上海市臨檢中心 臨床檢驗質量管理培訓 17沈佐君-分子診斷檢驗程序性能驗證指南解讀

分子診斷檢驗程序性能驗證指南解讀中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）沈佐君1范圍本指南適用于申請認可或已獲認可的醫(yī)學實驗室對分子診斷相關檢測程序進行性能驗證實驗活動時使用，也可供醫(yī)學實驗室評審員在現(xiàn)場評審過程中參考使用。本指南適用的分子診斷技術包括：PCR、Sanger測序、二代基因測序(NGS)、原位雜交等，其他分子診斷使用的檢驗程序/方法可參考使用。本文件適用于醫(yī)學實驗室采用的經確認的檢驗程序。注：鑒于實際臨床工作中進行分子診斷的樣本類型（如進行原位雜交的樣本有血液、羊水穿刺、腫瘤組織等）以及預期用途差別較大，而不同樣本類型對性能驗證的要求和難易程度差別較大，建議結合實際情況酌情選擇與之相符合的性能驗證方案。2

規(guī)范性引用文件下列文件對于本指南的應用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅該版本適用于本指南。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改部分）適用于本指南。WS/T

420-2013《臨床實驗室對商品定量試劑盒分析性能的驗證》WS/T

492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》WS/T

505-2017《定性測定性能評價指南》YY/T

1261-2015《HER2基因檢測試劑盒（熒光原位雜交法）》YY/T

1459-2016《人類基因原位雜交檢測試劑盒》3術語和定義對于本指南，GB/T

29791.1-2013/ISO

18113-1：2009）中的定義適用。下列術語和定義適用于本指南。3.1可報告范圍

reportable

range體外診斷醫(yī)療器械性能特征已被驗證的測量區(qū)間。[GB/T29791.1-2013/ISO18113-1：2009

3.46注1]4.

總則4.1性能驗證的時機4.1.1

檢驗程序常規(guī)應用前。4.1.2

任何嚴重影響檢測系統(tǒng)分析性能的情況發(fā)生后，應在檢測系統(tǒng)重新啟用前對受影響的性能進行部分性能驗證。影響檢測系統(tǒng)分析性能的情況可包括但不限于儀器主要部件故障，儀器搬遷，設施、環(huán)境的嚴重失控等。4.1.3

常規(guī)使用期間，實驗室可基于分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，利用日常工作產生的檢驗和質控數(shù)據(jù)，定期對檢驗程序的分析性能進行評審，應能滿足檢驗結果預期用途的要求。新檢測系統(tǒng)也包含現(xiàn)用檢測系統(tǒng)的任一要素（儀器、試劑、校準品等）變更，如試劑升級、儀器更新、校準品溯源性改變等應按照新系統(tǒng)來進行驗證。4.2性能驗證的參數(shù)分子診斷檢驗程序的性能參數(shù)主要包括PCR定性和定量檢測、Sanger測序、二代基因測序(NGS)和原位雜交等。PCR定量檢測選擇驗證的性能指標宜包括測量正確度、測量精密度（含測量重復性和測量中間精密度）、測量不確定度、分析特異性（含抗干擾能力）、分析靈敏度、檢出限和定量限、線性區(qū)間（可報告區(qū)間）等。PCR定性檢測選擇驗證的性能指標宜包括方法符合率、檢出限、抗干擾能力、交叉反應等。Sanger測序和NGS選擇驗證的性能指標宜包括方法符合率和檢出限等。原位雜交技術應依據(jù)樣本類型和預期用途，選用適宜的性能指標進行驗證，如基于完整細胞的原位雜交宜選用分析敏感性和特異性，基于組織的宜選用方法符合率。如果檢驗程序適用樣本類型包括血清與血漿，實驗室在臨床檢測時同時使用血清與血漿，應進行血清與血漿結果一致性的驗證。在腫瘤靶向基因檢測時，如果檢驗程序適用樣本類型包括除腫瘤組織/細胞以外的樣本（如血漿），應進行與腫瘤組織結果一致性的驗證。如果檢驗程序高度依賴人工操作或判斷，應進行不同操作人員間的驗證，驗證程序可參照本指南相關內容制定。實驗室應根據(jù)檢測項目的預期用途以及生產制造商聲明，選擇對檢測結果質量有重要影響的參數(shù)進行驗證。不同技術平臺、樣本類型以及預期用途不同時，所需驗證的性能指標宜有所側重。4.3

