第六章真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)

第六章真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)影響克隆基因在大腸桿菌中表達(dá)效率的因素大腸桿菌表達(dá)體系克隆基因正確表達(dá)的基本條件克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)

1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；

全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架2.是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。優(yōu)越性：大腸桿菌表達(dá)體系3.真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌中表達(dá)體系的不足4.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5.細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。2.真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。

最基本條件：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，在正常情況下，還與轉(zhuǎn)譯后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有關(guān)。

重要條件：編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性?？寺』蛘_表達(dá)的基本條件具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；具有克隆基因的功能（強(qiáng)）啟動(dòng)子；插入序列的正確取向。1.微細(xì)胞檢測(cè)法；2.巨細(xì)胞檢測(cè)法；3.偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定法。克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)這是一種適于檢測(cè)質(zhì)?；虮磉_(dá)的體內(nèi)檢測(cè)法。微細(xì)胞：指由某些細(xì)菌突變體菌株在其生長(zhǎng)期間連續(xù)產(chǎn)生的一類微小的圓形的無核細(xì)胞。微細(xì)胞檢測(cè)法克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體的微細(xì)胞是適于檢測(cè)重組子質(zhì)粒所攜帶的外源基因表達(dá)狀況的理想體系。Example:

ColE1的衍生質(zhì)粒（缺失了106dal）,在微細(xì)胞中不能合成出56×103dal、42×103dal、30×

103dal、28×103dal四種多肽。其中3種多肽是大腸桿菌E1的降解產(chǎn)物。當(dāng)一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片斷插入到卡那霉素基因內(nèi)部時(shí)，便能在微細(xì)胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2種其它的多肽分子?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測(cè)一般情況質(zhì)粒的基因型同微細(xì)胞中的多肽是對(duì)應(yīng)的。如果質(zhì)粒缺失或插入一段序列，則結(jié)果難預(yù)測(cè)。巨細(xì)胞檢測(cè)法

1.經(jīng)紫外線照射的大腸桿菌recAuvrA細(xì)胞，DNA停止合成，而質(zhì)粒載體則可以繼續(xù)合成，在紫外線照射后6小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA的數(shù)量增加了10倍左右，在紫外線照射后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，加入經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，此時(shí)合成的蛋白質(zhì)絕大部分是質(zhì)?；蛩幋a的?？寺』虮磉_(dá)活性的檢測(cè)2.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過紫外線嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。由于細(xì)胞經(jīng)紫外線照射使DNA受到了損傷，自身基因的表達(dá)受到了嚴(yán)重的抑制。通過同λ噬菌體載體編碼的蛋白質(zhì)種類作比較，就可以鑒定出克隆基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)測(cè)定法

使DNA模板在細(xì)菌無細(xì)胞體系中，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄－轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w基因組上的外源片斷進(jìn)行體外表達(dá)，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個(gè)小片段指導(dǎo)合成的。

克隆基因表達(dá)活性的檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：

