現(xiàn)代生物技術課件 5胚胎工程

第七章

胚胎工程（Embryotechnology，

Embryo

engineering）第一節(jié)

胚胎工程

Embryoengineering

一、胚胎工程的概念

胚胎工程是通過人工操作胚胎，定向改變動物性狀使之為人類造福的一系列生物技術的總稱。其主要是對哺乳動物的胚胎進行某種人為操作，然后讓它繼續(xù)發(fā)育，獲得人們所需要的成體動物的技術。

胚胎工程相關基本概念1.超數(shù)排卵簡稱超排指通過給母畜注射適當?shù)募に?，維持更多卵泡正常發(fā)育而排出更多卵子的過程。2.體外受精,亦稱試管動物技術指把體外受精動物的卵子和精子取出在試管內混合，受精而形成胚胎的過程。在哺乳動物，體外受精胚胎一般在體外發(fā)育到一定時期后移植到受體雌性動物輸卵管或子宮內，妊娠到產仔。3.發(fā)育阻斷：

在化學組分確定的培養(yǎng)基中，早期胚胎往往不能完成從受精卵到囊胚的發(fā)育全過程,而停頓在某個特定的發(fā)育時期.這種現(xiàn)象被稱為“發(fā)育阻斷”。4.嵌合體：

生物學中把在同一個體中由基因型不同的細胞或組織互相接觸,且各自獨立并存(混合存在)的狀態(tài),稱為嵌合體。6.胚胎保存：

就是在體外或者體內把胚胎暫時貯存起來而不使其失去活力。7.胚胎干細胞：

也可被稱為多能性干細胞，是由哺乳動物早期胚胎內細胞團或原始生殖細胞分離的，經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后，所獲得的具有保持未分化的狀態(tài)和無限增殖能力的細胞系。無論在體外還是體內環(huán)境，ESCs都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。

8.轉基因動物是通過遺傳工程的和發(fā)育工程的手段對動物基因組的結構或組成進行人為的修飾或改造，使外源基因與動物本身的基因整合，并通過相應的動物繁殖育種技術使得這些經(jīng)修飾改造后的基因組在世代間得以傳遞和表現(xiàn)的工程化動物。9.動物克?。?/p>

指一個動物經(jīng)無性繁殖或孤雌生殖而產生出遺傳構成完全相同的多個后代動物。10.顯微受精：

亦稱顯微操作協(xié)助受精,是指通過對動物精子進行顯微操作，以幫助其受精的一系列技術。主要包括：胞質內精子注射、透明帶下精子注射及透明帶鉆洞和透明帶部分切口。二、發(fā)展歷史與意義

早在1891年，英國劍橋大學的赫普（WalterHeape）就在免子身上首次成功地進行了受精卵移植實驗。

20世紀30年代，一些學者用實驗動物如鼠、兔等作受精卵或胚胎移植的研究并獲得成功。以后又在綿羊、山羊、豬、牛和馬等家畜進行胚胎移植實驗，相繼獲得成功。

20世紀60年代以來，由于實驗技術的突破，如超數(shù)排卵、同期發(fā)情、胚胎采集、移植方法等研究的進展，使胚胎移植不僅在理論上而且在實踐上進入應用階段。近20年來，胚胎移植技術經(jīng)過不斷改進，已經(jīng)簡單、實用而且規(guī)范化，技術程序化。意義1）發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力,增加優(yōu)良品種數(shù)量。一頭優(yōu)良品種母牛卵巢內有幾萬個生殖細胞，在一個正常性周期內只有幾個卵泡同時發(fā)育，最終只有一個卵泡成熟并排卵，如果受精也只能生出一只良種牛犢。一只良種母畜一生只可能繁殖10個左右的后代，大部分時間用于妊娠和哺乳。如果能讓更多的卵泡成熟排卵，而又讓品質平凡的同種母畜“借腹懷胎”，那么，優(yōu)良母畜可以獲得后代的數(shù)目至少幾十倍。2.促進家畜改良的速度

