上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件7、高通量測(cè)序技術(shù)的建立和臨床應(yīng)用 沈茜2016.3.22

高通量測(cè)序技術(shù)建立及臨床應(yīng)用沈

茜長海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科President

Barack

Obama

January

30,

2015“And

that’s

why

we’re

here

today.

Becausesomething

called

precision

medicine

…

gives

us

oneof

the

greatest

opportunities

for

new

medicalbreakthroughs

thatwe

have

ever

seen.”The

President’s

Precision

Medicine

Initiative(PMI)

Mission

Statement通過研究、技術(shù)和政策，使患者、研究人員和供應(yīng)商共同努力，朝著個(gè)性化治療新的醫(yī)學(xué)時(shí)代發(fā)展。2015-3-20科學(xué)優(yōu)先級(jí):n

癌癥臨床試驗(yàn)l

擴(kuò)大精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)成功的案例應(yīng)用n

大型隊(duì)列研究l

100萬或更多的美國人共享研究與健康數(shù)據(jù)l

推動(dòng)疾病的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)n

標(biāo)準(zhǔn)和資源開發(fā)政策重點(diǎn)：n

簡(jiǎn)化基因組技術(shù)的監(jiān)管審查n

確保足夠的隱私保護(hù)措施Proposed

FY16

BudgetAgency$

MillionNIH（美國國立衛(wèi)生研究院），用

于首批志愿者的招募和測(cè)序；$

130$

10FDA，在需要協(xié)調(diào)“精準(zhǔn)醫(yī)療”項(xiàng)目時(shí)，允許其引進(jìn)相關(guān)的技術(shù)和專家；國家協(xié)調(diào)委員會(huì)衛(wèi)生信息技術(shù)部用來建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，致力于保障精準(zhǔn)醫(yī)療患者的健康隱私和數(shù)據(jù)信息安全。$

5NIH的癌癥研究所，用于解碼腫瘤基因及助力開發(fā)新的療法；$

70CFDA衛(wèi)計(jì)委2014.12014.3明確二代測(cè)序產(chǎn)品的分類即將發(fā)放二代測(cè)序試點(diǎn)單位2014.22014.8試點(diǎn)單位評(píng)估工作2015.4批準(zhǔn)華大基因等NIPT資格加強(qiáng)臨床產(chǎn)品的服務(wù)監(jiān)管，叫停無證服務(wù)正式批準(zhǔn)無創(chuàng)性產(chǎn)篩、遺傳性疾病、胚胎植入前篩查和腫瘤診斷4項(xiàng)試點(diǎn)單位。頒發(fā)證書2015年3月11日，科技部召開國家首次精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)戰(zhàn)略專家會(huì)議，精準(zhǔn)醫(yī)療計(jì)劃將在今明兩年啟動(dòng)。在2030年前，中國精準(zhǔn)醫(yī)療將投入600億元，其中中央政府支付200億元，企業(yè)和地方財(cái)政配套400億元。中國實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃的戰(zhàn)略意義n

提高疾病診治水平，惠及民生與國民健康;n

推動(dòng)醫(yī)學(xué)科技前沿發(fā)展，增強(qiáng)國際競(jìng)爭(zhēng)力;n

發(fā)展醫(yī)藥生物技術(shù)，促進(jìn)醫(yī)療體制改革;n

形成經(jīng)濟(jì)新增長點(diǎn)，帶動(dòng)大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的組成高通量基因測(cè)序和分析疾病發(fā)病機(jī)制臨床疾病分子分型與診治標(biāo)記物藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)臨床隊(duì)列與生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)明確每一個(gè)患者的靶向治療臨床診斷分子檢測(cè)技術(shù)治療與基因改變匹配靶分子檢測(cè)和鑒定一、實(shí)驗(yàn)室布局要求我們現(xiàn)在的單向通道單向通道PCR室樣本制備乳化擴(kuò)增區(qū)區(qū)文庫構(gòu)建區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖緩沖緩沖測(cè)序區(qū)單向通道DNA打斷區(qū)質(zhì)檢室二、組織架構(gòu)長海醫(yī)院其他職能部門醫(yī)教部/醫(yī)療科臨床科室

臨床科室

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心

病理科病理鑒定及報(bào)告審核臨床需求病例

測(cè)序?qū)嶒?yàn)三、崗位配置l

定崗定位收樣及測(cè)序組

數(shù)據(jù)分析組

實(shí)驗(yàn)報(bào)告組明確責(zé)認(rèn)ll

問題回溯樣本接收及處理數(shù)據(jù)分析

1建庫報(bào)告撰寫數(shù)據(jù)審核病理科主任數(shù)據(jù)分析

2上機(jī)對(duì)報(bào)告最終審核樣本質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)質(zhì)控下機(jī)數(shù)據(jù)審核五、人員資質(zhì)及培訓(xùn)n

