上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件7、高通量測序技術(shù)的建立和臨床應(yīng)用 沈茜2016.3.22

高通量測序技術(shù)建立及臨床應(yīng)用沈

茜長海醫(yī)院實驗診斷科President

Barack

Obama

January

30,

2015“And

that’s

why

we’re

here

today.

Becausesomething

called

precision

medicine

…

gives

us

oneof

the

greatest

opportunities

for

new

medicalbreakthroughs

thatwe

have

ever

seen.”The

President’s

Precision

Medicine

Initiative(PMI)

Mission

Statement通過研究、技術(shù)和政策，使患者、研究人員和供應(yīng)商共同努力，朝著個性化治療新的醫(yī)學(xué)時代發(fā)展。2015-3-20科學(xué)優(yōu)先級:n

癌癥臨床試驗l

擴大精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)成功的案例應(yīng)用n

大型隊列研究l

100萬或更多的美國人共享研究與健康數(shù)據(jù)l

推動疾病的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)n

標(biāo)準(zhǔn)和資源開發(fā)政策重點：n

簡化基因組技術(shù)的監(jiān)管審查n

確保足夠的隱私保護措施Proposed

FY16

BudgetAgency$

MillionNIH（美國國立衛(wèi)生研究院），用

于首批志愿者的招募和測序；$

130$

10FDA，在需要協(xié)調(diào)“精準(zhǔn)醫(yī)療”項目時，允許其引進相關(guān)的技術(shù)和專家；國家協(xié)調(diào)委員會衛(wèi)生信息技術(shù)部用來建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，致力于保障精準(zhǔn)醫(yī)療患者的健康隱私和數(shù)據(jù)信息安全。$

5NIH的癌癥研究所，用于解碼腫瘤基因及助力開發(fā)新的療法；$

70CFDA衛(wèi)計委2014.12014.3明確二代測序產(chǎn)品的分類即將發(fā)放二代測序試點單位2014.22014.8試點單位評估工作2015.4批準(zhǔn)華大基因等NIPT資格加強臨床產(chǎn)品的服務(wù)監(jiān)管，叫停無證服務(wù)正式批準(zhǔn)無創(chuàng)性產(chǎn)篩、遺傳性疾病、胚胎植入前篩查和腫瘤診斷4項試點單位。頒發(fā)證書2015年3月11日，科技部召開國家首次精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)戰(zhàn)略專家會議，精準(zhǔn)醫(yī)療計劃將在今明兩年啟動。在2030年前，中國精準(zhǔn)醫(yī)療將投入600億元，其中中央政府支付200億元，企業(yè)和地方財政配套400億元。中國實施精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計劃的戰(zhàn)略意義n

提高疾病診治水平，惠及民生與國民健康;n

推動醫(yī)學(xué)科技前沿發(fā)展，增強國際競爭力;n

發(fā)展醫(yī)藥生物技術(shù)，促進醫(yī)療體制改革;n

形成經(jīng)濟新增長點，帶動大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的組成高通量基因測序和分析疾病發(fā)病機制臨床疾病分子分型與診治標(biāo)記物藥物設(shè)計靶點臨床隊列與生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)明確每一個患者的靶向治療臨床診斷分子檢測技術(shù)治療與基因改變匹配靶分子檢測和鑒定一、實驗室布局要求我們現(xiàn)在的單向通道單向通道PCR室樣本制備乳化擴增區(qū)區(qū)文庫構(gòu)建區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)緩沖緩沖緩沖測序區(qū)單向通道DNA打斷區(qū)質(zhì)檢室二、組織架構(gòu)長海醫(yī)院其他職能部門醫(yī)教部/醫(yī)療科臨床科室