性能驗證的判斷標準實驗室應根據(jù)臨床需求選擇經確認的符合預期用途的檢驗程序。實驗室性能驗證結果的判斷標準是廠商或研發(fā)者在試劑盒或檢測系統(tǒng)說明書中聲明的性能指標。5實驗前準備樣本最好來自患者真實樣本，盡量與廠家建立性能指標時所用材料一致。當一份樣本需進行多次試驗時，對樣本進行分裝保存，避免反復凍融。5.1

實驗操作人員應熟悉方法原理與操作，包括樣本處理、校準、維護程序、質量控制，確保檢測系統(tǒng)工作狀態(tài)正常。5.2實驗室設施及環(huán)境符合分析系統(tǒng)工作要求。5.3儀器經過校準，各項性能指標合格。5.4試劑和校準品滿足要求。5.5負責實施性能驗證的人員應了解驗證方案，制定驗證計劃，并組織實施。5.6

涉及病理形態(tài)學的樣本（如組織、細胞學樣本等），需經符合資質的病理醫(yī)師于顯微鏡下確認符合相應要求后才可進行后續(xù)檢測。需要時,可行腫瘤細胞富集。5.7

若涉及核酸提取，應使用試劑盒配套或推薦的核酸提取試劑，并確保其提取效率滿足要求。核酸提取效率的評價宜包括：核酸濃度、純度及完整性。6性能驗證要求在常規(guī)應用前，應由實驗室對未加修改而使用的已確認的檢驗程序進行獨立驗證。已確認的檢驗程序是經國家衛(wèi)生管理部門批準的體外診斷醫(yī)療器械使用說明書中規(guī)定的程序，或國際公認標準或指南中規(guī)定的程序，或國家、地區(qū)法規(guī)中規(guī)定的程序。注：如果程序中含有與檢驗程序不適用的儀器、樣本類型、檢驗方法（包括核酸提取方法）或分析軟件的，則不屬于已確認的檢驗程序。6.1定性項目的性能驗證6.1.1

方法符合率6.1.1.1

驗證要求通過與參比方法進行比較。參比方法包括但不限于：金標準方法、行業(yè)公認方法、經驗證性能符合要求滿足臨床預期用途的方法（如：通過ISO15189認可實驗室使用的相同檢測方法）。6.1.1.2

驗證方案a）樣本：選取陰性樣本至少5例、陽性樣本（宜包含弱陽性/低擴增的樣本），一般不少于10例樣本。注1：罕見或少見病種的項目，可酌情減少樣本例數(shù)。注2：若弱陽性/低擴增樣本不好獲取，可用適當稀釋陽性樣本獲得類似的效果。注3：對于雜交檢測技術，若弱陽性/低擴增樣本不好獲取，可用不同比例的特定細胞系混合獲得類似的效果。陰性樣本中應包含與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的樣本。b）驗證方法：按照患者樣本檢測程序，采用參比方法和候選方法平行檢測。將所有檢測結果按下表匯總填表，計算符合率。表：方法符合率驗證參比方法總數(shù)陽性a陰性陽性陰性bda+bc+d候選方法總數(shù)ca+cb+da+b+c+d陽性符合率=a/(a+c)×100%陰性符合率=d/(b+d)×100%總符合率=(a+d)/(

a+b+c+d)×100%6.1.1.3

判斷標準參見

4.3。6.1.2

檢出限6.1.2.1

驗證要求所用檢驗程序在廠家試劑使用說明書等有聲明檢出限時，檢測項目在有標準物質時，或以定量形式表達定性結果時，應進行檢出限的驗證。6.1.2.2

驗證方案a）樣本：定值標準物質（如：國際參考品、國家參考品、廠家參考品）。對于報告具體基因型的方法，其選用的標準物質需包括所有的突變類型。對于檢測對象同時含有不同比例的不同基因型時，應設置多個梯度，主要從擴增反應終體系總核酸濃度和突變序列所占比例兩個方面進行評價。b）驗證方法：使用定值標準物質的樣本梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，可重復測定5次或在不同批內對該濃度樣本進行20次重復測定（如測定5天，每天測定4份樣本）。稀釋液可根據(jù)情況選用廠家提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗證的目標物必須陰性外，所含干擾物質濃度必須在廠家聲明的范圍之內。6.1.2.3

