分子標記輔助選擇育種

-.z分子標記輔助選擇育種傳統(tǒng)的育種主要依賴于植株的表現(xiàn)型選擇(Phenotypieal

selection)。環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán)境互作等多種因素會影響表型選擇效率。例如抗病性的鑒定就受發(fā)病的條件、植株生理狀況、評價標準等影響；品質(zhì)、產(chǎn)量等數(shù)量性狀的選擇、鑒定工作更困難。一個優(yōu)良品種的培育往往需花費7～8年甚至十幾年時間。如何提高選擇效率，是育種工作的關(guān)鍵。育種家在長期的育種實踐中不斷探索運用遺傳標記來提高育種的選擇效率與育種預見性。遺傳標記包括形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記與分子標記。棉花的芽黃、番茄的葉型、抗TMV的矮黃標記、水稻的紫色葉鞘等形態(tài)性狀標記，在育種工作中曾得到一定的應用。以非整倍體、缺失、倒位、易位等染色體數(shù)目、構(gòu)造變異為根底的細胞學標記，在小麥等作物的基因定位、連鎖圖譜構(gòu)建、染色體工程以及外緣基因鑒定中起到重要的作用，但許多作物難以獲得這類標記。生化標記主要是利用基因的表達產(chǎn)物如同工酶與貯藏蛋白，在一定程度上反映基因型差異。它們在小麥、玉米等作物遺傳育種中得到應用。但是它們多態(tài)性低，且受植株發(fā)育階段與環(huán)境條件及溫度、電泳條件等影響，難以滿足遺傳育種工作需要。以DNA多態(tài)性為根底的分子標記，目前已在作物遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的標記定位、種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析與品種指紋圖譜及純度鑒定等方面得到廣泛應用，尤其是分子標記輔助選擇(molecularmarker-as—sisted

selection，MAS)育種更受到人們的重視。第一節(jié)分子標記的類型和作用原理一、分子標記的類型和特點按技術(shù)特性，分子標記可分為三大類。第一類是以分子雜交為根底的DNA標記技術(shù)，主要有限制性片段長度多態(tài)性標記(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP標記)；第二類是以聚合酶鏈式反響(Polymerase

chainreaction，PCR反響)為根底的各種DNA指紋技術(shù)。PCR是Mullis等(1985)首創(chuàng)的在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促反響，合成特異DNA片段的一種方法。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。PCR反響分變性(denaturation)、復性(annealling)、延伸(e*ten—sion)三步(圖17—1)。變性指的是通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA的過程；復性(又稱退火)是指當溫度降低時，單鏈DNA回復形成雙鏈的過程，由于模板分子構(gòu)造較引物要復雜得多，而且反響體系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈；延伸是指在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，在聚合酶催化下進展以引物為起始點的5'-3'的DNA鏈延伸。以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)25～30個循環(huán)后，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量的復制，數(shù)量可達2×106-7拷貝。按照PCR所需引物類型又可分為：①單引物PCR標記，其多態(tài)性來源于單個隨機引物作用下擴增產(chǎn)物長度或序列的變異，包括隨機擴增多態(tài)性DNA標記(Random別amplificationpolymorphismDNA，RAPD)、簡單重復序列中間區(qū)域標記(1nter-simplesequencerepeatspolymorphisms，ISSR)等技術(shù)；②雙引物選擇性擴增的PCR標記，主要通過引物3'端堿基的變化獲得多態(tài)性，這種標記主要指擴增片段長度多態(tài)性標記(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通過克隆、測序來構(gòu)建特殊雙引物的PCR標記如簡單序列重復標記(Simplesequencerepeats，SSR)、序列特征化擴增區(qū)域(Segion，簡稱SCAR技術(shù))和序標位(Sequence—taggedsites，簡稱STS)等。第三類是一些新型的分子標記，如單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入／缺失等。表達序列標簽(E*pressedsequencestags，EST)是在cDNA文庫中隨機挑選克隆，并進展單邊測序(Singlepass

