內(nèi)毒素及葡聚糖檢測

內(nèi)毒素及葡聚糖檢測第一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五主要內(nèi)容來源及結(jié)構(gòu)生物學(xué)活性檢測的臨床應(yīng)用檢測方法及參考范圍標(biāo)本采集及影響因素第二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五

內(nèi)毒素第三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素的生物學(xué)活性發(fā)熱反應(yīng)1激活血管活性物質(zhì)的釋放2激活凝血和纖溶系統(tǒng)3激活補體4直接或間接損害肝臟5激活白三烯、前列腺素及單核巨噬系統(tǒng)6第四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)特異性多糖核心多糖類脂A外層菌體多糖（O抗原），與細菌侵襲力有關(guān)。中層同一種屬之間是相同的。內(nèi)層特殊的糖磷脂，起毒性作用，而無種屬特異性。第五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素概述

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖（LPS），這些成分只在細菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。第六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素的有益作用增加機體非特異性免疫力1防御放射性損傷，促進粒細胞生成2增加網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能3抗腫瘤，免疫佐劑作用4第七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生原因內(nèi)毒素血癥內(nèi)源性外源性腸道內(nèi)毒素的吸收1敗血癥時血中細菌的釋放23有效的抗菌治療后，細菌崩解輸入了含有細菌的藥物、血液或者體液等。第八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五各類疾病內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、燒傷85%、急性胰腺炎90%、敗血癥70%、急性肝炎37-64%、暴發(fā)性肝炎58-100%、丙肝60%、膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%、多器官功能衰竭100%。第九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素檢測的臨床應(yīng)用在肝膽疾病中的應(yīng)用1在呼吸系統(tǒng)感染中的應(yīng)用2在胰腺疾病中的應(yīng)用3在潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用4在全身性細菌感染中的應(yīng)用5在不明原因發(fā)熱中的應(yīng)用6第十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素檢測在醫(yī)院中的應(yīng)用在醫(yī)院滅菌制劑檢驗中應(yīng)用1對注射器、輸液器等醫(yī)療器械的內(nèi)毒素檢測2在透析站和血站中的應(yīng)用3在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用4第十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀內(nèi)毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內(nèi)毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。

▲最嚴重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。第十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素的檢測方法

鱟試驗是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鱟的變形細胞與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，作為判斷試劑中細菌內(nèi)毒素含量的一種方法。第十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素的檢測方法1.凝膠法：鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素的方法2.濁度法：利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量3.比色法：利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量4.流式細胞術(shù)：測內(nèi)毒素的量而不是活性5.化學(xué)發(fā)光測定法第十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素的檢測原理革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒（光度法）檢測原理：革蘭陰性菌脂多糖能激活酶反應(yīng)主劑中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起凝固蛋白原轉(zhuǎn)變成凝固蛋白從而引起吸光度變化，根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對革蘭陰性菌脂多糖濃度進行測定。第十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五

第十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)第十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素檢測的參考值檢測值﹤10pg/ml,陰性。檢測值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥20pg/ml，陽性，建議臨床結(jié)合癥狀進行治療。

第十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五檢測方法的局限性只能檢測革蘭陰性菌脂多糖含量，不能區(qū)分細菌種屬。

第十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五檢測樣本的采集與保存檢測樣本：血液采集要求：采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管（肝素類抗凝）。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血/取樣（血透患者透析前采血）。樣本保存：樣本采集后應(yīng)在3000轉(zhuǎn)/分進行離心，若不能及時檢測，應(yīng)將血漿轉(zhuǎn)移至無熱原試管內(nèi)，在-30℃冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)使用。特殊標(biāo)本處理：對一般黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，稀釋2-5倍后進行檢測；對于嚴重的黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，應(yīng)重新采血。第二十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五干擾因素1.應(yīng)用某些抗生素如β-酰胺內(nèi)酯類、喹諾酮類等患者；2.一些蛋白：陽離子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A及人免疫球蛋白G均能與內(nèi)毒素形成細菌內(nèi)毒素--蛋白復(fù)合體，對細菌內(nèi)毒素有顯著的屏蔽作用，而影響測定內(nèi)毒素結(jié)果；3.操作環(huán)境及操作過程中的污染，可能造成假陽性。第二十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五(1-3)--D-葡聚糖第二十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五1-3-β-D-葡聚糖本質(zhì)及特點真菌細胞壁成分，占50%以上1其他微生物、動物及人的細胞不含該成分2用于侵襲性真菌感染的早期診斷3第二十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五(1-3)-β-D-葡聚糖特性1.對熱極為穩(wěn)定，高壓21℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細胞壁中含量較多，對G試驗靈敏。2.當(dāng)真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當(dāng)真菌在體內(nèi)含量減少時，機體免疫系統(tǒng)可將其清除。3.在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高。第二十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性真菌感染的定義侵襲性真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)定義:指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜、肌肉和內(nèi)臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。第二十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性肺部真菌感染侵襲性真菌感染的發(fā)病率逐年上升,其中又以侵襲性肺部真菌感染最常見,大約占50%～60%。未經(jīng)及時治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達30%～80%。第二十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性肺部真菌感染臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咳血、胸悶、呼吸困難等?，F(xiàn)狀：兩高兩低一快高院內(nèi)感染率和病死率，低臨床和實驗室診斷率，患者病情惡化快。（檢測方法相對滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的新型抗真菌藥物價格昂貴,導(dǎo)致病死率高。）第二十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性真菌感染的誘因內(nèi)源性誘因：影響機體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結(jié)核、肺膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等。外源性誘因：