實(shí)驗(yàn)室管理和技術(shù)人員的專業(yè)、學(xué)術(shù)水平、教育培訓(xùn)情況需符合要求；n

測(cè)序操作人員需獲得儀器操作的培訓(xùn)合格證書；n

除參加外部培訓(xùn)，也建立內(nèi)部培訓(xùn)機(jī)制，對(duì)每個(gè)人制定培訓(xùn)計(jì)劃和目標(biāo)，經(jīng)崗位操作考核后上崗。姓名專業(yè)學(xué)歷證書郭瀛軍遺傳學(xué)博士

基因擴(kuò)增PCR上崗證博士

基因擴(kuò)增PCR上崗證生物信息學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)李

晶喻

東程春燕生物信息學(xué)細(xì)胞生物學(xué)博士博士/NGS應(yīng)用及操作培訓(xùn)證基因擴(kuò)增PCR上崗證,遺傳咨詢師培訓(xùn)李

爽生物科學(xué)本科生物化學(xué)與分子生物學(xué)基因擴(kuò)增PCR上崗證,遺傳咨詢師培訓(xùn)徐本梅楊

旭碩士碩士生物化學(xué)與分子生物學(xué)NGS應(yīng)用及操作培訓(xùn)證六、技術(shù)平臺(tái)實(shí)時(shí)備份確保安全有效管理機(jī)柜：9個(gè)CloudBase

C200刀片節(jié)點(diǎn)：40個(gè)雙路計(jì)算刀片計(jì)算核心：960+96CPU核ParaStor200超算平臺(tái)索引控制器集群數(shù)據(jù)控制CPU：2680-V3

Intel主頻2.5GHz刀片理論計(jì)算峰值：38.4萬億次網(wǎng)絡(luò)：56Gbps

FDR

infiniband存儲(chǔ)系統(tǒng)：800TB

ParaStor

200

分布式并行文件系統(tǒng)器集群百億級(jí)文件數(shù)量EB緩存儲(chǔ)容量七、軟件和數(shù)據(jù)庫高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理和分析依賴于各種數(shù)據(jù)分析軟件！數(shù)據(jù)分析和結(jié)果的解讀也依賴于多種數(shù)據(jù)庫！知識(shí)庫支撐軟件支撐八、數(shù)據(jù)管理數(shù)據(jù)分析及管理設(shè)置權(quán)限；病人信息及數(shù)據(jù)專人管理；測(cè)序數(shù)據(jù)按檢測(cè)項(xiàng)目分別存儲(chǔ)腫瘤個(gè)體化用藥檢測(cè)項(xiàng)目遺傳性乳腺癌易感基因檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)序數(shù)據(jù)直接傳到服務(wù)器原始數(shù)據(jù)，可讀不可寫ParaStor200并行存儲(chǔ)系統(tǒng)數(shù)據(jù)入庫直接分析n

下機(jī)數(shù)據(jù)直接上傳服務(wù)器，無需硬盤拷貝傳遞n

數(shù)據(jù)規(guī)范化存儲(chǔ)，檢測(cè)項(xiàng)目分類存儲(chǔ)n

設(shè)置原始數(shù)據(jù)權(quán)限，避免誤刪誤改n

ParaStor200并行存儲(chǔ)系統(tǒng)自動(dòng)實(shí)時(shí)備份九、質(zhì)量管理體系程序性管理文件（SMP）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)文件（QSP）一、檢測(cè)前乳腺癌易感基因檢測(cè)項(xiàng)目入組條件乳腺癌易感基因檢測(cè)乳腺癌患者乳腺癌家族史個(gè)體化用藥指導(dǎo)病人入組標(biāo)準(zhǔn)：晚期惡性腫瘤，經(jīng)常規(guī)臨床治療無效的患者一、檢測(cè)前檢測(cè)項(xiàng)目開展對(duì)臨床要求n

指定科室n

指定主診醫(yī)生n

意義及風(fēng)險(xiǎn)告知n

簽署知情同意金鋼教授盛湲教授張衛(wèi)教授胰腺外科主任

甲乳外科主任

肛腸外科主任臨床樣本的采集、運(yùn)輸及收樣樣本采集：遺傳性腫瘤篩查項(xiàng)目：全血>200μl個(gè)體化用藥靶向捕獲測(cè)序項(xiàng)目：病理醫(yī)師評(píng)估富集腫瘤組織，