sequence)而產(chǎn)生的300～500bp的核苷酸片段。應用于分子標記輔助育種的標記主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它們的遺傳、表現(xiàn)特點總結(jié)于表17—1。分子標記是以DNA多態(tài)性為根底，因而具有以下優(yōu)點：①表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以DNA形式表現(xiàn)，無組織器官、發(fā)育時期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響；②數(shù)量多，理論上普及整個基因組；③多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無需專門人為創(chuàng)造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀基因嚴密連鎖的標記篩選創(chuàng)造了條件；④對目標性狀表達無不良影響，與不良性狀無必然連鎖；⑤局部標記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體；⑥本錢不是太高，一般實驗室均可進展。對于特定探針或引物可引進或根據(jù)發(fā)表的特定序列自行合成。二、分子標記的原理和遺傳特性(一)RFLP發(fā)現(xiàn)最早，目前應用最為廣泛的一種分子標記。這一類標記在20世紀70年代已被發(fā)現(xiàn)。1980年，人類首先將其用于構(gòu)建連鎖圖。目前，該技術(shù)已廣泛用于動植物連鎖圖的構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因的分子標記等。1．RFLP標記的原理植物基因組DNA上的堿基替換、插人、缺失或重復等，造成*種限制性切酶(restrictionenzymes，簡稱RE)酶切位點的增加或喪失是產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性的原因。對每一個DNA／RE組合而言，所產(chǎn)生的片段是特異性的，它可作為*一DNA所特有的"指紋〞。*一生物基因組DNA經(jīng)限制性切酶消化后，能產(chǎn)生數(shù)百萬條DNA片段，通過瓊脂糖電泳可將這些片段按大小順序別離，然后將它們按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移至易于操作的尼龍膜或硝酸纖維素膜上，用放射性同位素(如32P)或非放射性物質(zhì)(如生物素、地高辛等)標記的DNA作為探針，與膜上的DNA進展雜交(即Southern雜交)，假設*一位置上的DNA酶切片段與探針序列相似，或者說同源程度較高，則標記好的探針就結(jié)合在這個位置上。放射自顯影或酶學檢測后，即可顯示出不同材料對該探針的限制性片段多態(tài)性情況(圖17—2)。對于線粒體和葉綠體等相對較小的DNA分子，通過適宜的限制性切酶酶切，電泳分析后有可能直接檢測出DNA片段的差異，就不需Southern雜交。RFLP分析的探針，必須是單拷貝或寡拷貝的，否則，雜交結(jié)果不能顯示清晰可辨的帶型，表現(xiàn)為彌散狀，不易進展觀察分析。RFLP探針主要有三種來源，即cDNA克隆、植物基因組克隆(RandomGenome克隆，簡稱RG克隆)和PCR克隆。2．RFLP標記的特點RFLP標記具有共顯性的特點。共顯性(co-dominant)標記指的是雙親的兩個以上分子量不同的多態(tài)性片段均在F，中表現(xiàn)。它已被廣泛用于多種生物的遺傳分析，特別是構(gòu)建植物遺傳圖譜。RFLP標記所需DNA量大(5～15鵬)，檢測步驟繁瑣，需要的儀器、設備較多，周期長，檢測少數(shù)幾個探針時本錢較高，用作探針的DNA克隆其制備與存放較麻煩；檢測中要利用放射性同位素(通常為少')，易造成污染。盡管非放射性物質(zhì)標記方法可用，但價格高，雜交信號相對較弱，靈敏度也較同位素標記低。目前，RFLP標記直接用于育種本錢高，人們正致力于將RFLP標記轉(zhuǎn)化為PCR標記，便于育種上利用。(二)RAPD標記1．RAPD標記的原理Williams等(1990)以DNA聚合酶鏈式反響為根底而提出的。所謂RAPD標記是用隨機排列的寡聚脫氧核苷酸單鏈引物(長度為10個核苷酸)通過PCR擴增染色體組中的DNA所獲得的長度不同的多態(tài)性DNA片段。RAPD標記的原理同PCR技術(shù)，但又有別于常規(guī)的PCR反響。主要表現(xiàn)在以下3個方面：·①引物。常規(guī)的PCR反響所用的是一對引物，長度通常為20bp(堿基對)左右；RAPD所用的引物為一個，長度僅10bp。②反響條件。常規(guī)的PCR復性溫度較高，一般為55—60℃，而RAPD的復性溫度僅為36℃左右。③擴增產(chǎn)物。常規(guī)PCR產(chǎn)物為特異擴增，而RAPD產(chǎn)物為隨機擴增。這樣，RAPD反響在最初反響周期中，由于短的隨機單引物，低的退火溫度，一方面保證了核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對，另一方面因引物中堿基的隨機排列而又允許適當?shù)腻e配，從而擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性，提高了基因組DNA分析的效率。原理上與RAPD相似的還有AP—PCR(Arbitrarilyprimedpolymerae

chainreaction)。AP—PCR指在PCR反響中使用的引物長度與一般PCR反響中的引物相當，但在反響開場階段退火溫度較低，允許大量錯配，因此可引發(fā)隨機的擴增。一般在AP—PCR反響中應用放射性標記，其產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上別離，然后通過放射自顯影，檢測其多態(tài)性。2．RAPD標記的特點如果基因組在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插人、缺失或堿基突變，就可能導致特定引物結(jié)合位點分布發(fā)生相應變化，導致PCR產(chǎn)物增加、缺少或分子量大小的變化。假設PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生顯性的RAPD標記；假設PCR產(chǎn)物發(fā)生分子量變化則產(chǎn)生共顯性的RAPD標記，通過電泳分析即可檢測出基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性。RAPD標記一般表現(xiàn)為顯性遺傳，極少數(shù)表現(xiàn)為共顯性遺傳。顯性標記指的是F1的多態(tài)性片段與親本之一完全一樣，這樣在雜交組合后代中擴增產(chǎn)物的記錄可記為"有／無〞，即把每一隨機擴增多態(tài)性片段作為分子圖譜的一個位點。RAPD引物長一般為10個堿基，人工合成本錢低，一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物標準指紋圖譜。RAPD可以方便用于種質(zhì)資源指紋檔案建立，種遺傳多樣性分析和品種純度鑒定。因此RAPD也是一種潛力很大的分子標記。由于使用DNA擴增儀，操作自動化程度高，分析量大，且免去了RFLP中的探針制備、同位素標記、Southern印跡等步驟，分析速度很快。RAPD分析所需DNA樣品量少(一般5～10ng)，對DNA質(zhì)量要求較RFLP低。同時，RAPD標記還可轉(zhuǎn)化為RFLP探針，SCAR及STS等表現(xiàn)為共顯性和顯性的分子標記。RAPD最大缺點是重復性較差。RAPD標記的實驗條件摸索和引物的選擇是十分關(guān)鍵而艱巨的工作。為此研究人員應對不同物種做大量的探索工作，以確定每一物種的最正確反響程序包括模板DNA、引物、Mg2+濃度等。只要實驗條件標準化，可以提高RAPD標記的再現(xiàn)性。3．SCAR標記在RAPD技術(shù)的根底上，1993年，Paran等提出了一種將RAPD標記轉(zhuǎn)化成特異序列擴增區(qū)域標記，即SCAR標記。它的根本原理是：目標DNA經(jīng)RAPD分析后，將RAPD多態(tài)片段克隆一對克隆片段兩端測序一根據(jù)測序結(jié)果設計長為18～24bp的引物，一般引物前10個堿基應包括原來的RAPD擴增所用的引物。多態(tài)性片段克隆之前首先應從凝膠上回收該片段，由于Taq酶可使PCR產(chǎn)物3，末端帶上A尾巴，人工設計的克隆載體5，末端有一個突出的T堿基，這樣可使PCR產(chǎn)物高效地克隆到載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂平板，挑選重組克隆，測序分析、設計引物，PCR擴增，檢測是否還能擴增出原來的多態(tài)性條帶。這種轉(zhuǎn)化成功的標記就稱為SCAR標記。由于SCAR標記所用引物長，特異性擴增重復性好，可有效的用于分子育種。(三)AFLP它是荷蘭Keygene公司科學家Marc＆Pieter