▲廣譜抗生素，抗腫瘤藥物和免疫抑制劑；

▲插管等侵襲性治療，骨髓和實體器官移植；

▲免疫缺陷綜合癥。第二十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性真菌感染診斷困難的原因診斷困難的主要原因：臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋確診常需侵入性手段獲得組織標(biāo)本，侵入性操作常因患者的病情所限難以實施真菌檢測項目開展相對不足或滯后第二十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性真菌感染的特點不產(chǎn)生內(nèi)毒素和外毒素，致病機理不明；致病力一般較弱，機體免疫低下時發(fā)生；感染菌種變化：白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增長趨勢上升明顯；早期癥狀無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高。第三十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病呼吸系統(tǒng)疾?。悍窝?、肺纖維癥感染及寄生蟲病：肺結(jié)核、腹腔內(nèi)膿腫、AIDS循環(huán)系統(tǒng)疾?。耗X出血、腦梗塞、硬膜下血瘤術(shù)后、胸部大動脈瘤術(shù)后內(nèi)分泌疾?。禾悄虿⊙杭霸煅鞴偌膊。涸偕系K性貧血、DIC腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤第三十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五“G”試驗1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。第三十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五G試驗檢測評價BG值在侵襲性真菌感染臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經(jīng)高于正常值相關(guān)報道5例確診IFI及3例臨床診斷的IFI患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部CT檢查發(fā)現(xiàn)以前。平均早于發(fā)熱5d早于呼吸道癥狀10d第三十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五G試驗臨床應(yīng)用

1明確診斷（抗真菌藥物治療前）

2治療效果監(jiān)測（抗真菌藥物治療后）

3連續(xù)2次采血進行G試驗第三十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五侵襲性真菌感染的臨床檢測方法直接培養(yǎng)真菌法--敏感性低，耗時長,培養(yǎng)陽性率低。培養(yǎng)結(jié)果是定性的，有些標(biāo)本采集困難G試驗：通過檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判斷是否有真菌感染。耗時短，靈敏度高，特異性強，定量檢測可判斷感染嚴重程度PCR技術(shù)：真菌的抗原、抗體及代謝產(chǎn)物的血清學(xué)檢查和真菌核酸檢測第三十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五真菌1-3-β-D葡聚糖檢測原理真菌1-3-β-D葡聚糖檢測試劑盒（光度法）檢測原理：真菌1-3-β-D葡聚糖能特異性激活反應(yīng)主劑中的G因子、凝血酶原等，發(fā)生酶的級聯(lián)反應(yīng)從而引起吸光度變化，根據(jù)檢測其溶液吸光度變化對真菌1-3-β-D葡聚糖濃度進行定量。試劑中添加的兩性電解質(zhì)甘氨酸、氨基糖苷類抗生素及表面活性劑可抑制脂多糖對B、C因子的激活，對革蘭陰性菌脂多糖有特異性屏蔽作用。第三十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)第三十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五真菌1-3-β-D葡聚糖參考值檢測值﹤60pg/ml,陰性。檢測值介于60～100pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥100pg/ml，陽性(深部真菌感染)，建議臨床結(jié)合癥狀進行治療。第三十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五檢測方法的局限性只能檢測真菌1-3-β-D葡聚糖的含量，不能區(qū)分真菌種屬，不能檢測結(jié)合菌和隱球菌。第四十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五內(nèi)毒素與β-葡聚糖的檢測比較已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細菌內(nèi)毒素和真菌1-3-β-D葡聚糖，但它們的反應(yīng)曲線不一樣。內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，而β-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點的斜線。第四十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色對于念珠菌血癥,G試驗檢測是首選檢查熱帶念珠菌----灰藍色白色念珠菌----綠色克柔念珠菌----粉紅色光滑念珠菌----紫紅色第四十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五標(biāo)本采集及保存檢測樣本：血液、肺細胞灌洗液采集要求：1.采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管；2.常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血，血透析患者透析前采血第四十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期五標(biāo)本采集及保存及時送檢，及時檢測：2-3h內(nèi)檢測不合格標(biāo)本：嚴重黃疸