判斷標準如果是5次重復檢測，必須100%檢出靶核酸；如果是20次檢測，必須檢出至少18次靶核酸。示例1：NGS和Sanger測序

對于基因變異類型（如：SNV，indel，CNV，SV）的檢測，均應分別進行檢測限的驗證，以確定不同變異類型各自的檢測限。建議使用已知突變豐度的包含所有待檢測變異類型的經過福爾馬林固定石蠟包埋的細胞系混合物或臨床樣本，將其稀釋至廠家聲明的檢出限濃度，以及高于和低于該濃度一個梯度濃度，按照廠家聲明的測序深度對該系列濃度樣本進行測定（樣本總數(shù)不得少于5個，每個樣本檢測濃度不得少于3個），如果95%檢出限濃度以上的樣本檢測到可靠變異，則檢出限驗證通過。示例2：雜交

使用經合格病理醫(yī)師評估的接近最低檢測限的按照一定比例混合的細胞系沉降制片/或組織切片，在不同批內對樣本進行測定（如連續(xù)測定5天，每天測定4份樣本），如果90%以上樣本符合細胞系特性或與中心參考實驗室結果相同（必要時可原片復核（快遞或進行數(shù)字切片轉化），則測定下限驗證通過。需說明的是，此方法不適用原位雜交，原位雜交驗證見6.1.5。6.1.3

交叉反應6.1.3.1

驗證要求應驗證與檢測對象可能存在交叉反應的核酸物質對檢測的影響。對于病原體核酸檢測來說，主要指與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，宜在病原體感染的醫(yī)學決定水平進行驗證。對于報告具體基因型的方法，應在待測核酸濃度水平驗證其它基因型對待測核酸測定的影響。6.1.3.2

驗證方案對于病原體核酸檢測，取一定濃度與待測核酸可能存在交叉反應的病原體加入樣本保存液或經確認為陰性的樣本中，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復檢測3次；對于基因型檢測，取一定濃度經其它方法（如測序等）確認為其它基因型的樣本，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復檢測3次。6.1.3.3

判斷標準結果應為陰性。6.1.4

抗干擾能力6.1.4.1

驗證要求分子診斷常見的干擾物質主要包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白G、類風濕因子和藥物等。實驗室可根據(jù)臨床需求、廠家聲明和樣本特點（實際可能存在的干擾物質及達到的濃度）選擇需要驗證的干擾物質及濃度。需要時，也應評估抗凝劑和樣本保存液等對結果的影響。6.1.4.2

驗證方案實驗室可根據(jù)實際情況選擇驗證方案。方案1：實驗組為在弱陽性樣本中加入干擾物質溶液（對照組加入等量的溶劑），使得干擾物質的終濃度與廠家聲明的濃度相同，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復測定3次以上。方案2：選取含待驗證的高濃度水平干擾物質且經確認不含被測物的臨床樣本作為實驗組，選取含低濃度水平干擾物質且經確認不含被測物的臨床樣本作為對照組。分別在實驗組和對照組中加入弱陽性樣本（量小于10%），與常規(guī)樣本一樣處理，每組至少重復檢測3次。6.1.4.3

判斷標準方案1：弱陽性樣本檢測仍為弱陽性結果，則驗證通過。方案2：如果對照組和實驗組結果均為弱陽性，說明在驗證濃度下，干擾物質對測定無顯著影響。如果對照組結果為弱陽性，實驗組結果為陰性，說明在驗證濃度下，干擾物質對測定有顯著影響。6.1.5

原位雜交技術分析敏感性和特異性6.1.5.1

驗證要求至少200個與探針特定對應的基因組目標序列應被用來進行分析敏感性和特異性驗證。6.1.5.2

驗證方案樣本至少來自5個不同個體，至少50個（用于驗證遠離著絲粒的探針）或100個（用于驗證近著絲粒探針）含有與探針相對應的基因組目標序列的腫瘤細胞進行原位雜交檢測。6.1.5.3