l993年創(chuàng)造創(chuàng)造的一種DNA分子標記。該技術(shù)是對限制性酶切片段的選擇性擴增，又稱基于PCR的RFLP。鑒于AFLP標記的多態(tài)性強，一次可檢測到100—150個擴增產(chǎn)物，因而非常適合繪制品種指紋圖譜及遺傳多樣性的研究。1．AFLP標記的原理首先對基因組的DNA進展雙酶切，其中一種為酶切頻率較高的限制性切酶(frequentcutter)，另一種為酶切頻率較低的酶(rarecutter)。用酶切頻率較高的限制性切酶消化基因組DNA是為了產(chǎn)生易于擴增的，且可在測序膠上能較好別離出大小適宜的短DNA片段；用后者消化基因組DNA是限制用于擴增的模板DNA片段的數(shù)量。AFLP擴增數(shù)量是由酶切頻率較低的限制切酶在基因組中的酶切位點數(shù)量決定的。將酶切片段和含有與其黏性末端一樣的人工接頭連接，連接后的接頭序列及臨近切酶識別位點就作為以后PCR反響的引物結(jié)合位點，通過選擇在末端上分別添加1～3個選擇性堿基的不同引物，選擇性地識別具有特異配對順序的酶切片段與之結(jié)合，從而實現(xiàn)特異性擴增，最后用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳別離擴增產(chǎn)物。AFLP的原理示意圖見圖17—3。AFLP分析的根本步驟可以概括為：(1)將基因組DNA同時用2種限制性核酸切酶進展雙酶切后，形成分子量大小不等的隨機限制性片段，在這些DNA片段兩端連接上特定的寡核苷酸接頭(oligo

nucleotideadapters)。(2)通過接頭序列和PCR引物3'末端的識別，對限制性片段進展選擇擴增。一般PCR引物用同位素32P或33P標記。(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳別離特異擴增限制性片段。(4)將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移吸附到濾紙上，經(jīng)干膠儀進展干膠處理。(5)在*光片上感光，數(shù)日后沖洗膠片并進展結(jié)果分析。為了防止AFLP分析中的同位素操作，目前已開展了AFLP熒光標記、銀染等新的檢測擴增產(chǎn)物的手段。2.AFLP標記的特點AFLP技術(shù)結(jié)合了RFLP穩(wěn)定性和PCR技術(shù)高效性的優(yōu)點，不需要預先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何動植物的基因組研究。AFLP多態(tài)性遠遠超過其他分子標記，利用放射性同位素在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳可檢測到50—100條AFLP擴增產(chǎn)物，一次PCR反響可以同時檢測多個遺傳位點，被認為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項技術(shù)。AFLP標記多數(shù)具有共顯性表達、無復等位效應等優(yōu)點，表現(xiàn)孟德爾方式遺傳。該技術(shù)受專利保護，目前用于分析的試劑盒價格較貴，分析本錢高；對DNA的純度及切酶質(zhì)量要求也比擬高，這也是它的缺乏之處。(四)SSR1987年，Nakamura發(fā)現(xiàn)生物基因組有一種短的重復次數(shù)不同的核心序列，他們在生物體多態(tài)性水平極高，一般稱為可變數(shù)目串聯(lián)重復序列，簡稱VNTR(Variable量numbertande