1.放射性標(biāo)記參入到蛋白質(zhì)的效率，比體內(nèi)標(biāo)記法高的多，而且這個(gè)系統(tǒng)十分敏感。經(jīng)35S標(biāo)記的多肽分子，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影若干小時(shí)后可被迅速檢出；2.應(yīng)用這個(gè)體系，其它原核生物的基因也能夠得到有效的表達(dá)。go大腸桿菌表達(dá)載體核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制起點(diǎn)一、表達(dá)載體的組成部分最佳殖啟動(dòng)瓦子具縱備的美條件第一必須含是啟變動(dòng)子括能夠扇克隆孤基因竊的蛋批白質(zhì)務(wù)產(chǎn)物顧的表雕達(dá)量慣占細(xì)奇胞總換蛋白迅的10附%-嶺30取%以上1.啟動(dòng)凡子第二這個(gè)雷啟動(dòng)芹子應(yīng)柔能呈靜現(xiàn)出梨一種房誠(chéng)低限憂的基干礎(chǔ)轉(zhuǎn)肢錄水聾平，膚因?yàn)樨?cái)在表戴達(dá)毒春性蛋惡白質(zhì)窯或是誦有損艦于寄役主細(xì)濫胞生室長(zhǎng)的丈蛋白得質(zhì)的需情況典下，喇使用等高度管抑制撤型的級(jí)啟動(dòng)首子是典一種替極為絨重要礙的條愈件輪狀團(tuán)病毒屆的VP朋7蛋白見能有價(jià)效地德殺死鋒細(xì)胞蹄，因市此必策須在叨嚴(yán)格新控制司的條蓮件下蠟表達(dá)第三這種母啟動(dòng)猾子應(yīng)首是誘蠢導(dǎo)型粘的，蜘能通刪過簡(jiǎn)滋單的撫方式懸使用洗廉價(jià)域的誘已導(dǎo)物碑而得蜻以誘導(dǎo)。（IP借TG）Ex朋am句pl顛e:IPTG野生摧型的Pla泥c與其閱控制外區(qū)Ola汽c偶聯(lián)鏈在一迎起，渠在沒礎(chǔ)有誘均導(dǎo)物對(duì)存在乏時(shí)，獲整個(gè)龍操縱簽子處鐘于基羊底水緞平表渣達(dá)；替誘導(dǎo)促物可岸以使欲啟動(dòng)斷子Pla親c介導(dǎo)鄉(xiāng)豐的轉(zhuǎn)停錄大粥幅提奸高野生榨型的Pla柿c上游循附近網(wǎng)擁有跨代謝涉激活牲因子麗（CA碼P）結(jié)袖合區(qū)抽，cA割MP激活CA介P，CA殘P結(jié)合潮啟動(dòng)篇子控造制區(qū)商，進(jìn)捎而促城進(jìn)Pla借c介導(dǎo)袍的轉(zhuǎn)深錄。號(hào)葡萄浸糖代此謝使cA絕P減少磁，也錦能阻的遏Pla森c介導(dǎo)春的轉(zhuǎn)巡壽錄。慰因此息，基慚因工勉程中睬使用輕的乳鍋糖啟逗動(dòng)子廚均為然抗葡奸萄糖序代謝菠阻遏紅的突沫變型夸，即Pla元cUV瓦5PlacOPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝基底水平轉(zhuǎn)錄CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)憐子封聚堵作動(dòng)用：忘由一或個(gè)上蕩游啟獨(dú)動(dòng)子域驅(qū)動(dòng)核的轉(zhuǎn)粱錄作威用，均當(dāng)其糧通讀命過下革游啟強(qiáng)動(dòng)子押時(shí)，憤便會(huì)杏使該緊啟動(dòng)療子的考功能躍受到通抑制池，將扶這種劈燕由一坑個(gè)啟賊動(dòng)子畢的功冬能活兆性抑重制另傍一個(gè)此啟動(dòng)匠子轉(zhuǎn)室錄的粘現(xiàn)象香，叫脊做啟渣動(dòng)子蓄封堵戰(zhàn)作用低。轉(zhuǎn)錄夫終止棟子還冷能增廈強(qiáng)mR唐NA分子率的穩(wěn)凈定性躍，從挑而提傳高蛋熟白質(zhì)享產(chǎn)物朋的水進(jìn)平。2.轉(zhuǎn)錄逮終止草子強(qiáng)化沙轉(zhuǎn)錄慢終止悔的必久要性趁：外源唱基因貨在強(qiáng)排啟動(dòng)博子的校控制山下表呆達(dá)，糟容易針發(fā)生禽轉(zhuǎn)錄產(chǎn)過頭行現(xiàn)象秘，即RN扒A聚合龍酶滑才過終姜止子養(yǎng)結(jié)構(gòu)悶繼續(xù)抹轉(zhuǎn)錄棚質(zhì)粒政上鄰寇近的DN騎A序列四，形嘗成長(zhǎng)兩短不補(bǔ)一的mR搬NA混合永物過長(zhǎng)屑轉(zhuǎn)錄彼物的甚產(chǎn)生傍在很犬大程足度上穗會(huì)影韻響外喇源基蜜因的思表達(dá)俱，其敢原因毀如下施：轉(zhuǎn)錄廚產(chǎn)物秩越長(zhǎng)堪，RN乖A聚合針酶轉(zhuǎn)莫錄一撕分子mR姻NA所需慚的時(shí)嬸間就貫相應(yīng)泰增加廣，外甚源基盛因本拌身的竟轉(zhuǎn)錄世效率協(xié)下降示；如果警外源鑒基因愚下游企緊接據(jù)有載盞體上修的其開它重稱要基醫(yī)因或DN著A功能慰區(qū)域讓，如到選擇瘋性標(biāo)臘記基我因和渾復(fù)制躲子結(jié)急構(gòu)等從，則RN比A聚合衣酶在步此處夠的轉(zhuǎn)席錄可項(xiàng)能干湖擾質(zhì)切粒的街復(fù)制清及其小它生遲物功室能，詢甚至鄭導(dǎo)致均重組禮質(zhì)粒燙的不唉穩(wěn)定元性；過長(zhǎng)餅的mR撈NA往往步會(huì)產(chǎn)策生大竹量無超用的悉蛋白嘆質(zhì)，愚增加云工程曾菌無天謂的擾能量湊消耗拖；更為亭嚴(yán)重律的是壟，過頂長(zhǎng)的添轉(zhuǎn)錄抖物往選往不糖能形扛成理甲想的規(guī)二級(jí)頓結(jié)構(gòu)辣，從櫻而大迷大降鑰低外煉源基攀因編槐碼產(chǎn)至物的作翻譯撤效率搖。目前撈外源兼基因替表達(dá)禿質(zhì)粒室中常抱用的頂終止蒼子是占來自學(xué)大腸騙桿菌rR遍NA操縱澆子上謙的rn幅T1T2以及T7噬菌缸體DN屋A上的Tφ。對(duì)免于一嫌些終獨(dú)止作縫用較煉弱的存終止溫子，色通常偵可以振采用恨二聚懼體終僚止子罵串聯(lián)石的特障殊結(jié)廈構(gòu)，獎(jiǎng)以增滋強(qiáng)其傳轉(zhuǎn)錄虎終止?jié)q作用姜。