經(jīng)過培養(yǎng)后能在平板外表上形成單個菌落。〔圖6-3〕〔2〕稀釋傾注平板別離法傾注平板別離法是最常用的純種別離法,先將待別離的材料作一系列的稀釋〔如1:10,1:100,1:1000,1:10,000……),然后分別取不同稀釋液少許〔一般取0.1mL〕,與已熔化并冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基相混合,搖勻后,傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中,待瓊脂凝固后,保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落.如果稀釋得當,平皿上就可出現(xiàn)分散的單個菌落,這個菌落可能就是由一個細胞繁殖形成的.隨后挑取該單個菌落,或重復以上操作數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)?！矆D6-4〕〔3〕平板劃線別離法劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進展稀釋，使之形成單個菌落。常用的劃線方法有以下二種：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線1～2條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線局部作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線局部作第三次劃線和通過第三次平行劃線局部作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)?！矆D6-5〕將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。圖6-3稀釋涂布平板別離法圖6-4稀釋傾注平板別離法a〔適用于濃度較低的菌液〕b〔適用于濃度較高的菌液〕圖6-5平板劃線別離法〔三〕培養(yǎng)細菌于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，24h后開場觀察生長情況。酵母菌、霉菌28℃恒溫箱中培養(yǎng)，48h后開場觀察生長情況。注意：平板應(yīng)倒置培養(yǎng)?！菜摹澄⑸锱囵B(yǎng)形狀觀察參照下表容，認真觀察和記錄接種的各種細菌、酵母菌、霉菌的培養(yǎng)性狀。表6-2微生物培養(yǎng)性狀觀察容常用描述述語平板菌落特征大小微菌落〔﹤1mm〉、小菌落〔1—2mm〕、中等大菌落〔2—4mm〕、大菌落〔4—6mm〕、巨大菌落〔﹥6mm〕形態(tài)圓形、假根狀、不規(guī)則狀、絲狀、卷發(fā)狀、菌絲狀等隆起度擴展、稍起凸、隆起、凸面、乳頭狀等邊緣整齊、缺刻狀、圓鋸齒形、波狀、裂葉狀等透明度透明、半透明、不透明外表形狀平滑、粗糙、顆粒狀、同心環(huán)狀、放射狀、絲狀、樹狀等外表光澤閃光、不閃光、金屬光澤等顏色無色、灰白色、金黃色、紅色、黑色等質(zhì)地粘液狀、蠟狀、枯燥、濕潤等〔劃直線接種〕斜面培養(yǎng)性狀生長程度生長良好、微弱、不生長菌苔形態(tài)線狀、串珠狀、根狀、擴展狀、棘狀菌苔隆起度扁平、凸起外表形態(tài)平滑、粗糙、顆粒狀等透明度透明、半透明、不透明質(zhì)地粘液狀、臘狀、枯燥、濕潤顏色無色、灰白色、金黃色、紅色、黑色刺培養(yǎng)性狀半固體穿生長程度良好、較好、一般、微弱、不生長沿穿刺線生長形狀線狀、棘狀、珠狀、絨毛狀、根狀、擴散生長圖6-6菌落形態(tài)特征菌落總體形狀和邊緣狀況可由菌落上方俯視觀察，而菌落高度則由平板邊緣水平觀察。圖6-7細菌菌落的隆起度〔A〕邊緣〔B〕、外表形狀及透明度〔C〕圖6-8細菌在瓊脂培養(yǎng)基中穿刺圖6-9細菌在明膠培養(yǎng)基中穿刺培養(yǎng)的生長特征培養(yǎng)并液化明膠的特征〔a〕絲狀；〔b〕有小刺；〔c〕念珠狀；〔a〕不液化；〔b〕火山口狀；〔c〕蕪箐狀；〔d〕絨毛狀；〔e〕假根狀；〔f〕樹狀〔d〕漏斗狀；〔e〕袋狀〔f〕層狀五、實驗結(jié)果分"菌種名稱、培養(yǎng)基名稱、接種方法、培養(yǎng)溫度、及時間、培養(yǎng)性狀描述〞等欄目，制表記錄觀察結(jié)果。六、實驗思考題1.微生物接種方法的共同點是什么？據(jù)此可否想出其它接種方法"2.假設(shè)沒有接種環(huán)，可否用別的接種工具照樣接種？3.平板劃線別離純種的依據(jù)是什么"操作中應(yīng)該特別注意哪些環(huán)節(jié)？4.傾注平板用的瓊脂培養(yǎng)基為何要冷卻至45℃5."無菌操作〞在微生物接種、別離工作中有何意義？6.假設(shè)沒有電熱恒溫培養(yǎng)設(shè)備，可否另想方法也能使接種在培養(yǎng)基上的微生物照樣生長？7.如何區(qū)別*種菌產(chǎn)生的是水溶性色素還是非水溶性色素？8.混濁度〔OD560值〕一樣、體積相等的大腸桿菌菌液和啤酒酵母菌液所含的菌數(shù)是否一樣？為什么？9.同一種菌在同一平板上所形成的菌落會否一樣大？七、考前須知1．微生物的接種、別離操作，最好在無菌室或無菌罩進展。假設(shè)在普通室做，酒精燈火焰應(yīng)稍大，要防止外來污染。2．平板或斜面的劃線要迅速、輕捷，不要劃破培養(yǎng)基。3．做平板分區(qū)劃線