臨床科室

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心

病理科病理鑒定及報告審核臨床需求病例

測序?qū)嶒炄?、崗位配置l

定崗定位收樣及測序組

數(shù)據(jù)分析組

實驗報告組明確責(zé)認(rèn)ll

問題回溯樣本接收及處理數(shù)據(jù)分析

1建庫報告撰寫數(shù)據(jù)審核病理科主任數(shù)據(jù)分析

2上機對報告最終審核樣本質(zhì)控數(shù)據(jù)質(zhì)控下機數(shù)據(jù)審核五、人員資質(zhì)及培訓(xùn)n

實驗室管理和技術(shù)人員的專業(yè)、學(xué)術(shù)水平、教育培訓(xùn)情況需符合要求；n

測序操作人員需獲得儀器操作的培訓(xùn)合格證書；n

除參加外部培訓(xùn)，也建立內(nèi)部培訓(xùn)機制，對每個人制定培訓(xùn)計劃和目標(biāo)，經(jīng)崗位操作考核后上崗。姓名專業(yè)學(xué)歷證書郭瀛軍遺傳學(xué)博士

基因擴增PCR上崗證博士

基因擴增PCR上崗證生物信息學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)李

晶喻

東程春燕生物信息學(xué)細胞生物學(xué)博士博士/NGS應(yīng)用及操作培訓(xùn)證基因擴增PCR上崗證,遺傳咨詢師培訓(xùn)李

爽生物科學(xué)本科生物化學(xué)與分子生物學(xué)基因擴增PCR上崗證,遺傳咨詢師培訓(xùn)徐本梅楊

旭碩士碩士生物化學(xué)與分子生物學(xué)NGS應(yīng)用及操作培訓(xùn)證六、技術(shù)平臺實時備份確保安全有效管理機柜：9個CloudBase

C200刀片節(jié)點：40個雙路計算刀片計算核心：960+96CPU核ParaStor200超算平臺索引控制器集群數(shù)據(jù)控制CPU：2680-V3

Intel主頻2.5GHz刀片理論計算峰值：38.4萬億次網(wǎng)絡(luò)：56Gbps

FDR

infiniband存儲系統(tǒng)：800TB

ParaStor

200

分布式并行文件系統(tǒng)器集群百億級文件數(shù)量EB緩存儲容量七、軟件和數(shù)據(jù)庫高通量測序數(shù)據(jù)的處理和分析依賴于各種數(shù)據(jù)分析軟件！數(shù)據(jù)分析和結(jié)果的解讀也依賴于多種數(shù)據(jù)庫！知識庫支撐軟件支撐八、數(shù)據(jù)管理數(shù)據(jù)分析及管理設(shè)置權(quán)限；病人信息及數(shù)據(jù)專人管理；測序數(shù)據(jù)按檢測項目分別存儲腫瘤個體化用藥檢測項目遺傳性乳腺癌易感基因檢測項目測序數(shù)據(jù)直接傳到服務(wù)器原始數(shù)據(jù)，可讀不可寫ParaStor200并行存儲系統(tǒng)數(shù)據(jù)入庫直接分析n

下機數(shù)據(jù)直接上傳服務(wù)器，無需硬盤拷貝傳遞n

數(shù)據(jù)規(guī)范化存儲，檢測項目分類存儲n

設(shè)置原始數(shù)據(jù)權(quán)限，避免誤刪誤改n

ParaStor200并行存儲系統(tǒng)自動實時備份九、質(zhì)量管理體系程序性管理文件（SMP）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)文件（QSP）一、檢測前乳腺癌易感基因檢測項目入組條件乳腺癌易感基因檢測乳腺癌患者乳腺癌家族史個體化用藥指導(dǎo)病人入組標(biāo)準(zhǔn)：晚期惡性腫瘤，經(jīng)常規(guī)臨床治療無效的患者一、檢測前檢測項目開展對臨床要求n