終止稱子也貪可以高通過待特殊未的探齒針質(zhì)拜粒從遍細(xì)菌酸或噬篇菌體眨基因溪組DN久A中克吵隆篩配選強(qiáng)終鹽止子婆的選堅(jiān)擇與獻(xiàn)使用pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子3.核糖讓體結(jié)異合位顯點(diǎn)外源嶺基因悶在大射腸桿殃菌細(xì)叼胞中蘿的高保效表漲達(dá)不甜僅取橋決于嶄轉(zhuǎn)錄拼啟動(dòng)啟的頻業(yè)率，碼而且逗在很唇大程外度上賞還與mR育NA的翻嫁譯起翅始效使率密候切相彈關(guān)。餐大腸劑桿菌艱細(xì)胞兵中結(jié)充構(gòu)不遙同的mR鋼NA分子腫具有辯不同振的翻尤譯效詠率，纏它們節(jié)之間混的差渠別有并時(shí)可盡高達(dá)罩?jǐn)?shù)百曲倍。mR博NA翻譯答的起悶始效銹率主課要由裙其5‘端的趙結(jié)構(gòu)訊序列蠶所決任定，叔稱為絲式核糖功體結(jié)孤合位縮慧點(diǎn)（RB文S）大腸領(lǐng)桿菌峽核糖仙體結(jié)形合位篇點(diǎn)包藏括下慚列四棟個(gè)特滋征結(jié)娃構(gòu)要駛素：位于鈔翻譯畜起始均密碼滲子上懲游的6-炒8個(gè)核訴苷酸停序列5’艷U舌AA怖GG騾AG宿G掠3’，即Sh帖in澇e-Da戶lg詳ar情no（SD）序問列，排它通瞎過識(shí)壇別大輩腸桿頸菌核家糖體法小亞宅基中嘩的16集SrR父NA3’端區(qū)棒域3’依A敘UU肥CC腥UC違C崗5’并與帖之專究一性寇結(jié)合乏，將mR秒NA定位齊于核讀糖體賤上，匆從而猾啟動(dòng)天翻譯排；翻譯鑒起始抗密碼框子，資大腸策桿菌拉絕大舟部分舅基因記以AU必G作為關(guān)閱讀嚷框架呼的起滾始位積點(diǎn)，跨但有呆些基金因也碰使用GU迫G或UU著G作為滿翻譯對(duì)起始膨密碼盾子；SD序列渠與翻炸譯起呈始密尼碼子經(jīng)之間返的距賄離及播堿基周組成椅；基因震編碼屈區(qū)5’端若青干密橋碼子慢的堿枕基序范列核糖妨體結(jié)春合位岸點(diǎn)的疊結(jié)構(gòu)4.轉(zhuǎn)譯嫩增強(qiáng)歉子顯著厲的增醋加異通源基竹因在頁(yè)大腸偵桿菌鍋中的師表達(dá)醋效率唇。5.轉(zhuǎn)譯剝終止憑子mR伐NA轉(zhuǎn)譯彼終止服必須誤存在謹(jǐn)終止侵密碼沒子。大腸法桿菌旦格外寒偏愛跪使用丑終止樣子UA疤A，尤其涂是在核其后夏加上U形成UA什AU四聯(lián)睬核苷翼酸的哭情況雞下，丸轉(zhuǎn)譯忽終止橡的效統(tǒng)率便頑會(huì)得獄到進(jìn)便一步耀的增重強(qiáng)。T7噬菌芝體基耗因10前導(dǎo)桐序列漂（簡(jiǎn)壞稱g1覆0-敢L序列礦）;大腸嚇桿菌at慰pE基因mR篇NA是5’木-U畝TR中富孫含U的區(qū)膚段。1、選橋用一投種適投當(dāng)?shù)内s核酸基內(nèi)切志酶，計(jì)消化擦切割孝大腸選桿菌岸的染指色體DN漫A，2、接嗚著將替切割柱產(chǎn)生戰(zhàn)的DN庫(kù)A限制檢片斷弟群體吹，同緞一種明無啟百動(dòng)子啄的質(zhì)箭粒載拾體重剪組，智按實(shí)逼驗(yàn)設(shè)示計(jì)要來求使著克隆滾的片俯斷恰召好插影入在餡緊鄰報(bào)告杯基因的上捏游位暫置3、隨朋后把廣此重工組混倒合物觀轉(zhuǎn)化次給大幼腸桿縮慧菌寄盼主細(xì)懸胞，芬構(gòu)成朋質(zhì)粒裁載體舊基因剃文庫(kù)閥，并期檢測(cè)魔報(bào)告窯基因卡的表哲達(dá)活裹性。二、刮功能豈啟動(dòng)藥子的走分離一般摟程序番：報(bào)告約基因銀（re雕po例rt癢er判g(shù)炸en宰e）：特指蜂那些渡編碼蕉產(chǎn)物斧可以則被快某速測(cè)稿定的壯功能章核苷撤酸編飯碼單僅元（巖半乳問糖苷淘酶基午因、納堿性萍磷酸墊酶基榜因、說螢光好素酶會(huì)基因弓、半耐乳糖兇激酶?；蜉o以及門氯霉酷素乙背酰轉(zhuǎn)罪移酶劑基因筋、GF但P等）。追蹤定某種診特定活的DN食A結(jié)構(gòu)副（重毛組質(zhì)臟粒）賄是否謝已經(jīng)乳導(dǎo)入如寄主將細(xì)胞測(cè)、抑散或是濃器官醬和組障織；脂也可階用來辦同任窗何一打種目坦的啟與動(dòng)子麻連接鼓，因慢此其甚表達(dá)登活性托可作纏為檢加測(cè)啟沒動(dòng)子主功能雀的依鳳據(jù)。利用CA墨T基因進(jìn)行預(yù)功能粱啟動(dòng)極子的分飄離和憤活性揀測(cè)定無啟莊動(dòng)子薄的CA瞎T質(zhì)粒加載體Ec屑o(jì)l殺iDN粱A構(gòu)建Ec零ol演i基因刮文庫(kù)細(xì)胞稿裂解餃物、14C標(biāo)記客得氯羨霉素乙酰辟輔酶A薄層插層析放射東自顯靠影CA渴T活性鵝的檢欄測(cè)：氯霉滑素乙榮酰轉(zhuǎn)隊(duì)移酶可以喉催化芳氯霉?jié)乘兀?-或3-）發(fā)生安乙酰巾化作這用。首先稅在大暮腸桿且菌質(zhì)獎(jiǎng)粒pB庭R3桶16（含有育一個(gè)te社t基因參、Hi病ndⅢ位點(diǎn)）上的te俗t的啟勿動(dòng)子培序列蟻中插筍入一眨個(gè)Ec選oR菜1的酶搬切位寒點(diǎn)（pB杯RH尸3B遷,紹pB錢RH益1），使之久失活紀(jì)。將純?cè)砘母?jìng)細(xì)菌巴染色叨體DN懼A片斷貢，克丈隆在pB燭RH萍3B或pB培RH得1的Ec助oR來1限制波性位嫂點(diǎn)上紀(jì)；轉(zhuǎn)幼化給挖對(duì)te披t敏感凍的大溝腸桿知菌寄虜主細(xì)承胞。使用te帆tr作報(bào)懼告基印因分朋離功約能啟耍動(dòng)子能夠議檢測(cè)園啟動(dòng)義子活怨性強(qiáng)宣弱的狀新型既質(zhì)粒庫(kù)載體粗系統(tǒng)川。來源傲于pB繭R3庭22用ga精lK（半憂乳糖賺激酶蠅基因糊）作兵報(bào)告局基因姓分離訂功能識(shí)啟動(dòng)嘆子轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動(dòng)子的galK原理戴：半乳納糖激乞酶能信夠從AT施P分子厲上轉(zhuǎn)密移一府個(gè)磷眨酸集籃團(tuán)給紡半乳顏糖分欺子，愿從而見催化造半乳燃糖發(fā)便生磷男酸化孫作用面，形板成半嶼乳糖-1飽-磷酸招。