由于提高了繁殖能力，可以使一頭母畜在一個性周期內繁殖更多的仔畜，從而在短期內使優(yōu)良種畜得到大量繁殖，促進了家畜改良的速度。例子——“世界山羊之王”

波爾山羊的快速繁殖體格高大，四肢粗壯，身體豐滿。平均日增重350克，屠宰出肉率可達60%以上。具有適應性強、采食性廣、繁殖性能好、肉用性十分顯著等特點。（一）胚胎工程研究主要包括：胚胎移植體外受精胚胎克隆胚胎性別鑒定胚胎嵌合顯微受精轉基因動物技術等。三、胚胎工程的研究內容

（二）胚胎工程技術胚胎工程采用的新技術包括:

胚胎分割技術、胚胎融合技術、卵核移植技術、體外受精技術、胚胎培養(yǎng)技術、胚胎移植技術、性別鑒定技術、胚胎冷凍技術等。

1.胚胎移植及其基本程序

（1）概念

胚胎移植俗稱“借腹懷胎”，是指于著床前自一母體（供體）收集胚胎，移植到另一母體（受體）內完成妊娠的過程。在畜牧業(yè)上，供體一般為優(yōu)秀母畜，而受體一般為品質較差些的母畜。（2）胚胎移植的基本技術程序

胚胎移植的基本技術程序包括：供體的超排和輸精→胚胎的收集（手術法和非手術法）→胚胎的檢出和冷凍保存→受體的發(fā)情同步處理→胚胎移植（手術法和非手術法）→受體妊娠產仔。

(1).手術法胚胎移植

將同期化處理后的受體動物仰面固定在手術床上，全身麻醉，腹部切口，將一側卵巢上有黃體發(fā)育的子宮遠端拉出，把胚胎輸入子宮上1/3處。這種方法移卵容易、損傷小、成功率較高。

(2).非手術法胚胎移植

使用類似于人工授精的專用輸胚槍，將其直接插入排卵側子宮角內，注入胚胎。

2.胚胎冷凍保存

要建立胚胎庫和長途運送胚胎，需要解決胚胎冷凍保存問題。冷凍保存方法大體可分為緩慢冷凍、快速冷凍、玻璃化冷凍三類。

3.胚胎分割

借助顯微操作技術或徒手操作方法，切割早期胚胎成2、4等多等份，再移植給受體母畜，制造同卵多仔后代的技術。分割前，一般均需先準備好空透明帶，將分割后的胚細胞團移入空透明帶內。胚胎分割是（1）擴大胚胎利用率的一種有效途徑，可以使胚胎移植的胚胎數(shù)目成倍增加。（2）可以產生遺傳性狀相同的后代，因此是一種廣義上的克隆技術。

4.胚胎融合

胚胎融合又叫胚胎嵌合，將兩個不同品種或不同種（除部分或全部細胞去透明帶）胚粘合在一起，或者各自一分為二，然后各取一半，融合成新的胚胎，移植給受體，使之發(fā)育成一個胚胎，產生具有雜交優(yōu)勢的新后代——嵌合體。可用內細胞團囊胚注入法，將一個品系的單個卵裂球注入另一品系胚胎的囊胚腔中。胚胎融合

將同一種類的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以獲得多個黑白相間的花鼠。將不同種的綿羊和山羊的胚胎融合，可得到擁有綿羊和山羊雙重特性的新品種——“綿山羊”。大鼠-小鼠、綿羊-山羊、馬-斑馬、黃牛-水牛等屬間嵌合體動物。意義：1）胚胎融合技術為動物胚胎發(fā)育及遺傳控制等研究提供了有效手段，嵌合體后代可集不同基因于一體，形成具有高度雜種優(yōu)勢的雜合體。2）胚胎融合成倍縮短家畜改良時間，為創(chuàng)造新型的家畜品種提供新的技術手段。