≥0.5cm3樣本運(yùn)輸：采集后的樣本立刻送到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，采集時(shí)間和收樣時(shí)間之間不超過8h；每次使用前后對(duì)生物樣本運(yùn)輸盒進(jìn)行消毒處理。樣本拒收：溶血判斷：對(duì)核酸擴(kuò)增質(zhì)量干擾因素脂血判斷：對(duì)DNA提取質(zhì)量的干擾樣本接收管理樣本唯一標(biāo)識(shí)碼掃碼確認(rèn)放入規(guī)定的試管架臨床樣本保存時(shí)間：2年放入低溫冰箱二、室間質(zhì)評(píng)2015NIPT室間質(zhì)評(píng)2015腫瘤診斷與治療高通量測(cè)序檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)促進(jìn)平臺(tái)建設(shè)原因分析質(zhì)控品是技術(shù)關(guān)鍵n

漏報(bào)突變1（EGFR），我們采取Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，干擾了我們的生信結(jié)果。n

漏檢突變2（PIK3CA），測(cè)序覆蓋深度比較低，該區(qū)域243條有效Reads覆蓋，去重后數(shù)據(jù)為140條Reads覆蓋，所以要優(yōu)化建庫條件。上報(bào)結(jié)果：n

突變漏報(bào)n

融合基因漏檢n

漏檢一個(gè)突變（KRAS），后來對(duì)平臺(tái)的方法學(xué)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)當(dāng)時(shí)流程的檢測(cè)下限5%MAF，而這個(gè)位點(diǎn)僅為1%。三、分析性能驗(yàn)證NGS方法學(xué)體系建立的流程圖Gargis

AS,

Kalman

L,

Berry

MW

et

al.

(2012)

Assuring

the

quality

of

next-generationsequencing

in

clinical

laboratory

practice.

Nature

biotechnology

30,

1033-1036.驗(yàn)證思路廠家驗(yàn)證項(xiàng)目驗(yàn)證生信驗(yàn)證生信驗(yàn)證參考依據(jù)Frampton

GM,

Fichtenholtz

A,

Otto

GA

et

al.

(2013)

Development

and

va

lidat

ion

of

aclinical

cancer

genomic

profiling

test

based

on

massively

parallel

DNA

sequencing.Nature

biotechnology

31,

1023-1031.生信驗(yàn)證參比數(shù)據(jù)滿足性能驗(yàn)證需求l

準(zhǔn)確性n

標(biāo)準(zhǔn)答案唯一1000

Genome

Projectl

特異性n

數(shù)據(jù)質(zhì)量高n

FM驗(yàn)證合格/l

靈敏性l

線性范圍NA07014NA10840NA18595NA18957NA18488NA18511NA18867NA18924NA19108NA19114突變1

突變2

突變

突變

突變534細(xì)胞系MAF

MAF

MAF

MAF

MAF100%

50%

30%

10%

5%生信驗(yàn)證n

參比數(shù)據(jù)n

電子公共數(shù)據(jù)（electronic

data）ü

Foundation

One

數(shù)據(jù)n

三大主體分析流程SamtoolsVarscanG

ATKhttp://samtools.sourceforg

http://varscan.sourceforge.

http://www.broadinstitute.o/net/rg/gatkBROADWUSTLBROAD驗(yàn)證流程方法和考察指標(biāo)優(yōu)化參數(shù)前下載數(shù)據(jù)/sraGATKVarScan參數(shù)優(yōu)化優(yōu)化參數(shù)后精確性靈敏度驗(yàn)證后的生信分析流程固化生信流程測(cè)序原始數(shù)據(jù)（Fastq文件）數(shù)據(jù)質(zhì)控1數(shù)據(jù)質(zhì)控2有效數(shù)據(jù)（Fastq文件）SAM文件BAM文件排序、去重重比對(duì)、堿基質(zhì)量校正VarScan變異檢測(cè)變異過濾、初級(jí)注釋、過濾變異位點(diǎn)項(xiàng)目驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞株濕性實(shí)驗(yàn)室干性實(shí)驗(yàn)室n

參比序列：已知突變的腫瘤細(xì)胞株n

兩大主體：濕性實(shí)驗(yàn)+干性實(shí)驗(yàn)n

方法：基因變異檢測(cè)n

平臺(tái)：Life

Ion

Torrentn

指標(biāo):