repeat)。VNTR標記包括小衛(wèi)星(minisatellites)和微衛(wèi)星(mierosatellites)標記兩種。微衛(wèi)星標記，即SSR標記，是一類由1～6個堿基組成的基序(motif)串聯(lián)重復而成的DNA序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置(圖17—4A)。如(CA)n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重復，其中n代表重復次數(shù)，其大小在10～60之間。這類序列的重復長度具有高度變異性。對SSR的研究最早始于動物基因組，特別是人類和哺乳動物基因組研究。目前植物SSR研究也非常活潑。根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫檢索及基因文庫雜交篩選，已明確在植物核基因組中，各種SSR數(shù)量從大到小依次為(AT)n、An、Tn、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTI)n、(AC)n、(GT)n等。1．SSR標記的原理盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個基因組的不同位置上，但其兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設計一對特異引物，利用PCR技術(shù)，擴增每個位點的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。一般地，同一類微衛(wèi)星DNA可分布于整個基因組的不同位置上，通過其重復次數(shù)的不同以及重疊程度的不完全而造成每個座位的多態(tài)性。SSR標記多態(tài)性豐富，重復性好，其標記呈共顯性，分散分布于基因組中。建立SSR標記必須克隆足夠數(shù)量的SSR并進展測序，設計相應的PCR引物。其一般程序(圖17—4A)如下：①建立基因組DNA的質(zhì)粒文庫；②根據(jù)欲得到的SSR類型設計并合成寡聚核苷酸探針，通過菌落雜交篩選所需重組克隆。如欲獲得(AT)I／(TA)nSSR則可合成G(AT)n作探針，通過菌落原位雜交從文庫中篩選陽性克隆；③對陽性克隆DNA插人序列測序；④根據(jù)SSR兩側(cè)序列設計并合成引物；⑤以待研究的植物DNA為模板，用合成的引物進展PCR擴增反響；⑥高濃度瓊脂糖凝膠、非變性或變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性。目前，SSR標記技術(shù)已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、品種指紋圖譜繪制及品種純度檢測，以及目標性狀基因標記等領(lǐng)域。特別在人類和哺乳動物的分子連鎖圖譜中，已成為取代RFLP標記的第二代分子標記。2．SSR標記的特點SSR的檢測是依據(jù)其兩側(cè)特定的引物進展PCR擴增，因此是基于全基因組DNA擴增其微衛(wèi)星區(qū)域。檢測到的一般是一個單一的復等位基因位點。SSR標記為共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；重復性高，穩(wěn)定可靠。為了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳它可檢測出單拷貝差異。它兼具PCR反響的優(yōu)點，所需DNA樣品量少，對DNA質(zhì)量要求不太高。使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復序列兩翼的DNA序列。這可以在其他種的DNA數(shù)據(jù)庫中查詢，但更多的是必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星，從其基因組文庫中發(fā)現(xiàn)可用的克隆，進展測序，以其兩端的單拷貝序列設計引物，因此微衛(wèi)星標記的開發(fā)本錢高。3．ISSR標記在SSR標記的根底上開發(fā)的ISSR(inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNA)分子標記是用兩個相鄰SSR區(qū)域的引物去擴增它們中間單拷貝序列，通過電泳檢測其擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。引物設計采用二個核苷酸、三個核苷酸或四個核苷酸序列為基元(motifs)，以其不同重復次數(shù)再加上幾個非重復的錨定堿基組成隨機引物，從而保證引物與基因組DNA中SSR的5'或3'末端結(jié)合，通過PCR反響擴增兩個SSR之間的DNA片段。如(AC)n*，(TG)n*，(ATG)n*，(CTC)n*，(GAA)n*等(*代表非重復的錨定堿基)。Naganka等(1997)已在小麥的ISSR標記研究中發(fā)現(xiàn)ISSR標記可獲得數(shù)倍于RAPD標記的信息量。由于ISSR標記不像RFLP標記一樣步驟繁瑣，且不需同位素標記，因此，針對重復序列含量高的物種，利用ISSR法可與RFLP，RAPD等分子標記相媲美。它對填充遺傳連鎖圖上大的不飽和區(qū)段，富集有用的理想標記具有重要意義。(五)其他標記1．CAPs(cleavedamplificationpolymorphismsequence—taggedsites)

CAPs技術(shù)又稱為PCR—RFLP。用特異設計的PCR引物擴增目標材料時，由于特定位點的堿基突變、插入或缺失數(shù)很小，以至無多態(tài)性出現(xiàn)，往往需要對相應PCR擴增片段進展酶切處理，以檢測其多態(tài)性(Akopyanz等，1992)。其根本步驟是：先利用特定引物進展PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物用限制性切酶酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分開，溴化乙錠(EB)染色，觀察其多態(tài)性。與RFLP技術(shù)一樣，CAPs技術(shù)檢測的多態(tài)性其實是酶切片段大小的差異。Talbert等(1994)在小麥中將RFLP標記轉(zhuǎn)化為STS標記過程中，有些STS標記無多態(tài)，但酶切后又出現(xiàn)多態(tài)性。CAPs作為一種分子標記，有以下幾個優(yōu)點：①引物與限制酶組合非常多，增加了提醒多態(tài)性的時機，而且操作簡便，可用瓊脂糖電泳分析。②在真核生物中，CAPs標記呈共顯性。③所需DNA量少。④結(jié)果穩(wěn)定可靠。⑤操作簡便、快捷、自動化程度高。CAPs標記最成功的應用是構(gòu)建擬南芥遺傳圖譜。Konieczny等(1993)將RFLP探針兩端測序，合成PCR引物，在擬南芥基因組DNA中進展擴增，之后用一系列4堿基識別序列的限制性切酶酶切擴增產(chǎn)物，產(chǎn)生了很多CAPs標記，并且只用了28個巧植株，就將這些CAPs標記定位在各染色體上并構(gòu)建了遺傳圖譜。I-tittalmani(1995)等找到了一個抗稻瘟病基因Pi—2(t)的CAPs標記?？傊?，CAPs標記在二倍體植物研究中可發(fā)揮巨大的作用，是PCR標記的有力補充。但在多倍體植物中的應用有一定局性。另外，CAPs標記需使用切酶，這又增加了研究本錢，限制了該技術(shù)的廣泛應用。2．STS(Sequence—taggedsites)