用同幕位素巨標(biāo)記AT究P，測(cè)飄定從AT狂P轉(zhuǎn)移技到半棉乳糖危去的32欣P的放丘射性醬強(qiáng)度奴，可正推算閉報(bào)告決基因泊（ga枯lK）表晴達(dá)的乞半乳輪糖激宴酶的棄產(chǎn)量資。分離告功能希的啟瀉動(dòng)子只：將大傅腸桿袍菌基語(yǔ)因組姓的酶壇切片她斷，竟克隆端在pO寒K1質(zhì)粒載體澤的MC展S區(qū)的需單克議隆位嘩點(diǎn)上必；將體診外連框接的DN通A重組很分子窩，轉(zhuǎn)傍化給澤具Ga歲lE＋、Ga胳lK－的大喂腸桿量菌寄珍主細(xì)希胞，碑避免到內(nèi)源今半乳泄糖激其酶的哈干擾妖；將它漸們涂?jī)?chǔ)布在記麥?zhǔn)想[培養(yǎng)恩基（含而有PH值指立示劑息的中辱性紅久和結(jié)染晶紫塘，檢什測(cè)碳繞水化上合物竊）上，債篩選爪轉(zhuǎn)化女子（般重組怖子產(chǎn)裳生紅督色的粱菌落罩）。采用次鳥槍懼法戰(zhàn)崖略，櫻將合急適大應(yīng)小的DN敲A片段夾克隆姿到啟今動(dòng)子哲探針蕩質(zhì)粒pK過O1上受懂體細(xì)醉胞染側(cè)色體DN崇A上的ga椒lE、ga他lT與質(zhì)浙粒上歇報(bào)告縣基因ga尼lk的表皮達(dá)產(chǎn)稍物聯(lián)叫合作斃用，辮可將喬培養(yǎng)湖基中樂的半挺乳糖尖酵解非成紅潮色素暑物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動(dòng)子活性的重組克隆啟動(dòng)詢子的泰篩選pO若K1質(zhì)粒蚊載體猴分離沾功能后啟動(dòng)婚子的距因素1.選用朽的報(bào)徑告基絨因ga倆lK的編殊碼產(chǎn)臟物半句乳糖柜激酶奸，是途一種粥易于薦快速孝定量各檢測(cè)蟲的蛋被白質(zhì)脹（鑒超定啟賀動(dòng)子已表達(dá)豬活性軋的強(qiáng)廢弱）侄；2.應(yīng)用塌麥?zhǔn)贤伺囵B(yǎng)傳基的拉顯色至反應(yīng)棍特性纖，篩辛選能獵夠利柔用半堤乳糖尤的轉(zhuǎn)抖化子熔（分觸離功耍能啟議動(dòng)子畢）。3.采用豬半乳遞糖激版酶缺鋸陷型粒的大陳腸桿國(guó)菌寄寄主菌閘株（Ga傭lE+Ga狼lT+Ga川lK－）作轉(zhuǎn)化毅受體埋；啟動(dòng)丑子的啟構(gòu)建-3臨5虜區(qū)序釣列-1盼0敘區(qū)序毫列PlLPre他cAPtr所pPla底cPtr岔aAPta皮c啟動(dòng)污子T勇T錢G艙A我C脂AG故A繁T語(yǔ)A兼C注TT膜T責(zé)G畜A平T艷AT抓A插T舟A翠A鹽TT辯T累G紹A息C鏡AT龍T個(gè)A阿A烘C爬TT安A聾G案A緩C誰(shuí)AT憶A死A莊T沖G簽TT槳T恒T渴A亡C基AT聯(lián)A踐T恭A毀A蝕TT鋼T洽G藏A嚇C滿AT拆A滾T晶A誓A世TPta膚c=3Ptr兇p=11Pla講c1.商L匙ac啟動(dòng)傾子的塊表達(dá)帶載體2.Tr因p啟動(dòng)鄭子的鋸表達(dá)諷載體3.廊PL啟動(dòng)碧子的襖表達(dá)夸載體三、冶常用替的大塔腸桿李菌表賓達(dá)載戴體理論男上，祝凡是具有伏包括饅控制而區(qū)段斧在內(nèi)療的la劣c操縱捆子的質(zhì)府粒，劇都基丑本上惕具備返了用象作克言隆基朵因表堵達(dá)載琴體的賠條件蘆。這圾類表派達(dá)載葡體的季最突聾出的侍特點(diǎn)個(gè)是，貸含有獄一條賊足夠翻大的稅編碼β-半乳啞糖苷胞酶的la調(diào)cZ基因腐片斷舉。因拿此，挎每當(dāng)蟲有一稠個(gè)克畜隆的博外源DN羞A片斷固插入麻到這逗個(gè)啟副動(dòng)子灘之后個(gè)，仍工保持煉著la變cZ基因孟固有滔的讀沾碼結(jié)眉構(gòu)時(shí)兆，這婦個(gè)重治組質(zhì)尊粒就況會(huì)合顯成出難一種狡由外透源克攤隆基怨因編蜓碼的自多肽號(hào)和β-半乳墊糖苷孤酶組罪成的孝融合駝蛋白鋪質(zhì)。1.經(jīng)過Ha比eⅢ切割纏的20傾3b突p的酶切詞片斷遲上具嶺有La薦c操縱史子的瓣控制迫區(qū)，懇包括功阻遏胡物作串用區(qū)蓋、CA宏P(guān)作用盯區(qū)以飽及RN般A聚合擁酶作菌用區(qū)互、β-半乳左糖苷甚酶的俘頭8個(gè)密種碼子透。有襖一些諸對(duì)阻著遏物縫作用肺不敏閉感的告啟動(dòng)言子，位也被伴用來俯制備旺表達(dá)彩載體2.仰9示5b押p的Al偽u片斷俘：不蘭完整淡的CA能P結(jié)合徐序列3.訴L岡8突變?cè)\的20矛3b射p區(qū)段覽，在CA榜P結(jié)合到序列大里發(fā)海生了G-羊A的轉(zhuǎn)竭換4.在uv維5突變武，使la衡c啟動(dòng)悅子開斤始的目轉(zhuǎn)錄回顯得左更有餓效。瓶（RN巷A聚合河酶結(jié)結(jié)合區(qū)T-讓A顛換,相鄰垮堿基G-抗A的轉(zhuǎn)序換）質(zhì)粒萍的構(gòu)平建：將含惱有l(wèi)a僚c啟動(dòng)瓣子的Ha暖eⅢ酶切封片斷鎖，經(jīng)房誠(chéng)平末蠅端連頃接，魄克隆揮到經(jīng)Ec遵oRⅠ切割派并對(duì)矛其粘挑性末槳端進(jìn)版行填恭補(bǔ)修膠復(fù)的pB尚R3登22質(zhì)粒藍(lán)上。增加2個(gè)堿基對(duì)2.調(diào)Tr舅p啟動(dòng)我子的坦表達(dá)映載體這種據(jù)表達(dá)襲載體稀的優(yōu)擠點(diǎn)是平，它夏所合莊成的京蛋白址質(zhì)產(chǎn)移量高恨于la拍c啟動(dòng)濾子表區(qū)達(dá)載燥體系我統(tǒng)，嶼并且帆是誘歸導(dǎo)型蠅的。用于釀表達(dá)叮載體搬的tr飄p啟動(dòng)游子一贊般只膚包含龍啟動(dòng)律基因惑、操抵縱基峽因、察和部丙分tr毒pE基因積。P1OtrpE目的基因1.大腸件桿菌勺染色之體DN沫A的5.用4k久b也Hi隱ndⅢ片斷勉，含聚有tr笑p啟動(dòng)釀子、識(shí)操縱請(qǐng)單元錯(cuò)、前婚導(dǎo)序散列、身弱化齡子、tr歐pE基因叮、tr細(xì)pD基因省的部晚分序第列。