5.卵核移植

就是將優(yōu)良母畜胚胎的卵裂球分離開來，獲得幾十個具有優(yōu)良遺傳基因的供體核，然后將這些供體核分別注入一般母體的去核卵子中，產出遺傳素質相同的后代。目的是由一個優(yōu)良胚胎(同卵)生出更多的優(yōu)良后代，進一步提高優(yōu)良母畜繁殖潛力。6.動物性別控制與胚胎性別鑒定

性別控制是通過人為干預或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。

性別控制途徑:1.X與Y精子的分離；

2.胚胎性別鑒定。1)X-Y精子的分離X-Y精子在物理和化學上存在差異，因此可以采用相應的方法分離。離心法：

X精子DNA含量大于Y精子，因此X精子密度大。優(yōu)點：時間短；缺點：條件要求精確。電泳分離法：利用表面電荷差異，Y精子正電荷大于X精子，在負極集聚。

2)胚胎性別鑒定Y染色體短臂上一段SRY基因決定人的性別。

SRY基因啟動雄性形狀的發(fā)育，激發(fā)下游基因MLS的轉錄，引起睪酮分泌，形成雄性組織。XX染色體缺少SRY基因，染色體上DSS位點基因轉錄促進卵巢發(fā)育，形成雌性。性別鑒定方法

1.分子生物學方法根據(jù)Y染色體上的SRY基因的有無進行鑒別，可以采用PCR或FISH等分子方法進行確定性別。性別鑒定方法2.細胞生物學（組織學）方法胚胎階段的核型分析，根據(jù)檢出的XX、XY染色體來進行性別鑒定等。3.免疫學方法

H--Y抗原為雄性哺乳動物細胞膜所特有，檢測胚胎細胞膜上是否存在H--Y抗原即可鑒別其性別。

7.體外受精

體外受精就是采取雌性動物的卵子和雄性動物的精子，使其在試管中受精。商品犢牛屠宰前用激素處理，一次有20～50個卵泡發(fā)育，可獲得20～50個卵母細胞，因而體外受精技術可充分挖掘優(yōu)良母牛生育潛力。人類試管嬰兒。精子的采集與體外獲能處理卵子的回收與成熟培養(yǎng)體外受精

8.基因導入

給胚胎注入外源基因，增加新遺傳物質，并使之在后代中能穩(wěn)定表達出來。兩個目的:

①加快動物生產性能的改良速度；②實現(xiàn)常規(guī)選擇和雜交不能實現(xiàn)目標。

9.轉基因技術

指將外源基因整合到生物體內，得到穩(wěn)定表達，并使該基因能夠穩(wěn)定遺傳給后代的實驗技術。五、

胚胎工程應用（一）試管動物

將供體的精子和卵子在體外受精、體外培養(yǎng)胚胎，然后將發(fā)育到一定程度的胚胎移植入受體，可以得到各種動物。由于體外受精一般都在試管內進行，所以稱為“試管動物”。也有稱為“體外受精動物”。試管動物定義：

利用受精卵體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植獲得的各種動物。試管動物的培育流程

精子的采集與體外獲能處理卵子的回收與成熟培養(yǎng)卵子與精子的體外受精受精卵的體外發(fā)育成胚胎胚胎的移植體內發(fā)育與分娩（二）試管嬰兒試管嬰兒技術的發(fā)展歷史

1978年7月25日世界上第1例試管嬰兒LouisBrown在英國誕生。奠基人為英國婦產科專家Stephone

及胚胎學家Edwards1.試管動物的體外受精

一般將成熟的卵母細胞和獲能的精子在一個合適的體外環(huán)境條件下共同培養(yǎng)一段時間，就能完成體外受精。受精成功的標志至少是看受精卵是否可以發(fā)育至囊胚期階段。2.人工授精不同于試管動物制備時的人工受精，它不需從供體獲得精子和卵子，經(jīng)過成熟培養(yǎng)后受精。一般情況下，經(jīng)過超排卵處理的母體動物在停藥后24-48小時內有95%的母畜表現(xiàn)發(fā)情，在觀察到發(fā)情的當日上午和下午或夜晚和次日晨進行人工授精兩次。1980年6月澳大利亞,1981年12月美國、1983年10月日本1985年4月我國臺灣1986年12月香港