判斷標準敏感性和特異性均不低于90%。6.2

定量項目性能驗證分子診斷定量檢測項目的性能驗證請參見CNAS-GLXX《臨床化學定量檢驗程序性能驗證指南》。6.3

特定性能驗證對于商品化的診斷試劑，一般情況下不需要驗證核酸提取效率。在樣本來源有限、樣本組成復雜、目的基因在樣本中含量低或懷疑提取試劑有質量問題時需要進行核酸提取效率驗證。如果懷疑PCR擴增系統(tǒng)有問題，則應進行擴增效率驗證。對于NGS，為保證結果的可靠性，避免因測序深度過低導致的結果假陰性或測序深度太高引起的假陽性，應進行測序深度參考區(qū)間、上機測序的性能和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的性能驗證。6.3.1

核酸提取效率6.3.1.1

驗證要求核酸提取效率包括核酸純度，核酸提取產率和完整性。6.3.1.2

驗證方案按照試劑盒要求，提取含有不同濃度待測核酸的樣本，核酸濃度宜覆蓋廠家聲明的可提取的核酸濃度。a）核酸純度：將核酸提取液用分光光度計測定A260/280比值。b）核酸提取產率：將含有待測物質的樣本平均分成2份，其中一份（A）加入一定體積（小于總體積10%）已知濃度的待測核酸，另一份（B）加入同體積核酸溶解液，按照試劑盒要求提取核酸，分別測定A和B提取的核酸量，按以下公式計算核酸提取得率，重復三次測定，計算平均值。A

?

B加入的待測核酸量核酸提取產率=×100%c）核酸完整性：按照試劑盒要求，提取含有不同濃度待測核酸的樣本，核酸濃度宜覆蓋廠家聲明的可提取的核酸濃度，取一定量的核酸提取液進行瓊脂糖凝膠電泳，與待測核酸標準物比較。6.3.1.3

判斷標準a）核酸純度：待測物質為

DNA

時，A260/280

比值在

1.7-1.9；待測物質為RNA

時，A260/280

比值在

1.8-2.0。b）核酸提取產率：核酸提取得率應不低于廠家聲明或實驗室制定的標準。c）核酸完整性：在期待核酸分子量相應的位置可觀察到清晰或彌散的條帶，無明顯降解。6.3.2

擴增效率驗證6.3.2.1

驗證要求擴增效率包括樣本和標準品的擴增效率兩部分，只有二者擴增效率良好且一致時，定量結果才準確。如果懷疑PCR擴增系統(tǒng)有問題應進行擴增效率驗證。6.3.2.2

驗證方案將接近線性范圍上限濃度的樣本10倍稀釋4-6個濃度，最低濃度應在線性范圍內或將標準品按照廠家要求處理，然后進行擴增。將濃度對數(shù)值作為橫軸，對應的Ct值作為縱軸，繪制曲線，計算斜率（K），按以下公式計算擴增效率（E）：E=10-1/K-16.3.2.3

判斷標準樣本和標準品的擴增效率均≥90%且≤110%。6.3.3

上機測序的性能驗證6.3.3.1

驗證要求驗證所用測序儀是否正常運行和使用，測序儀的各項性能參數(shù)是否符合要求，保證測序結果的可靠性。6.3.3.2

驗證方案建議使用質控品或用參考品DNA制備的文庫樣本進行上機，記錄設備運行結束后的參數(shù)，根據(jù)性能參數(shù)標準評價設備性能是否符合使用要求。6.3.3.3

判斷標準儀器的各項性能參數(shù)在廠家聲明的正常范圍內則驗證通過。6.3.4

數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的性能驗證6.3.4.1

驗證要求對所有的檢測變異類型進行驗證，驗證應包括數(shù)據(jù)分析時所用到的所有硬件和軟件系統(tǒng)，涵蓋數(shù)據(jù)分析的所有步驟。6.3.4.2

驗證方案建議使用已知突變豐度的質控品進行測序分析，應包含所有的檢測變異類型，如變異類型包含SNV，分析樣本至少應含有同一位點的多個不同點突變的質控品；如