2.將此晃片斷災(zāi)，克棉隆到pB湯R3關(guān)22質(zhì)粒指的Hi陽(yáng)ndⅢ位點(diǎn)閃，構(gòu)漿建成詢了pt魄rp蒼ED弄3表達(dá)秧載體何（含弊有兩腳個(gè)Hi謀ndⅢ位點(diǎn)抄）。構(gòu)建3.Hi深ndⅢ部分票酶切霉消化旋，將酸靠近Ec蛇oR滲1位點(diǎn)互的一絞個(gè)Hi碎ndⅢ位點(diǎn)役，經(jīng)殲核酸跟外切拍酶Ⅲ和S1核酸育酶處律理，宏消除狠掉構(gòu)厚建新懷的質(zhì)堪粒載攔體pt斷rp捎ED鐮5-跡1.使用Hi匙ndⅢ接頭燙，將pt轟rp竿ED授5-昆1質(zhì)粒閉的Hi只nf諷1片斷賠克隆起到了pB痛R3津22質(zhì)粒消的Hi鳥ndⅢ位點(diǎn)卡上，遲形成難重組峰質(zhì)粒pW寶T1腿11（含跨有tr欣p調(diào)節(jié)鏡序列途和tr控pE基因零的頭7個(gè)密業(yè)碼子蜘）。Tr建p啟動(dòng)搖子表剩達(dá)載燃體已此用來每生產(chǎn)孝了α-干擾魂素和γ-干擾惕素三啟拉動(dòng)子駛串聯(lián)鏈單元化表達(dá)度效率姑高于餃單啟攜動(dòng)子瞞單元3.慣PL啟動(dòng)聚子的態(tài)表達(dá)潔載體是一爛種最譽(yù)廣泛紛使用怠大腸算桿菌口表達(dá)嗚載體緒的啟劃動(dòng)子壯之一唐。cI基因于存在京一個(gè)練溫度的敏感辨突變勻等位妹基因cI鍵85車7。42度時(shí)埋，阻既遏蛋乳白失壞活；28塔-3仔0度時(shí)避，PL啟動(dòng)務(wù)子完及全被均阻遏腫蛋白恭抑制通過劍改變?nèi)獪囟葴鐏砜乩戎芇L啟動(dòng)倉(cāng)子的杯開閉N:抗終爺止蛋錯(cuò)白；Cr件o:抗阻叢遏蛋內(nèi)白(裂解榴必需忙的）警；cI,cI律I,cI奸II:阻遏藝蛋白價(jià)；P:啟動(dòng)慚子；O:操縱補(bǔ)子。R:右；L:左cI857PL外源基因pP疊Lc謝24表達(dá)儀載體迎：用來龜表達(dá)剛天然撈的蛋思白質(zhì)伍和融砍合的淘蛋白常質(zhì)。這個(gè)憐質(zhì)粒籍表達(dá)霸載體勁含有MS酬2-聚合拿酶基韻因開僅始的98個(gè)密液碼子郊，不瓦具有茫轉(zhuǎn)譯闖起始渣密碼惑子的舞外源蹲片斷義也能忘實(shí)現(xiàn)晌表達(dá)魂。在MS記2-聚合薄酶基緞因下鴉游，般存在Ba述mHⅠ和Hi舉nd拾Ⅲ單切押點(diǎn)。Ec夫oRⅠ單切文點(diǎn)靠港近λPL啟動(dòng)倦子，蟲處于播轉(zhuǎn)譯腹起始倆密碼酷子之稻前。pP墨La辣23妻11表達(dá)導(dǎo)載體可以歷控制梨具有泉轉(zhuǎn)譯呢起始籠區(qū)的渠外源脆片斷朵插入昨基因?qū)⒌谋砗氵_(dá)。這種剛啟動(dòng)洗子可伙接受辟熱敏腦感的λ阻遏沒蛋白騙質(zhì)的炒抑制匆。組成押：1.伙pB清R3炸22的Ha犁eⅡ－Ec糠oR片斷少；編碼am朋pr2.線λ噬菌紛體的Ha憐eⅢ揚(yáng)-H律aeⅡ片斷悠：λPL3.誘p隊(duì)MK限20質(zhì)粒禽的Ha攤eⅡ片斷淋：編碼ka桑nr4.具有Co透lE漂1復(fù)制潮起點(diǎn)貢的Ha剩eⅡ片斷搬：經(jīng)pM紋K2判0質(zhì)粒民轉(zhuǎn)移門而來pP皮Lc胃28概33表達(dá)采載體調(diào)節(jié)贏型強(qiáng)弦啟動(dòng)稻子：能旦夠使磚克隆舒的真繭核基旅因在昌大腸練桿菌蜘寄主盯細(xì)胞睬中最憂有效鋤的高齒水平嚇表達(dá)組成筍：1.一個(gè)斯調(diào)節(jié)邁型的毒強(qiáng)啟效動(dòng)子柴；2.一個(gè)孩用作砍選擇斥記號(hào)劑的氨緞芐青峰霉素蜘抗性界基因am窄pr；3.一個(gè)絕直接頑位于PL啟動(dòng)慶子下涌游的態(tài)多克先隆位飼點(diǎn)（MC見S）區(qū)若由pK孝N4怪02質(zhì)粒堆的DN弓A復(fù)制艙起點(diǎn)罪取代pP使Lc仆28集33質(zhì)粒贏的DN拜A復(fù)制鹿起點(diǎn)坊，由妖此形罷成的申新質(zhì)右粒pC餅P3。它在鉗大腸缸桿菌紋寄主咸細(xì)胞鈔中指恐導(dǎo)外雀源蛋籃白質(zhì)驢合成咽的有功效性漲可得榨到有億效的壤提高參。而提且這胸種質(zhì)賠粒是廢溫度鋼敏感英型的刮載體巾。（42度，殃拷貝爪數(shù)提彼高5～10倍）go克隆翼的真炊核基槍因在政大腸失桿菌頓細(xì)胞體中的名表達(dá)外源垮蛋白裙質(zhì)在陪大腸秀桿菌教細(xì)胞魄中的斜表達(dá)雙部位融合群蛋白區(qū)質(zhì)的沫表達(dá)1.細(xì)胞播質(zhì)中休表達(dá)2.周質(zhì)鋼中表匹達(dá)3.胞外策表達(dá)1.外源惠蛋白與質(zhì)在恭大腸突桿菌朋細(xì)胞梳中的晝表達(dá)塘部位在某勁些生油長(zhǎng)條星件下銳，大午腸桿茫菌能頭積累模某種伏特殊惰的生化物大藥分子堪，它幟們致刑密地褲集聚碌在細(xì)于胞內(nèi)仆，或蛾被膜播包裹蘋或形陣成無谷膜裸熟露結(jié)芳構(gòu)，帽這種碌水不懶溶性夫的結(jié)友構(gòu)稱慶為包搶涵體紋（In范cl鈔us癥io昆nBo魚di康es尤，I頭B）。外源武基因壤在大草腸桿枯菌寄壤主細(xì)瓶胞質(zhì)倦中高代效表倚達(dá)時(shí)鏟，常食會(huì)發(fā)獨(dú)生這柜種特中殊的疑生理恨現(xiàn)象昨，形侵成包妹涵體衣。細(xì)胞陶質(zhì)中逮表達(dá)Scanningelectronmicrographofinclusionbodies.包涵分體：您存在劍于細(xì)酸胞質(zhì)鉛中的頁(yè)一種掛由不駛可溶確性蛋晝白質(zhì)季聚集名折疊蠻而成敞的晶惜體結(jié)厲構(gòu)物蠢。富含者蛋白下質(zhì)的助包涵答體多碼見于算生長(zhǎng)體在含廳有氨承基酸權(quán)類似疲物培句養(yǎng)基確的大斤腸桿粘菌細(xì)潑胞中鹽，由等這些汽氨基縫酸類濟(jì)似物置所合害成的大蛋白嬌質(zhì)往傍往會(huì)索喪失幣其理候化特完性和甲生物山功能畜，從題而集池聚形般成包姿涵體趙。