STS是序列標簽位點或序標位的簡稱。它是指基因組中長度為200～500bp，且核苷酸／頃序的單拷貝序列，可采用PCR技術(shù)將其專一擴增出來。1989年，華盛頓大學的Olson等人利用STS單拷貝序列作為染色體特異的界標(Landmark)，即利用不同STS的排列順序和它們之間的間隔距離構(gòu)成STS圖譜，作為該物種的染色體框架圖(Frameworkmap)，它對基因組研究和新基因的克隆以及遺傳圖譜向物理圖譜的轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。STS引物的獲得主要來自RFLP單拷貝的探針序列，微衛(wèi)星序列。其中，最富信息和多態(tài)性的STS標記應該是擴增含有微衛(wèi)星重復順序的DNA區(qū)域所獲得的STS標記。迄今為止，STS引物的設計主要依據(jù)單拷貝的RFLP探針，根據(jù)RFLP探針兩端序列，設計適宜的引物，進展PCR擴增。與RFLP相比，STS標記最大的優(yōu)勢在于不需要保存探針克隆等活體物質(zhì)，只需從有關(guān)數(shù)據(jù)庫中調(diào)出其相關(guān)信息即可。最近，隨著人類基因組研究的深入，表達序列標定(e*pressedsequencetags，ESTs)應運而生。由于它直接與一個表達基因相關(guān)，很易于轉(zhuǎn)變成STS。STS標記表現(xiàn)共顯性遺傳，很容易在不同組合的遺傳圖譜間進展標記的轉(zhuǎn)移，且是溝通植物遺傳圖譜和物理圖譜的中介，它的實用價值很具吸引力。但是，與SSR標記一樣，STS標記的開發(fā)依賴于序列分析及引物合成，目前仍顯本錢太高。目前，國際上已開場收集STS信息，并建立起相應的信息庫，以便于各國同行隨時調(diào)用。第二節(jié)重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標記的篩選技術(shù)MAS育種不僅可以通過與目標基因嚴密連鎖的分子標記在早世代對目的性狀進展選擇，同時，也可以利用分子標記對輪回親本的背景進展選擇。目標基因的標記篩選(genetaggmg)是進展MAS育種的根底。用于MAS育種的分子標記需具備3個條件：①分子標記與目標基因嚴密連鎖(最好lcM或更小，或共別離)；②標記適用性強，重復性好，而且能經(jīng)濟簡便地檢測大量個體(當前以PCR為根底)；③不同遺傳背景選擇有效。遺傳背景的MAS則需要有*一親本基因型的分子標記研究根底。一、遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標記通過建立分子遺傳圖譜，可同時對許多重要農(nóng)藝性狀基因進展標記。許多農(nóng)作物上已構(gòu)建了以分子標記為根底的遺傳圖譜。這些圖譜在重要農(nóng)藝性狀基因的標記和定位、基因的圖位克隆、比擬作圖以及MAS育種等方面都是非常有意義的。但是由于分子標記數(shù)目的限制，目前作圖親本的選用首先考慮親本間的多態(tài)性水平，育種目標性狀考慮較少，這樣使遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標記篩選割裂開來。因此，根據(jù)育種目標選用兩個特殊栽培品種作為親本來構(gòu)建作物的品種——品種圖譜，將作物圖譜構(gòu)建和尋找與農(nóng)藝性狀基因嚴密連鎖的分子標記有機結(jié)合起來。遺傳作圖的原理與經(jīng)典連鎖測驗一致，即基于染色體的交換與重組。在細胞減數(shù)分裂時，非同源染色體上的基因相互獨立，自由組合，而位于同源染色體上的連鎖基因在減數(shù)分裂前期Ⅰ非姊妹染色單體間的交換而發(fā)生基因重組。用重組率來表示基因間的遺傳距離，圖距單位用厘摩(centi—Morgan，cM)表示，一個cM的大小大致符合1％的重組率。遺傳圖譜只顯示基因間在染色體上的相對位置，并不反映DNA的實際長度。遺傳圖譜構(gòu)建的主要環(huán)節(jié)為：①根據(jù)遺傳材料之間的多態(tài)性確定親本組合，建立作圖群體；②群體中不同植株的標記基因型分析；③借助計算機程序構(gòu)建連鎖群。因此，要構(gòu)建好的遺傳圖譜，首先應選擇適宜的親本及別離群體，這直接關(guān)系到建立遺傳圖譜的難易程度，遺傳圖譜的準確性及所建圖譜的適用性。親本間的差異不宜過大，否則會降低后代的結(jié)實率及所建圖譜的準確度。而親本間適度的差異圍因不同物種而異，通常多態(tài)性高的異交作物可選擇種不同品種作雜交親本，而多態(tài)性低的自交作物則需選擇不同種間或亞種間品種作雜交親本。如玉米的多態(tài)性極好，一般品種間配制的群體就可成為理想的分子標記作圖群體，而番茄的多態(tài)性較差，因而選用不同種間的后代構(gòu)建分子標記作圖群體。用于分子標記的遺傳作圖群體一般分為兩類，一類為暫時性別離群體，包括F2群體、BC等；另一類為加倍單倍體(doubledhap㈤d，DHL)和重組近交系(rebinantlnbred

Lines，RIL)等永久性別離群體。自花授粉作物與異花授粉作物作圖群體的構(gòu)建方法如圖17—5所示。它們的特點見表17—2。F2群體構(gòu)建比擬省時。但由于每個F2單株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了該群體的作圖能力。BC群體是由F1與親本之一回交產(chǎn)生的群體。由于該群體的配子類型較少，統(tǒng)計及作圖分析較為簡單，但提供的信息量少于F2群體，且可供作圖的材料有限，不能多代使用。假設通過遠緣雜交構(gòu)建的F2作圖群體，易發(fā)生向兩極瘋狂別離，標記比例易偏離3：1或1：2：1。第二類為永久性別離群體，包括重組自交系群體、加倍單倍體群體等。RIL群體是由F2經(jīng)多代自交一粒傳(Singleseeddescendant，簡稱SSD)使后代基因組相對純合的群體。RIL群體一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同實驗室的協(xié)同研究，而且作圖的準確度更高。缺點是建立RIL群體相當費時，而且有的物種很難產(chǎn)生RIL群體。DH群體是通過對Fl進展花藥離體培養(yǎng)或通過特殊技術(shù)(如棉花的半配生殖材料)得到單倍體植株后代，再經(jīng)染色體加倍而獲得的純合二倍體別離群體。因此DH群體也能夠長期保存。但構(gòu)建DH群體需深厚的組織培養(yǎng)根底和染色體加倍技術(shù)。與暫時性群體相比，永久性群體至少有兩方面長處：①群體中各品系的遺傳組成相對固定，可以通過種子繁殖代代相傳，不斷地增加新的遺傳標記，并可在不同的研究小組之間共享信息；②可以對性狀的鑒定進展重復試驗以得到可靠的結(jié)果。這對于*些病害的抗性鑒定以及受多基因控制且易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀的分析尤為重要。許多重要的農(nóng)藝性狀，如抗病性、抗蟲性、育性、一些抗逆性(抗鹽、抗旱)等都表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳的特點。由于這些性狀只受單基因或少數(shù)幾個主基因控制，一般均有顯隱性，在別離世代無法通過表型來識別目的基因位點是純合還是雜合，在幾對基因作用一樣時(如一些抗病基因?qū)Σ【牟煌硇》N反響不同)，無法識別哪些基因在起作用。特別是一些質(zhì)量性狀雖然受少數(shù)主基因控制，但其中許多性狀的表現(xiàn)還受遺傳背景，微效基因以及環(huán)境條件的影響。所以利用分子標記技術(shù)來定位、識別質(zhì)量性狀基因，特別是利用分子標記對一些易受環(huán)境影響的抗性基因的選擇就變得相對簡單。二、近等基因系的培育與重要農(nóng)藝性狀基因的標記近等基因系(NIL)是Young等人最早提出來的。近等基因系的培育主要是通過屢次的定向回交，它與原來的輪回親本就構(gòu)成了一對近等基因系(圖6—1)。在回交導人目標性狀基因的同時，與目標基因連鎖的染色體片段將隨之進入回交子代中(圖17—6)。NIL作圖的根本思路是鑒別位于導人的目標基因附近連鎖區(qū)的分子標記，借助于分子標記定位目標基因。利用這樣的品系可在不需要完整遺傳圖譜的情況下，先用一對近等基因系篩選與目標基因連鎖的分子標記，再用近等基因系間的雜交別離群體進展標記與目的基因連鎖的驗證，從而篩選出與目標基因連鎖的分子標記。Param等1991年運用212個隨機引物對萵苣抗感霜霉病(Dm)的近等基因系進展了RAPD分析，將4個RAPD標記定位在Dml和Dm3連鎖區(qū)域，6個定位在Dmll連鎖區(qū)。用近等基因系方法，還篩選出燕麥銹病，大麥莖銹斑病，小麥的腥黑穗病，番茄的線蟲、花葉病毒，煙草的黑根瘤等抗性基因以及很多其他的目標基因的分子標記。三、群體別離分析法與重要農(nóng)藝性狀基因的標記近等基因系的基因作圖效率很高，但一個近等基因系的培育消耗時間長，既費工又費時，另外，許多植物很難建造其近等基因系，如一些林木植物既無可利用的遺傳圖譜，又對其系譜了解很少，幾乎不可能創(chuàng)造近等基因系。1991年，Michelmore等提出了群體別離分析法(Bulkedsegregant