我國大陸第1例試管嬰兒于1988年3月10日,誕生于北京醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院婦產科,其創(chuàng)始人為張麗珠教授試管嬰兒技術發(fā)展的三個階段

由于體外授精技術方法不同，可分為3種孕育胎兒：第一代傳統(tǒng)的體外受精－胚胎移植(IVF－ET)“試管嬰兒”，第二代卵胞漿內單精子注射（ICSI）”試管嬰兒”，第三代種植前遺傳診斷(PGD)“試管嬰兒”。

第一代“試管嬰兒”

多種激素類藥物－－－女方超排卵在陰道超聲引導下，經(jīng)陰道后穹隆穿刺吸卵。取出后的卵子在一定條件下與精子共同培養(yǎng)、受精，經(jīng)過48小時左右便可發(fā)育成早期胚胎。將2-4個胚胎送回母體子宮內。由于都是在玻璃培養(yǎng)皿及試管中進行的，故以這種助孕技術出生的嬰兒稱——“試管嬰兒”。

該技術主要用于因女性導致的不育。當女方卵子不能通過輸卵管受精并運送到子宮腔時，“試管嬰兒”便成為唯一獲得生育機會的選擇。對于卵巢功能喪失或切除或有遺傳性疾病的患者，可采用供者卵子做“試管嬰兒”，對于子宮切除或發(fā)育不良的患者，則可取其卵子與丈夫精子進行體外授精后將早期胚胎植入代孕婦女子宮內發(fā)育并分娩。第二代“試管嬰兒”

第二代是卵胞漿內單精子注射“試管嬰兒”(ICSI)與第一代傳統(tǒng)“試管嬰兒”技術區(qū)別在于，它不是將許多卵子與數(shù)百萬-上億精子在體外直接混合培養(yǎng)，而在顯微鏡及微操縱儀下，用特制的微穿刺針將單個精子注射到一個發(fā)育成熟的卵子胞漿內，其他過程都與傳統(tǒng)“試管嬰兒”相同。

為嚴重的男性不育患者帶來了福音

嚴重的少精、弱精、畸形精子癥患者，輸精管道先天或后天缺損、阻塞或手術切除造成的阻塞性無精癥患者第三代“試管嬰兒”

第三代“試管嬰兒”技術即是對種植前的早期胚胎進行遺傳診斷(PGD)，有問題的胚胎棄之，只把正常胚胎移入子宮內防止遺傳病患兒的出生。在胚胎植入母體之前，應用分子學技術或熒光原位雜交方法測定DNA片段或特定染色體,將診斷無遺傳病的胚胎移植入子宮，

保證妊娠胚胎正常。試管嬰兒技術主要技術步驟超排卵卵泡監(jiān)測與取卵精子的優(yōu)選與處理體外受精(IVF)胚胎的體外培養(yǎng)及挑選胚胎移植(ET)移植后護理著床前準備胚胎著床前遺傳學診斷(PGD)

透明帶下人工受精術(SUZI)

此方法是將單個或多個精子直接注射到透明帶下卵細胞膜外的卵黃周隙(PVS),讓精卵受精,再移植宮內妊娠分娩。注射精子的數(shù)目一般多平均為3-5個精子,因為注射的精子越多,受精率高。此方法對卵的損傷不大，且多精受精率不高，目前已被較多地采用。卵細胞內注射精子受精術(ICSI)此方法是將精子直接注入卵細胞內,省略了受精過程的一系列變化,如精子與透明帶的結合、穿透,精卵細胞膜的融合等。有利于受精的完成,特別適用于少弱精患者。而且受精之前無需對精子特殊處理,精子不需要發(fā)生頂體反應,并克服了多精受精無法控制問題。該方法對卵的損傷大于上述二種方法。許多學者對ICSI試管嬰兒的產科結局畸形率和核型進行研究，發(fā)現(xiàn)ICSI和常規(guī)體外受精試管嬰兒在產科結局上沒有差異。