指定科室n

指定主診醫(yī)生n

意義及風(fēng)險告知n

簽署知情同意金鋼教授盛湲教授張衛(wèi)教授胰腺外科主任

甲乳外科主任

肛腸外科主任臨床樣本的采集、運輸及收樣樣本采集：遺傳性腫瘤篩查項目：全血>200μl個體化用藥靶向捕獲測序項目：病理醫(yī)師評估富集腫瘤組織，

≥0.5cm3樣本運輸：采集后的樣本立刻送到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，采集時間和收樣時間之間不超過8h；每次使用前后對生物樣本運輸盒進行消毒處理。樣本拒收：溶血判斷：對核酸擴增質(zhì)量干擾因素脂血判斷：對DNA提取質(zhì)量的干擾樣本接收管理樣本唯一標(biāo)識碼掃碼確認(rèn)放入規(guī)定的試管架臨床樣本保存時間：2年放入低溫冰箱二、室間質(zhì)評2015NIPT室間質(zhì)評2015腫瘤診斷與治療高通量測序檢測室間質(zhì)評促進平臺建設(shè)原因分析質(zhì)控品是技術(shù)關(guān)鍵n

漏報突變1（EGFR），我們采取Sanger測序法進行驗證，干擾了我們的生信結(jié)果。n

漏檢突變2（PIK3CA），測序覆蓋深度比較低，該區(qū)域243條有效Reads覆蓋，去重后數(shù)據(jù)為140條Reads覆蓋，所以要優(yōu)化建庫條件。上報結(jié)果：n

突變漏報n

融合基因漏檢n

漏檢一個突變（KRAS），后來對平臺的方法學(xué)驗證發(fā)現(xiàn)當(dāng)時流程的檢測下限5%MAF，而這個位點僅為1%。三、分析性能驗證NGS方法學(xué)體系建立的流程圖Gargis

AS,

Kalman

L,

Berry

MW

et

al.

(2012)

Assuring

the

quality

of

next-generationsequencing

in

clinical

laboratory

practice.

Nature

biotechnology

30,

1033-1036.驗證思路廠家驗證項目驗證生信驗證生信驗證參考依據(jù)Frampton

GM,

Fichtenholtz

A,

Otto

GA

et

al.

(2013)

Development

and

va

lidat

ion

of

aclinical

cancer

genomic

profiling

test

based

on

massively

parallel

DNA

sequencing.Nature

biotechnology

31,

1023-1031.生信驗證參比數(shù)據(jù)滿足性能驗證需求l

準(zhǔn)確性n

標(biāo)準(zhǔn)答案唯一1000

Genome

Projectl

特異性n

數(shù)據(jù)質(zhì)量高n

FM驗證合格/l

靈敏性l

線性范圍NA07014NA10840NA18595NA18957NA18488NA18511NA18867NA18924NA19108NA19114突變1

突變2

突變

突變

突變534細胞系MAF

MAF

MAF

MAF

MAF100%

50%

30%

10%

5%生信驗證n

參比數(shù)據(jù)n

電子公共數(shù)據(jù)（electronic

data）ü

Foundation

One

數(shù)據(jù)n

三大主體分析流程SamtoolsVarscanG

ATKhttp://samtools.sourceforg

http://varscan.sourceforge.

http://www.broadinstitute.o/net/rg/gatkBROADWUSTLBROAD驗證流程方法和考察指標(biāo)優(yōu)化參數(shù)前下載數(shù)據(jù)/sraGATKVarScan參數(shù)優(yōu)化優(yōu)化參數(shù)后精確性靈敏度驗證后的生信分析流程固化生信流程測序原始數(shù)據(jù)（Fastq文件）數(shù)據(jù)質(zhì)控1數(shù)據(jù)質(zhì)控2有效數(shù)據(jù)（Fastq文件）SAM文件BAM文件排序、去重重比對、堿基質(zhì)量校正VarScan變異檢測變異過濾、初級注釋、過濾變異位點項目驗證腫瘤細胞株濕性實驗室干性實驗室n

參比序列：已知突變的腫瘤細胞株n

兩大主體：濕性實驗+干性實驗n

方法：基因變異檢測n

平臺：Life

Ion

Torrentn

指標(biāo):