analysis，BSA)，為快速、高效篩選重要農(nóng)藝性狀基因的分子標記打下了根底。下面以*一抗病基因為例說明構(gòu)建BSA群體的方法。用*一作物的抗病品種與感病品種雜交，F(xiàn)2抗病基因發(fā)生別離。依抗病性表現(xiàn)將別離群體植株分為2組，1組為抗病的，另1組為感病的。然后分別從兩組中選出5～10株抗、感極端類型的植株提取DNA，等量混合構(gòu)成抗、感DNA池。對這兩個混合DNA池進展多態(tài)性分析，篩選出有多態(tài)性差異的標記，再分析F2所有的別離單株，以驗證該標記與目標性狀基因的連鎖關(guān)系以及連鎖的嚴密程度。NIL和BSA分析方法見圖17—6。利用BSA法，Michelmore等(1991)從100個隨機引物中篩選到3個與萵苣Dm5／8基因連鎖，且遺傳距離在15cM的分子標記。Giovannoni等通過的RFLP遺傳圖譜，選擇不同的RFLP基因型建立DNA混合庫，篩選出與西紅柿果實成熟及莖蒂脫落基因連鎖的RAPD標記。目前，利用該法已廣泛用于主要農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀基因連鎖的分子標記篩選。四、數(shù)量性狀基因的定位產(chǎn)量、成熟期、品質(zhì)、抗旱性等大多數(shù)重要的農(nóng)藝性狀均表現(xiàn)為數(shù)量性狀的遺傳特點。影響這類性狀的表型差異由多個基因位點(數(shù)量性狀位點，QTL)和環(huán)境共同決定，子代常常發(fā)生超親別離。篩選與多基因控制的數(shù)量性狀基因連鎖的分子標記要比篩選主基因控制的質(zhì)量性狀復雜得多。用于QTL分析的群體最好是永久性群體，如重組近交系和加倍單倍體群體。永久性群體中各品系的遺傳組成相對穩(wěn)定，可通過種子繁殖代代相傳，并可對目標性狀或易受環(huán)境因素影響的性狀進展重復鑒定以得到更為可靠的結(jié)果。從數(shù)量性狀遺傳分析的角度講，永久性群體中各品系基因純合，排除了基因間的顯性效應，不僅是研究控制數(shù)量性狀基因的加性、上位性及連鎖關(guān)系的理想材料，同時也可在多個環(huán)境和季節(jié)中研究數(shù)量性狀的基因型與環(huán)境互作關(guān)系。永久性群體培育費用高，因此QTL的標記與定位也有用暫時性別離群體。開場時，別離群體用單標記分析方法進展QTL的定位。例如，在一個P2群體，給予任何一個特定的標記M，如果所有MiMl同質(zhì)個體的表型平均值高于M2M2同質(zhì)個體，則就可以推斷存在一個QTL與這個標記連鎖。如果顯著水平設置太低，這種方法的假陽性高。此外，QTl不一定與任一給定的標記等位，盡管它與最近的標記之間具有很強的聯(lián)系，但它的準確位置和它的效應還不能確定。區(qū)間作圖的引入，克制了上述許多問題。它沿著染色體對相鄰標記區(qū)間逐個進展掃描，確定每個區(qū)間任一特定位置的QTL的似然輪廓。更準確地說，是確定是否存在一個QTL的似然比的對數(shù)(Lander