人工受精胚胎的體外培養(yǎng)及挑選

卵子和精子受精后,置于有一定濃度共培養(yǎng)細胞生長的條件培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。胚胎的挑選,大多學者主張精卵受精后經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3天，形成8～16細胞胚卵，然后根據(jù)胚胎評分標準對胚胎進行評分，挑選Ⅰ-Ⅱ級胚胎進行移植。

胚胎評分標準Ⅰ級:細胞大小均勻,形狀規(guī)則,胞質均勻清晰,無碎片。Ⅱ級:細胞大小略不均勻或形狀略不規(guī)則,胞質有顆?，F(xiàn)象,碎片<20%。胚胎移植(ET)大多數(shù)主張在8～16細胞時移植。即受精卵培養(yǎng)2～3d移植,為控制多胎妊娠,所以一般移植2～4個Ⅰ-Ⅱ級胚胎較合適。移植操作：用很細的導管經(jīng)宮頸進入子宮，然后將胚胎經(jīng)過該導管注入宮腔內。代理母親代理母親（Surrogatemother）指出借或出租自己子宮代替他人生育后代的婦女。在某些發(fā)達國家已發(fā)展成為一種新興的行業(yè)。愿意出租子宮的婦女情況：

——希望體驗懷孕和生孩子的滋味；

——由于曾經(jīng)過流產，包著“贖罪”心理想替別人生一個孩子

——出于經(jīng)濟考慮。胚胎著床前遺傳學診斷(PGD)著床前遺傳學診斷是避免遺傳病兒出生,達到優(yōu)生目的的重要手段。PGD是在胚胎移植到子宮之前確定其遺傳物質是否正常；卵裂期,對受精后第3天8～12細胞階段的卵裂球進行活檢;胚期:對滋養(yǎng)層細胞活檢可取得較多的細胞供遺傳學診斷,增加了診斷的可靠性。目前PGD方法主要有兩種:聚合酶鏈反應(PCR)和熒光原位雜交(FISH)技術。試管嬰兒技術的展望

IVF-ET技術已日漸完善,適用于各種不孕癥的治療,但成功率有待進一步提高?？蓛?yōu)選促排卵藥物；不斷改進體外受精技術；改善胚胎體外培養(yǎng)條件；進行良好的胚胎體外培養(yǎng);對胚胎進行著床前遺傳學診斷,避免遺傳病兒出生；隨科學技術水平不斷提高,能使IVF-ET妊娠成功率進一步上升,為不孕家庭帶來幸福和歡樂。結語

生殖使生命過程得到無限的延續(xù)，同時，有性生殖產生的后代具有雙親的優(yōu)點，使生物體不斷進化。由于有了生命的存在，從而有了豐富多采的世界。人類輔助生育技術為廣大不育患者帶來了極大的福音，也給人類帶來了新的思考！話說克隆

一、胚胎分割二、胚胎細胞克隆三、體細胞克隆四、轉基因動物克隆話說克隆胞胎分割是克隆嗎？體細胞克?。颗咛ゼ毎寺。咳祟惻咛タ寺?？轉基因動物克隆？從多胞胎現(xiàn)象談起正常的胚胎發(fā)育動物克隆

是指由一個動物經(jīng)無性繁殖或孤雌生殖而產生出的遺傳構成完全相同的多個后代動物。動物克隆的方法

目前看，比較現(xiàn)實可行的生產哺乳動物克隆的方法主要有胚胎分割和細胞核移植兩種。