質(zhì)粒DNA的提取和鑒定

第一部分堿裂解法提取質(zhì)粒一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。提純的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)RNA二、實(shí)驗(yàn)原理

堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

（一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌、LB液體培養(yǎng)基（三）試劑：溶液I50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶菌酶4mg/mL作用:分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II0.2MNaOH1%SDS（新鮮配制）作用:堿性下水解細(xì)胞壁肽聚糖,核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III5MKAc作用:酸性下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白－SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA,沉淀SDS平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下10000rpm離心5分鐘。

2、棄上清,將管倒置于濾紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。

3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。

4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ,蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬不要振蕩),冰浴5分鐘。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，顛倒混勻至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，溫和振蕩10秒,

使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心15分鐘。

四、操作步驟

四、操作步驟6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。

7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱(冰浴）中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。8、棄上清,將管口敞開倒置于濾紙上使所有液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。9、吸除上清液,將管倒置于濾紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，37℃保溫30min后，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液五、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）五、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)。培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。變性的時(shí)間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會(huì)有基因組DNA的污染。G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。五、注意事項(xiàng)——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法五、注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解菌體老化堿裂解不充分菌體中無質(zhì)粒溶液使用不當(dāng)請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)可減少菌體用量或增加溶液的用量不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。溶液Ⅱ在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液。六、質(zhì)粒DNA提取常見問題問題一：未提出質(zhì)?；蛸|(zhì)粒得率較低，如何解決？

原因?qū)Σ呋煊械鞍谆煊蠷NA混有基因組DNA不要使用過多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)加入RNaseA室溫放置一段時(shí)間加入溶液II和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過16小時(shí)。六、質(zhì)粒DNA提取常見問題問題二：質(zhì)粒純度不高，如何解決？

原因?qū)Σ?.簡要堤敘述爐溶液Ⅰ、溶預(yù)液Ⅱ和溶坦液Ⅲ的作顫用，稀以及挨實(shí)驗(yàn)克中匆分別單加入父上述漆溶液妙后，蓋反應(yīng)痛體系躲出現(xiàn)價(jià)的現(xiàn)巨象及膝其成兄因。2.染色否體DN并A與質(zhì)握粒DN剖A分離記的主避要依吧據(jù)是基什么疲？七、修問題哥與討弱論第二軋部分質(zhì)粒DN鐵A含量名測定10拾uL質(zhì)粒DN嶺A切+蒸餾疾水至3m好L混勻敏后，辯測定26飯0n扭m和28潛0n潑m的光攻吸收松值。純的DN妥A傘A26疤0與A28判0之比漫應(yīng)在1.撕80DN拋A盼(μg/m料l)＝A26閱0×稀釋朝倍數(shù)×5執(zhí)0第三傻部分PC鳴R根據(jù)Ge儉ne庸Ba夜nk，用醒軟件Pr郊em徐ie慣r5.突0設(shè)計(jì)獲引物芒，引熱物序芝列如遇下：上游逐引物千：GA驗(yàn)AT色TC稀CA蜻AC徐CA傾CT堤AA章GT罰CC龜TG然AT貫TT穩(wěn)C，Tm已=5糕5℃；下游果引物海：AC海GC波GT瘋GA酸TA站GA旺AC劍TC碗AC山AA錫CA智CC橫AT歇C，Tm隨=5徹5℃；上游煮引物莫帶有Ec懶oRⅠ酶切礎(chǔ)位點(diǎn)垃，下線游引熔物帶逝有Ml憐uⅠ酶切勾位點(diǎn)虎。PC途R反應(yīng)肥體系智：重組袋單菌辯落固一牙茂簽+斗1u課l鋒H2O10演×b場uf樓fe童r2u裳ldN避TP0.天4u撤l上游鼻引物0.合8u辟l下游頌引物0.勢8u來lTa辰q酶0.啞3u窩lH2O14運(yùn).7蜻ulPC慰R條件債如下好：95渴℃竭5m促in94塌℃如30探s57蜓℃勞30竄s星3桂0個(gè)循珠環(huán)72算℃事90施s72獵℃熱10圖mi擇n進(jìn)行1.橫0%Ag狗ar賽os辮e電泳辛，檢薄測擴(kuò)老增結(jié)授果。第四幸部分個(gè)瓊洗脂糖工凝膠染電泳相關(guān)鏟知識(shí)電泳粉：泳奴動(dòng)速網(wǎng)度決奧定于鈔？瓊脂儲(chǔ)糖凝可膠天然孕瓊脂粉（Ag沈ar）是一直種多惜聚糖秧，主疲要由蔥瓊脂按糖（Ag據(jù)ar灰os反e，約占80％）志及瓊櫻脂膠主（Ag漸ar著op誕ec罰ti饞n）組成泳。瓊估脂糖科是由鋪半乳伴糖及敏其衍匙生物欄構(gòu)成逐的中造性物投質(zhì)，手不帶貌電荷歷。而塊瓊脂啟膠是私一種突含硫辨酸根牢和羧抄基的闊強(qiáng)酸象性多僵糖，嬸由于矮這些著基團(tuán)廈帶有毛電荷記，在答電場站作用渠下能鳴產(chǎn)生兄較強(qiáng)鑰的電郵滲現(xiàn)積象，殼加之司硫酸唇根可追與某沈些蛋譯白質(zhì)敗作用孤而影軌響電受泳速病度及詠分離約效果昨。瓊懲脂糖蛇透明飼無紫莫外吸炸收，因此期，目直前多北用瓊界脂糖確為電廳泳支膠持物章進(jìn)行貌平板稅電泳纖。核酸盟分子僻大小魔與瓊亞脂糖糖濃度賤的關(guān)絹系瓊脂糖濃度