＆Bostien，1989)。在似然輪廓圖中，那些超過特定顯著水平的最大值處，說明是存在QTL的可能位置。顯著水平必須調(diào)整到防止來自多重測驗的假陽性，置信區(qū)間為相對于頂峰兩邊各1個LOD值的距離。它一直是應用最廣的一種方法，特別是它應用于自交衍生的群體。其軟件Mapmaker／QTL(White—headlnstitute，1993)是免費提供的。盡管已對該方法進展過許多精度和效率的研究，但都沒有產(chǎn)生重要的修改。第2種方法是Haley＆Knott(1992)開展的多元回歸分析法。該方法相對LOD作圖而言，在精度和準確度上與區(qū)間作圖產(chǎn)生非常相似的結(jié)果，它具有程序簡單、計算快速的優(yōu)點，適合于處理復雜的后代和模型中包含廣泛的固定效應的情形。例如，性別的不同和環(huán)境的不同。顯著性測驗和置信區(qū)間估計可利用Bootstrapping抽樣方法(Visscher

etal，1996；Lebreton

＆Visscher，1998)。第3種方法是同時用一個給定的染色體上的所有標記進展回歸模型分析，利用加權(quán)最小平方和法或者模擬進展顯著性測驗(Kearsey

＆Hyne，1994)。它具有計算速度快和在一個測驗中利用所有標記信息的優(yōu)點。如果一條染色體上只有一個QTL，所有定位和測定標記兩側(cè)之間的QTL效應的必要信息都可以利用。盡管你確實不知道哪些標記在QTL兩側(cè)或者每條染色體上只有一個QTL，不管QTL怎樣在染色體上分布，多重標記方法確實提供了模型的整個測第三節(jié)作物MAS育種一、作物MAS育種需具備的條件利用分子標記進展MAS育種可顯著提高育種效率。但是要開展MAS育種，必須具備如下條件：①分子標記與目標基因共別離或嚴密連鎖，一般要求兩者間的遺傳距離小于5cM，最好lcM或更小。②具有在大群體中利用分子標記進展篩選的有效手段，目前，主要應用自動化程度高，相對易于分析，且本錢較小的PCR技術(shù)。③篩選技術(shù)在不同實驗室間重復性好，且具有經(jīng)濟、易操作的特點。④應有實用化程度高并能協(xié)助育種家作出抉擇的計算機數(shù)據(jù)處理軟件。由單基因或寡基因控制的質(zhì)量性狀的分子標記，易于用于MAS育種。對大多數(shù)數(shù)量性狀遺傳的重要農(nóng)藝性狀，假設想利用MAS育種則必須具有準確的QTL圖譜。這不僅需要將復雜的性狀利用適宜軟件分成多個QTLs，并將各個QTL標記定位于適宜的遺傳圖譜上，而且還與是否有對該數(shù)量性狀表型進展準確檢測的方法，用于作圖的群體大小、可重復性、環(huán)境影響和不同遺傳背景的影響，以及是否有適宜的數(shù)量遺傳分析方法等有關(guān)。這為篩選*一復雜農(nóng)藝性狀的QTL標記提出了更高要求，也增加了MAS付諸育種實踐的難度。二、MAS育種方法篩選與質(zhì)量性狀基因嚴密連鎖的分子標記用于輔助育種，可免受環(huán)境條件影響。Deal等(1995)將普通小麥4D長臂上的抗鹽基因轉(zhuǎn)移到硬粒小麥4B染色體上，利用與該抗鹽基因連鎖的分子標記進展選擇，大大提高了選擇效率。研究說明，在一個有100個個體數(shù)的回交后代群體中，借助100個RFLP標記選擇，只需3代就可使后代的基因型回復到輪回親本的99．2％，而隨機挑選則需要7代才能到達。利用MAS技術(shù)在快速基因壘集方面也表現(xiàn)出其巨大優(yōu)越性，國際水稻所(1RRl)Mackill等(1992)已將抗稻瘟病基因Pi—1、Pi—Z5、Pi—ta準確定位，并建立了分別具有這三個基因的等基因系。通過MAS聚合雜交獲得3個抗稻瘟病基因壘集到一個材料中的個體。在水稻Rfl基因的MAS育種方面也已有成功報道。(一)回交育種由單基因或寡基因等質(zhì)量性狀基因控制的主要農(nóng)藝性狀，假設利用分子標記輔助選擇，主要應用回交育種分析方法。針對每一回交世代結(jié)合分子標記輔助選擇，篩選出含目標基因的優(yōu)異品系，進一步培育成新品種。假設利用分子標記跟蹤選擇回交后代中的QTIj，常由于該數(shù)量性狀在后代中處于別離狀態(tài)的QTL數(shù)目增加，需擴大回交群體，以增加所有QTL的有利基因同時整合在一個個體中的時機。另一方面，對多個QTLs進展回交轉(zhuǎn)育，可能會將較大比例的與這些QTL連鎖的供體基因組片段同時轉(zhuǎn)移到輪回親本中去。因此，該法不是利用分子標記輔助育種選擇QTL性狀的最優(yōu)方法。在回交育種過程中，尤其是野生種做供體時，盡管一些有利基因成功導人，但同時也帶來一些與目標基因連鎖的一些不利基因，成為連鎖累贅(Linkagedrag)。利用與目標基因嚴密連鎖的分子標記可直接選擇在目的基因附近發(fā)生重組的個體，從而防止了或顯著減少了連鎖累贅，加快了回交育種的進程。Young等研究發(fā)現(xiàn)，利用番茄高密度RFLP圖譜對通過回交育種育成的抗病品種所含Lperu抗TMV的Tmv2滲入片段大小檢測，最小4cM，最大超過51cM，可見常規(guī)育種對抗性基因附近的DNA大小選擇效果不大；模擬結(jié)果顯示，利用分子標記通過二次回交所縮短的滲入?yún)^(qū)段，在不用標記輔助時需100次回交才可到達同樣效果。1996年Tanksley提出了QTL定位和利用的AB分析方法(Advancedbackcross

analysis)策略，即利用野生種或遠緣的材料與優(yōu)良的品種雜交，再回交2～3代，利用分子標記同時發(fā)現(xiàn)和定位一些對產(chǎn)量或其他性狀有重要奉獻的主效QTls，這種方法已在番茄和水稻中被證實是行之有效的。例如，通過AB分析方法，發(fā)現(xiàn)O．rufipogon水稻野生種(圖17—7)中有2個可顯著提高我國雜交稻產(chǎn)量的QTIj。和原雜交稻相比，每個QTL可提高產(chǎn)量大約17％。而且這2個QTLs沒有與不良性狀連鎖，因此，他們有很大的利用潛力〔Tanksley