由脊高效濃表達(dá)慎質(zhì)粒封構(gòu)建石的大潮腸桿斑菌工燙程菌樂大量自合成牽非天獻(xiàn)然性抱的同奶源或敘異源葵蛋白脈質(zhì)，撓后者奔在一殲般情低況下差也以臥包涵赤體的泄形式頁(yè)存在勿于細(xì)狼菌細(xì)荒胞內(nèi)湖。除搞此之對(duì)外，腰包涵再體中莊還含情有少萬量的DN筍A、愚RN孫A和脂錘多糖觸等非懇蛋白杰分子跑。優(yōu)點(diǎn)堵：1.形成魚包涵吊體a.蛋白斃質(zhì)易情于以蛾高純輛度和春高濃碗度方簽式分慨離b.蛋白陡質(zhì)受蘆保護(hù)暈而免辣受胞代內(nèi)酶胞的降殿解作敬用c.蛋白奏質(zhì)沒穿有活軍性，械因此去不會(huì)址使寄桿主細(xì)匙胞受豬傷害2.蛋白許質(zhì)的蛋產(chǎn)量夢(mèng)高二硫鞏鍵的塊斷裂以及份轉(zhuǎn)譯名修飾年作用蜜的喪鞠失，格會(huì)導(dǎo)尚致外洲源片栗斷編齡碼的美蛋白土質(zhì)在東大腸個(gè)桿菌京中超黃量表衛(wèi)達(dá)。3.表達(dá)牢的質(zhì)昆粒載俗體構(gòu)鼻建比弟較簡(jiǎn)農(nóng)單。缺點(diǎn)激：1.包涵圓體a.蛋白令質(zhì)折溫疊了左，再逢折疊耐的蛋獵白質(zhì)多可能炕無法橋恢復(fù)僵其生回物學(xué)搬活性b.蛋白悲質(zhì)的始終產(chǎn)艙量偏蕩低c.蛋白萍質(zhì)的羽生產(chǎn)聯(lián)成本籃比較越昂貴2.還原遇的環(huán)用境不餅利于棋二硫巨鍵的灰形成（硫腎氧還席蛋白等系統(tǒng)變、谷擇氧還寬蛋白備系統(tǒng)賊）3.由于N－末端爺存在彎甲硫綁氨酸詳。使韻蛋白托質(zhì)的這真實(shí)面性受南影響4.蛋白目質(zhì)會(huì)翠被酶靜解5.蛋白盲質(zhì)種樸類多則，因嚼此純皮化比稿較復(fù)飯雜例：在大睬腸桿折菌細(xì)斥胞內(nèi)橫表達(dá)紫人生摧長(zhǎng)激妖素（hum痛angro拔wt傲hhor背mo渾ne戴,hG嘴H）周質(zhì)偵：在離大腸別桿菌辭一類哲格蘭飲氏陰路性菌觸中，影位于令內(nèi)膜玩和外營(yíng)膜之況間的堡細(xì)胞來結(jié)構(gòu)糞部分虛。在周培質(zhì)中伸表達(dá)嫩的蛋哨白，單需要條信號(hào)援肽序彼列才速能從在細(xì)胞鉤質(zhì)中劍穿過蔥細(xì)胞夠質(zhì)內(nèi)治膜進(jìn)訂入周榨質(zhì)。周質(zhì)（pe震ri約pl常as槽m）中表存達(dá)優(yōu)點(diǎn)采：1.由于棒周質(zhì)泉中蛋你白質(zhì)映種類號(hào)比較何少，銷因此度目標(biāo)濫蛋白世質(zhì)的庸純化鬼就比顆較簡(jiǎn)輛單2.蛋白步質(zhì)酶排解的另程度狡不甚勉嚴(yán)重3.促進(jìn)汁了二受硫鍵更的形倦成及株蛋白料質(zhì)的趨折疊幸作用獻(xiàn)（氧捆化環(huán)趨境）缺點(diǎn)跪：1.信號(hào)廉肽并射非總室是有名助于群蛋白皆質(zhì)的抗轉(zhuǎn)運(yùn)2.有可故能形封成包高涵體4.蛋白傍質(zhì)N-末端及的結(jié)燙構(gòu)真麗實(shí)在正闊確折別疊的夕蛋白咳質(zhì)，諸在轉(zhuǎn)魂運(yùn)過縮慧程中添，在棗體內(nèi)虜對(duì)信渡號(hào)肽搬進(jìn)行孟切割相當(dāng)斑多的以真核供生物廣成熟扭蛋白N端并嬸不含舅有甲侵硫氨悶酸殘紐奉基。冬當(dāng)這百些真核核基鉛因在轟大腸爭(zhēng)桿菌猛中表燭達(dá)時(shí)姐，蛋湊白質(zhì)N端的裹甲硫擇氨酸汽殘基素往往王不能襯被切河除。交如若戰(zhàn)將外搬源基卡因與析大腸割桿菌只的信席號(hào)肽格編碼玻序列興重組村在一已起，聰一旦疤分泌悟型表話達(dá)，突其N端的變甲硫撤氨酸關(guān)殘基秧便可化在信梳號(hào)肽爺?shù)募袅徘羞^域程中刃被有檢效除陡去分泌宰型異呈源蛋察白的棕表達(dá)蛋白毛質(zhì)的兄分泌珠機(jī)制原核娘細(xì)菌基周質(zhì)杜中含暢有多闖種分尋子伴裕侶可嬌阻止矮分泌攪蛋白艱的隨查機(jī)折帖疊，耀分泌聞在細(xì)遵胞周佛質(zhì)或弊培養(yǎng)突基中蔬的重樓組蛋柄白很墻少形蝦成分吵子間解的二悼硫鍵英交聯(lián)幫，因圍此與秤包涵腔體相嗚比，臨分泌趴型重羽組蛋噸白具滾有較征高比土例的盡正確炸構(gòu)象堵，生沖物活禍性的濃回收接率增仁加，絹且對(duì)愛蛋白靜酶不款敏感使克驢隆在妖大腸抹桿菌姓細(xì)胞票中表胳達(dá)的近外源煎蛋白杠質(zhì)，匪分泌標(biāo)到胞糖外培滅養(yǎng)基穩(wěn)中進(jìn)痕行分假離純起化胞外燃表達(dá)搭：途徑瘋：1.用大克腸桿賠菌細(xì)攤胞固漫有的敵途徑繭，使匯真正勸屬于虧分泌往型的棗蛋白懷質(zhì)直身接分掘泌到抓胞外上培養(yǎng)販基中柄。（算不是喘特別嫩有效謹(jǐn)?shù)某潭绦颍?.誘導(dǎo)司大腸蜘桿菌控細(xì)胞舉的外勉膜發(fā)追生有雜限的嫩滲漏腰，導(dǎo)塵致胞南內(nèi)的卸蛋白邪質(zhì)向子胞外壩培養(yǎng)奶基方陪向分融泌（可河以分污離到凝中等勢(shì)產(chǎn)量肆的蛋系白質(zhì)販）優(yōu)點(diǎn)直：1.蛋白或質(zhì)的叼酶解適作用防程度朽低目的憂蛋白榜穩(wěn)定月性高云，重答組人末胰島悔素原駱若分愿泌到珍細(xì)胞沒周中壁，其爪穩(wěn)定濾性大鑼約是熄在細(xì)鉛胞質(zhì)口中的10倍2.由于造分泌矛到胞孕外的俗蛋白焰質(zhì)種嘗類少粒，因蔬此目折標(biāo)蛋異白容益易純誦化3.增進(jìn)探了蛋膨白質(zhì)告的折侵疊作塘用缺點(diǎn)境：1.在大迎腸桿銷菌細(xì)延胞中湊表達(dá)岔的外孝源真寧核蛋氏白質(zhì)窮，通犧常是叉不會(huì)劈燕分泌冶到胞拐外培題養(yǎng)基董中去停的2.由于伍分泌詢?cè)诎z外培鄙養(yǎng)基瓜中的不蛋白方質(zhì)相球當(dāng)稀糖釋，丸因此銅目標(biāo)繪蛋白款質(zhì)的裳純化閑過程真比較岔復(fù)雜2.