精確性+特異性+線性范圍突變結(jié)果項(xiàng)目驗(yàn)證參比序列腫瘤細(xì)胞株（/）正常人細(xì)胞株()在采購少而貴商品化參比序列（/）質(zhì)控細(xì)胞株的選擇RL95-2陽性結(jié)果BRCA2

p.K2551Ec.7651A>G,

PTEN

p.R173Hc.518G>A,

PTEN

p.M134I

c.402G>TAsPC-1陰性對(duì)照-*3陰性樣本陰性細(xì)胞株理想質(zhì)控品思考點(diǎn)1：支原體檢測(cè)*3*3陰性細(xì)胞株陰性細(xì)胞株混合陽性性細(xì)胞株*3*3陰性細(xì)胞株陰性細(xì)胞株陽性性細(xì)胞株l

準(zhǔn)確性l

靈敏性l

特異性線性范圍混合l4:1=20%;49:1=2%MAF*3陰性細(xì)胞株弱陽性樣本混合理想質(zhì)控品陽性性細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)序結(jié)果編號(hào)RL95-2

AsPC-1樣本編號(hào)

1000X最低數(shù)據(jù)量

實(shí)際數(shù)據(jù)量QC101QC102QC103QC201QC202QC203QC301QC302QC303QC401QC402QC40311000111111111QC101QC102QC103QC201QC202QC203QC301QC302QC303QC401QC402QC403300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M659M724M623M525M871M444M682M596M766M569M650M541M1444494949000變異檢測(cè)結(jié)果1:0Sensitivity100%Specificity100%QC101QC102QC103cv值100%100%100%100%靈敏度和特異性統(tǒng)計(jì)0:1Sensitivity100%Specificity100%00QC401QC402QC403cv值100%100%4:1Sensitivity100%Specificity75%100%100%QC201QC202QC203cv值00100%100%66.7%100%all0.216262810.157459Sens96%SpecAver97%0.0830.08649:1QC301QC302QC303cvSensitivity100%Specificity100%Stdcv0.

1110.

115100%100%100%100%00四、濕性實(shí)驗(yàn)流程及質(zhì)控要點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)一：DNA總量＞1μgOD（260/280):1.8-2.0電泳：?jiǎn)我粭l帶質(zhì)控點(diǎn)二：打斷片段：50-250bp，主峰在150bp左右四、濕性實(shí)驗(yàn)流程及質(zhì)控要點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)三：Pre-PCR:

100-300bp,主峰在200bp左右質(zhì)控點(diǎn)四：Q-PCR定量：文庫稀釋到100PM五、生信數(shù)據(jù)質(zhì)量控制點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn)

1：有效數(shù)據(jù)n

若數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估為通過或警告，則表明重測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可以進(jìn)行下一步分析；n

若數(shù)據(jù)質(zhì)量不合格，則需對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行過濾處理，然后進(jìn)行重新評(píng)估；n

若過濾后仍不合格，則需反饋濕性實(shí)驗(yàn)室，要求重測(cè)序。質(zhì)控點(diǎn)

2：比對(duì)文件數(shù)據(jù)量不足：濕性實(shí)驗(yàn)補(bǔ)測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì)質(zhì)量報(bào)告參數(shù)實(shí)際值參考>400(151)>200(19)靶向區(qū)域測(cè)序深度253.9397.10%94.80%95.80%5.42%靶向區(qū)域覆蓋率>95%>90%>95%<20%>99%靶向區(qū)域內(nèi)深度在20X以上的區(qū)域靶向區(qū)域內(nèi)深度在10X以上的區(qū)域靶向區(qū)域內(nèi)的重復(fù)讀長的比例靶向區(qū)域內(nèi)特異讀長比例99.2%六、報(bào)告注釋VCF文件輸入變異篩選：去除無用或雜亂信息Filter：PASSDepth（DP）>10Func.RefGene：exonicExonicFunc.refGene：去除synonymous

SNV高級(jí)注釋?

注釋信息匯總、去冗余等，得到最終的注釋結(jié)果。?

撰寫檢測(cè)報(bào)告。七、項(xiàng)目開展情況項(xiàng)目一：腫瘤個(gè)體化用藥檢測(cè)ClearSeq

Comprehensive

CancerThis

panel

targets

151

key

disease-associatedgenes

that

have

been

implicated

in

studies

of

a

widerange

of

cancers

(eg.

breast,

lung,

colorectal,

AML)and

is

designed

for

deep

coverage

of

ta