0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb

5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3核酸器構(gòu)型摔與瓊誘脂糖均凝膠徹電泳參分離矛的關(guān)啟系不同糟構(gòu)型DN經(jīng)A的移汽動(dòng)速析度次劉序?yàn)檫€：共避價(jià)閉底環(huán)超顫螺旋DN柜A（cc交cD螞NA）＞直線DN辟A（LD棵NA，2條鏈大發(fā)生戀斷裂榴）＞郊開環(huán)諷的雙宅鏈環(huán)行狀DN趁A（oc半DN歷A，1條鏈荒發(fā)生號(hào)斷裂斜）。影響毫遷移響率的宜因素DN息A分子肯的大恒小、挨瓊脂輕糖凝驅(qū)膠的晌濃度趣、DN畏A的構(gòu)蔽象、絞所加來電壓議一般5V/艱cm、電場過方向閃、嵌得入染蠻料的掏存在貧、電傻泳緩傘沖液自的組敏成。常用以染料EB腫:溴化吩乙錠教（3，8-二氨驕基-5惰-乙基-6圈-苯基年菲啶帽溴鹽Et枝hi膀di旨umBr神om次id周e，EB），EB能插調(diào)入DN規(guī)A分子污堿基磨對(duì)之朝間，著導(dǎo)致EB與DN懼A結(jié)合盆。DN金A吸收練的26個(gè)0nm的紫牲外光蹄傳遞栽給EB，或者胳結(jié)合修的EB本身診在30忽0和36錦0吸收仔的射拿線，文均可抗在可軍見光傘區(qū)以59肅0波長綢發(fā)射秒出來客，呈右橙紅碰色。EB染料升優(yōu)點(diǎn)倦：染尾色操淚作簡兆便，廈快速胸，室告溫下15嚴(yán)-2濫0mi籠n；不會(huì)印使核或酸斷閱裂；織靈敏府度高敲，10ng或更肢少的DN存A即可艱檢出切；可拐以加博到樣倡品中傲可膠塊中。EB是誘伐變劑裂，使兵用時(shí)方一定寶要戴塑手套額。EB廢液串要經(jīng)甜過處忙理才幣能丟山棄。SY蠅BR綢:新型飾低毒私，高餐靈敏涉度染兵料，江加入賠樣品雪中，唯價(jià)格僚較昂拿貴。一、肚實(shí)驗(yàn)憲目的通過戴本實(shí)同驗(yàn)學(xué)離習(xí)瓊澤脂糖瞇凝膠加電泳宋檢測DN駕A的方霧法和反技術(shù)女。二、竟實(shí)驗(yàn)兵原理DN妹A在瓊夕脂糖衣凝膠奧中泳真動(dòng)時(shí)不有電堅(jiān)荷效退應(yīng)和悲分子遮篩效幟應(yīng)。核酸池為兩傍性分的子，予在PH躲3.到5時(shí)，澤整個(gè)掀分子線帶正享電；PH8左右鞠時(shí)，璃堿基饒幾乎泡不解無離，袋整個(gè)護(hù)分子戴帶負(fù)將電。在堿栗性環(huán)痕境下申，相駱同堿磁基數(shù)嬸量的議雙鏈DN顧A幾乎暫具有后等量迅的凈蓄負(fù)電使荷，恩能以扣同樣罰的速逢度向嗚正極春方向社移動(dòng)繞。具兼有不株同的池相對(duì)勁分子繩質(zhì)量霞的DN藥A片段晶泳動(dòng)拒速度默不一畏樣，電可進(jìn)互行分柿離。DN涼A分子宏的遷帳移速迎度與扣相對(duì)會(huì)分子閉質(zhì)量譯的對(duì)主數(shù)值掘成反退比關(guān)劣系，政可以摩近似精用于炭估算使分子副的大芹小?？梢云岱蛛x祖相對(duì)斷分子伍質(zhì)量泰相同瞧，但稅構(gòu)型鳥不同倉的D