融合蹈蛋白本質(zhì)的膀表達(dá)除了蜓直接富表達(dá)俘異源堆蛋白克外，飄還可容將外爹源基猛因與虧受體已菌自狂身的鄙蛋白檢質(zhì)編劫碼基迷因拼米接在煎一起英，并吐作為姓一個(gè)察開放罪型閱濕讀框雕架進(jìn)潮行表伍達(dá)。棍由這效種雜飯合基齡因表劫達(dá)出方的蛋凈白質(zhì)臣稱為劉融合高蛋白齒。在獲這種粘融合室蛋白鼓結(jié)構(gòu)賞中，價(jià)通常睛受體閥細(xì)菌獻(xiàn)的蛋燙白部憲分位姜于N端，唯異源盯蛋白堂位于C端。宇通過壤在DN您A水平軋上人哈工設(shè)結(jié)計(jì)引籃入的含蛋白底酶切合割位燒點(diǎn)或匹化學(xué)顫試劑躁特異秧性斷蕉裂位斬點(diǎn)，擊可以賞在體讀外從甜純化軌的融疏合蛋若白分串子中熟釋放濾回收除異源舒蛋白一、廊由報(bào)繩告基早因的啊編碼按序列幻玉區(qū)和侵另一殘個(gè)基因塑的啟濁動(dòng)子甩及其認(rèn)調(diào)節(jié)拉序列歸構(gòu)成駕的二、開由一缸種異作源蛋埋白質(zhì)趟基因院的編下碼序囑列區(qū)同耐寄主耐細(xì)胞影的誘奇導(dǎo)型圈啟動(dòng)洪子構(gòu)釀成由DN枯A體外仗重組公構(gòu)成筆的融葡合基鵝因有以兩種踩類型融合剩蛋白而質(zhì)：由克浴隆在籍一起珠的兩挑個(gè)或疫數(shù)個(gè)箭不同筆基因扔的編幕碼序賤列組探成的四融合救基因?qū)?，轉(zhuǎn)鞠譯產(chǎn)益生的用單一灶的多素肽序擱列。四它們?cè)龅墓θ芡客遣娈惓Ｙ€的，拳或者合是已贏經(jīng)發(fā)循生了覺變化融合慶基因廣：通常萌是指倒通過獅自發(fā)素突變蔥事件垂形成慮的、押或是及應(yīng)用DN恐A重組景技術(shù)香構(gòu)建匹的、轉(zhuǎn)一類木具有票來自歉兩個(gè)貿(mào)或兩何個(gè)以恥上不嫌同基哲因的鎖核苷名酸序陵列的災(zāi)新型掀基因融合餐蛋白碼中受星體蛋卸白部蠶分的灘存在托可能決會(huì)影睜響目揀的蛋點(diǎn)白的賤空間新構(gòu)象什和生兔物活坦性，胸如果奧將之與注入鳴人體礦還會(huì)侄導(dǎo)致盤免疫簡(jiǎn)反應(yīng)派，因勤此在隨制備啊和生恰產(chǎn)藥鍬用目第的蛋飛白時(shí)毀，將伍融合螞蛋白詞中的姻受體殿蛋白驢部分匹完整比除去康是必皇不可碑少的墳工序逼。融詳合蛋歇白的即位點(diǎn)裝專一溪性斷壘裂方至法有小兩種炎：1.化學(xué)寶斷裂喇法2.酶促級(jí)裂解踏法化學(xué)顯斷裂桶法用于遞蛋白獄位點(diǎn)營(yíng)專一召性化灶學(xué)斷墻裂的蘋最佳勤試劑急為溴化旗氰（CN陷Br）它與靠多肽誼鏈中務(wù)的甲硫澤氨酸殘基畏側(cè)鏈垂的硫醚添基反應(yīng)揚(yáng)，生昏成溴滋化亞飛氨內(nèi)樓酯，方后者腫不穩(wěn)氣定，辮在水剪的作充用下蘋肽鍵眼斷裂總，形偵成兩創(chuàng)個(gè)多肢肽降默解片恭段其協(xié)中上游姓肽段的甲院硫氨奪酸殘曠基轉(zhuǎn)槍化為高絲愿氨酸殘基熄，而乓下游回肽段N端的唯第一討位氨燥基酸抖殘基張保持僵不變循。這參一方歡法的聲優(yōu)點(diǎn)其是回藍(lán)收率園高（肚可達(dá)拔到85辯%以上族），舍專一往性強(qiáng)侮，而蒸且所皇產(chǎn)生館的目泄的蛋素白的N端不商含甲令硫氨仆酸，桃與真書核生徹物細(xì)素胞中賢的成瞧熟表遍達(dá)產(chǎn)度物較帽為接焦近。掩然而銜，如對(duì)果異蔽源蛋灘白分吊子內(nèi)留部含鉆有甲梅硫氨回酸殘貨基，表則不末能用彼此方脾法酶促腳裂解洗法：?jiǎn)螝堁呕凰鼽c(diǎn)蛋白陶酶酶襪促裂途解法煉的特乏點(diǎn)是晝斷裂嗚效率照更高饑，同萍時(shí)每夫種蛋分白酶絹均具拆有相歷應(yīng)的粉斷裂漫位點(diǎn)渡決定嚼簇，叨因此宣可供鑄選擇劣的專擦一性普斷裂梢位點(diǎn)鋒范圍脹較廣全。幾讓種斷室裂位賣點(diǎn)專路一性蒸最強(qiáng)墓的商彈品化肥蛋白假酶分暢別在祝多肽泄鏈中胖的精菌氨酸解、谷水氨酸功、賴災(zāi)氨酸邁殘基桐處切布開酰夢(mèng)胺鍵聰，形庫(kù)成不不含上攔述殘碰基的養(yǎng)下游涼斷裂救肽段虜，與粗溴化想氰化唱學(xué)斷警裂法朱相似球。用眾上述筋蛋白磚酶裂龜解融但合蛋搶白的罵前提茶條件捧是外瓦源蛋邊白分員子內(nèi)撤部不綠能含炕有精談氨酸喉、谷叢氨酸潑或賴礎(chǔ)氨酸未殘基騙，如濃果外鞭源基求因表漁達(dá)產(chǎn)木物為丈小分鑄子多憲肽，喊這一副限制粗條件明并不慈苛刻胃，但預(yù)大分環(huán)子量筑的異蝦源蛋臨白來饞說，轟上述災(zāi)三種密氨基言酸殘菊基的膏出現(xiàn)撤頻率丙是相予當(dāng)高借的。蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CLys-CArgCNNC受體蛋白目的蛋白酶促頑裂解程法：多殘鵲基位情點(diǎn)為了效克服納僅切槍單一寧氨基州酸殘弓基的幅蛋白暑酶所遠(yuǎn)帶來塌的應(yīng)彈用局佛限性彩，可品在受賣體蛋芽白編測(cè)碼序悼列與恒不含趨起始扇密碼畏子的至外源蛛基因渡之間粉加裝愈一段盡編碼彩寡肽嶺序列竹（Il昨e-驅(qū)Gl漿u-姓Gl雜y-質(zhì)Ar搭g）的櫻人工落接頭暈片段川，該恒寡肽位為具令有蛋溫白酶料活性杯的凝血蠟因子Xa的識(shí)尿別和犯作用行序列帥，其憲斷裂扣位點(diǎn)怎在Ar托g(shù)的C末端朗。純控化后維的融秧合蛋爺白用Xa處理咳，即桃可獲飼得不秩含上原述寡朝肽序呆列的胳目的央蛋白蜘。由動(dòng)于Xa的識(shí)無別作益用序爆列由葉四個(gè)評(píng)氨基歲酸殘開基組服成，全大多蘿數(shù)蛋殖白質(zhì)語(yǔ)中出澤現(xiàn)這周種寡惱肽序沈列的瞧概率惹極少潤(rùn)，因爛此這曲種方釋法可判廣泛獸用于啞從融連合蛋信白中窯回收沉各種鋼不同瓣大小慶的目搜的蛋標(biāo)白產(chǎn)炎物go啟動(dòng)子受體基因接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收酶促旗裂解紀(jì)法：多殘嘴基位稻點(diǎn)影響友克隆章基因歪在大聾腸桿絨菌中鄙的表達(dá)孫效率袍因素1、5’濤-U雜TR對(duì)克勿隆基街因表焰達(dá)效術(shù)率的口影響啟動(dòng)并子結(jié)皂構(gòu)對(duì)帽表達(dá)演效率翠的影舊響大腸混桿菌味啟動(dòng)跳子的袋保守窄序－35區(qū)（5’批TT決GA兆CA）和－10賢(5現(xiàn)’T頁(yè)AT叨AA騾T)區(qū);它們斧之間兵的距群離(1中7b竹p)啟動(dòng)頸子與趕克隆徐基因缺的間句隔距杏離對(duì)耗表達(dá)卡效率抗的影傻響當(dāng)mR熔NA分子5’－末纏端與SD序列仔之間攻的長(zhǎng)恐度小旺于15忌bp時(shí)，延轉(zhuǎn)譯甩效率稿下降護(hù)。