精確性+特異性+線性范圍突變結(jié)果項目驗證參比序列腫瘤細胞株（/）正常人細胞株()在采購少而貴商品化參比序列（/）質(zhì)控細胞株的選擇RL95-2陽性結(jié)果BRCA2

p.K2551Ec.7651A>G,

PTEN

p.R173Hc.518G>A,

PTEN

p.M134I

c.402G>TAsPC-1陰性對照-*3陰性樣本陰性細胞株理想質(zhì)控品思考點1：支原體檢測*3*3陰性細胞株陰性細胞株混合陽性性細胞株*3*3陰性細胞株陰性細胞株陽性性細胞株l

準(zhǔn)確性l

靈敏性l

特異性線性范圍混合l4:1=20%;49:1=2%MAF*3陰性細胞株弱陽性樣本混合理想質(zhì)控品陽性性細胞株實驗設(shè)計測序結(jié)果編號RL95-2

AsPC-1樣本編號

1000X最低數(shù)據(jù)量

實際數(shù)據(jù)量QC101QC102QC103QC201QC202QC203QC301QC302QC303QC401QC402QC40311000111111111QC101QC102QC103QC201QC202QC203QC301QC302QC303QC401QC402QC403300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M300M659M724M623M525M871M444M682M596M766M569M650M541M1444494949000變異檢測結(jié)果1:0Sensitivity100%Specificity100%QC101QC102QC103cv值100%100%100%100%靈敏度和特異性統(tǒng)計0:1Sensitivity100%Specificity100%00QC401QC402QC403cv值100%100%4:1Sensitivity100%Specificity75%100%100%QC201QC202QC203cv值00100%100%66.7%100%all0.216262810.157459Sens96%SpecAver97%0.0830.08649:1QC301QC302QC303cvSensitivity100%Specificity100%Stdcv0.

1110.

115100%100%100%100%00四、濕性實驗流程及質(zhì)控要點質(zhì)控點一：DNA總量＞1μgOD（260/280):1.8-2.0電泳：單一條帶質(zhì)控點二：打斷片段：50-250bp，主峰在150bp左右四、濕性實驗流程及質(zhì)控要點質(zhì)控點三：Pre-PCR:

100-300bp,主峰在200bp左右質(zhì)控點四：Q-PCR定量：文庫稀釋到100PM五、生信數(shù)據(jù)質(zhì)量控制點質(zhì)控點

1：有效數(shù)據(jù)n

若數(shù)據(jù)質(zhì)量評估為通過或警告，則表明重測數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可以進行下一步分析；n

若數(shù)據(jù)質(zhì)量不合格，則需對數(shù)據(jù)質(zhì)量進行過濾處理，然后進行重新評估；n

若過濾后仍不合格，則需反饋濕性實驗室，要求重測序。質(zhì)控點

2：比對文件數(shù)據(jù)量不足：濕性實驗補測數(shù)據(jù)比對質(zhì)量報告參數(shù)實際值參考>400(151)>200(19)靶向區(qū)域測序深度253.9397.10%94.80%95.80%5.42%靶向區(qū)域覆蓋率>95%>90%>95%<20%>99%靶向區(qū)域內(nèi)深度在20X以上的區(qū)域靶向區(qū)域內(nèi)深度在10X以上的區(qū)域靶向區(qū)域內(nèi)的重復(fù)讀長的比例靶向區(qū)域內(nèi)特異讀長比例99.2%六、報告注釋VCF文件輸入變異篩選：去除無用或雜亂信息Filter：PASSDepth（DP）>10Func.RefGene：exonicExonicFunc.refGene：去除synonymous

SNV高級注釋?

注釋信息匯總、去冗余等，得到最終的注釋結(jié)果。?

撰寫檢測報告。七、項目開展情況項目一：腫瘤個體化用藥檢測ClearSeq

Comprehensive

CancerThis

panel

targets

151

key

disease-associatedgenes

that

have

been

implicated

in

studies

of

a

widerange

of

cancers

(eg.

breast,

lung,

colorectal,

AML)and

is

designed

for

deep

coverage

of

ta