2.質(zhì)粒贏載體耀的生我物學(xué)國(guó)特性閱對(duì)基洽因表恩達(dá)效災(zāi)率的伐影響質(zhì)粒誓載體表點(diǎn)的拷貝霉數(shù)對(duì)表騙達(dá)效鳥率的勇影響質(zhì)粒用載體睛的不犧穩(wěn)定或性對(duì)重表達(dá)傳效率滅的影岔響質(zhì)粒權(quán)拷貝沿?cái)?shù)質(zhì)粒春拷貝亂數(shù)對(duì)聯(lián)細(xì)菌善生長(zhǎng)袖代謝會(huì)的影攔響目前門實(shí)驗(yàn)徑室里返廣泛其使用剖的表克達(dá)型殼質(zhì)粒銹在每稅個(gè)大俯腸桿扁菌細(xì)扛胞中斤可達(dá)貫數(shù)百竭甚至器上千喉個(gè)拷碗貝，第質(zhì)粒爬的擴(kuò)盼增過么程通襲常發(fā)汽生在追受體毀細(xì)胞博的對(duì)縣數(shù)生普長(zhǎng)期圍內(nèi)，滔而此胞時(shí)正古是細(xì)盆菌生綢理代草謝最鄭旺盛憤的階排段。望質(zhì)粒逆分子機(jī)的過醫(yī)度增捕殖以掌及其如后目桌的基然因的手高效蝦表達(dá)包勢(shì)必退會(huì)影旗響受蹈體細(xì)言胞的士生長(zhǎng)球代謝凝，進(jìn)猴而導(dǎo)謀致重樹組質(zhì)磨粒的邀不穩(wěn)撈定性償以及午目的丹基因渾宏觀誼表達(dá)貼水平都的下德降解決咬上述窮難題充的一謀種有聽效策溉略是懼將重問組質(zhì)寧粒的作擴(kuò)增港納入旋可控刑制的返軌道質(zhì)粒畏擴(kuò)增恒時(shí)序筋的控票制pC婆P3跪3擁有每一個(gè)輕溫度驢可誘夜導(dǎo)型蛋的復(fù)諷制子阻在28睡℃時(shí)，寬每個(gè)臨細(xì)胞殺的質(zhì)尼粒拷換貝數(shù)車為60在42駝℃時(shí)，澆拷貝溫?cái)?shù)迅駁速增啞至30允0施-6擋00在此廊溫度普下，錢受體憑細(xì)胞減染色遮體上敏的CI基因墻表達(dá)武的溫帶度敏梳感型聽阻遏夕蛋白圓失活量因此充，用餓一種旋手段叼同時(shí)禁控制夠質(zhì)粒芽拷貝搞數(shù)和抱基因透的表眨達(dá)3.宗mR幼NA轉(zhuǎn)錄玻本的革分子拖特性悔對(duì)基速因表施達(dá)效迅率的尿影響轉(zhuǎn)譯海起始菌序列州對(duì)表逢達(dá)效柔率的避影響mR盲NA的穩(wěn)結(jié)定性繡對(duì)表莫達(dá)效架率的雷影響核糖災(zāi)體結(jié)掠合位倉(cāng)點(diǎn)對(duì)糟外源勤基因浮表達(dá)錄的影悶響SD序列伏的影扇響：一般披來說略，mR寇NA與核襯糖體全的結(jié)擺合程康度越饒強(qiáng)，校翻譯態(tài)的起喊始效偏率就君越高情，而臟這種悶結(jié)合噸程度擺主要土取決框于SD序列什與16慮SrR羞NA的堿姓基互負(fù)補(bǔ)性蓮，其慢中以GG章AG四個(gè)枕堿基銜序列據(jù)尤為瓣重要嫩。對(duì)象多數(shù)餅基因馳而言育，上看述四饅個(gè)堿場(chǎng)基中卡任何誰(shuí)一個(gè)秤換成C或T，均滑會(huì)導(dǎo)刑致翻還譯效眨率大匆幅度陡降低SD序列涉下游寶的堿抓基若摟為AA專AA或UU緊UU，翻膨譯效卸率最抵高；掛而CC姜CC或GG霸GG的翻尾譯效避率則被分別面是最雪高值半的50蒙%和25狀%。緊塘鄰AU邊G的前鳳三個(gè)毛堿基拐成份徐對(duì)翻芽譯起梅始也捧有影占響，淹對(duì)于繭大腸皂?xiàng)U菌β-半乳晚糖苷懷酶的mR辜NA而言雅，在托這個(gè)疾位置秩上最閉佳的霜堿基乖組合繪是UA剖U或CU萄U，如磁果用UU武C、UC桃A或AG剃G取代肺之，抬則酶摘的表吃達(dá)水嚴(yán)平低20倍。SD序列欣與起瀉始密剝碼子爬之間酬的序國(guó)列的波影響逗：SD序列齒與起巾始密竹碼子寬之間胖的距盆離的挪影響傲：SD序列些與起撕始密職碼子抹之間怪的精禮確距司離保釣證了RN者A在核販糖體裂上定棚位后啊，翻拾譯起啞始密勉碼子AU康G正好宜處于巨核糖識(shí)體復(fù)娃合物白結(jié)構(gòu)沉中的P位，勵(lì)這是值翻譯愛啟動(dòng)柿的前微提條再件。飲在很柿多情頸況下皇，SD序列懇位于AU狼G之前瞞大約假七個(gè)笑堿基遭處，紹在此停間隔慣中少限一個(gè)選堿基負(fù)或多飲一個(gè)綱堿基鞏，均五會(huì)導(dǎo)榴致翻擇譯起悲始效蒙率不沸同程貍度的闊降低恭。起始綿密碼戒子及的其后逆續(xù)若蒜干密楊碼子孟的影狡響大腸湊桿菌羽中的榮起始tR狂NA分子鉛可以正同時(shí)劑識(shí)別AU氏G、GU豎G和UU狼G三種友起始注密碼蹈子，絲式但其你識(shí)別爹頻率逐并不艇相同箭，通舌常GU飾G為AU萄G的50康%而UU誤G只及AU菊G的25淹%。除國(guó)此之跳外，鎖從AU昨G開始絞的前魄幾個(gè)稀密碼壇子堿舅基序秘列也煉至關(guān)嫩重要聞，至鑒少這屢一序仰列不框能與mR漆NA的5’端非抱編碼層區(qū)形距成莖續(xù)環(huán)結(jié)律構(gòu)，派否則械便會(huì)阻嚴(yán)重途干擾mR今NA在核鮮糖體周上的浮準(zhǔn)確趣定位目前胡廣泛想用于樓外源獲基因稍表達(dá)副的大召腸桿失菌表旅達(dá)型撐質(zhì)粒窄上，陶均含鵝有與牛啟動(dòng)榆子來茅源相齡同的桿核糖吐體結(jié)馳合位椒點(diǎn)序琴列，理序列切和間禽隔是啞最佳院的4.遺傳警密碼煎子的芬使用梯對(duì)基民因表故達(dá)效案率的蠅影響密碼朝子使襖用的以偏愛桿性現(xiàn)塔象的