&McCouch，1997〕。(二)SIS—MAS(singlelarge—scaleMAS)這是Ribant等(1999)提出的。根本原理是在一個隨機雜交的混合大群體中，盡可能保證選擇群體足夠大，保證中選的植株在目標位點純合，而在目標位點以外的其他基因位點上保持大的遺傳多樣性，最好仍呈孟德爾式別離。這樣，分子標記篩選后，仍有很大遺傳變異供育種家通過傳統(tǒng)育種方法選擇，產(chǎn)生新的品種和雜交種。這種方法對于質(zhì)量性狀或數(shù)量性狀基因的MAS均適用。本方法可分為三步：第1步：利用傳統(tǒng)育種方法結(jié)合DNA指紋圖譜選擇用，于MAS的優(yōu)異親本，特別對于數(shù)量性狀而言，不同親本針對同一目標性狀要具有不同的重要的QTL，即具有更多的等位基因多樣性。第2步：確定該重要農(nóng)藝性狀QTL標記。利用中選親本與測驗系雜交，將Fl自交產(chǎn)生別離群體，一般200～300株，結(jié)合F2：3單株株行田間調(diào)查結(jié)果，以確定主要QTL的分子標記。表型數(shù)據(jù)必須是在不同地區(qū)種植獲得，以消除環(huán)境互作對目標基因表達的影響。標記的QTL不受環(huán)境改變的影響，且占表型方差的最大值(即要求該數(shù)量性狀位點必須對該目標性狀奉獻值大)。確定QTL標記的同時將中選的親本間雜交，其后代再自交1～2次產(chǎn)生一個很大別離群體。第3步：結(jié)合QTL標記的篩選，對上述別離群體中單株進展SLS—MAS。第4步：根據(jù)中選位點選擇目標材料，由于連鎖累贅，除中選QTL標記附近外，其他位點保持很大的遺傳多樣性，通過中選單株自交，基于本地生態(tài)需要進展系統(tǒng)選擇，育成新的優(yōu)異品系，或?qū)⒋伺c測驗系雜交產(chǎn)生新雜種。假設目標性狀位點兩邊均有QTL標記，則可降低連鎖累贅。(三)MAS聚合育種在實際育種工作中，通過聚合雜交將多個有利目標基因壘集到同一品種材料中，培育成一個具多種有利性狀的品種，如多個抗性基因的品種，在作物抗病蟲育種中保證品種對病蟲害的持久抗性將有十分重要的作用。但是，由于導人的新基因表現(xiàn)常被預先存在的基因所掩蓋或者許多基因的表型相似難以區(qū)分、隱性基因需要測交檢測、或接種條件要求很高等，導致許多抗性基因不一定在特定環(huán)境下表現(xiàn)出抗性，造成基于表型的抗性選擇將無法進展。MAS可利用分子標記跟蹤新的有利基因?qū)耍瑢⒊^觀測閾值外的有利基因高效地累積起來，為培育含有多抗、優(yōu)質(zhì)基因的品種提供了重要的途徑。利用MAS技術(shù)在快速壘集基因方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)越性。農(nóng)作物有許多基因的表現(xiàn)型是一樣的，通過經(jīng)典遺傳育種研究無法區(qū)分不同基因效應，從而也就不易鑒定一個性狀的產(chǎn)生是由于一個基因還是多個具有一樣表型的基因的共同作用。借助分子標記，可以先在不同親本中將基因定位，然后通過雜交或回交將不同的基因轉(zhuǎn)移到一個品種中去，通過檢測與不同基因連鎖的分子標記有無來推斷該個體是否含有相應的基因，以到達聚合選擇的目的。農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳所與農(nóng)科所合作，借助于MAS完成了Pm4a+Pm2+Pm6、Pm2+Pm6+Pm21、Pm4a+Pm21等小麥白粉病抗性基因的聚合，從而拓寬了現(xiàn)有育種材料對白粉病的抗譜，提高了抗性的持久性。利用具有單個不同抗性基因的4個親本，通過MAS三個世代即可獲得同時具有四個抗性基因的個體。國際水稻所Mackill利用MAS對水稻稻瘟病抗性基因Pi—1、pi-z5、pi-ta進展累集，獲得了抗兩種或三種小種的品系。利用RAPD與RFLP標記，Yoshimura等已將水稻白葉枯抗性基因*al、*a3、*a4、*a5與*a10等基因進展了不同方式的聚合。在水稻中已將含有抗白葉枯基因*a21的材料與抗蟲基因材料雜交，利用*a21的STS標記獲得了同時具有*a2，和抗蟲基因的材料曠通常應用MAS聚合不同基因時，F(xiàn)2別離群體大小應以200～500株為宜，先對易操作的分子標記進展初選，再進展復雜的RFLP驗證，可提高聚合效率。隨著育種目標的多樣性，為了選育出集高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲等優(yōu)良性狀于一身的作物新品種，應考慮目標性狀標記篩選時親本選擇的代表性，即最好選擇與育種直接有關(guān)的親本材料，所構(gòu)建群體也最好既是遺傳研究群體，又是育種群體，在此根底上，多個目標性狀的聚合需通過群體改進的方法實現(xiàn)。不容置疑，分子標記技術(shù)賦予了群體改進新的涵，借助于分子標記技術(shù)可快速獲得集多個目標農(nóng)藝性狀于一身的作物新品種。農(nóng)業(yè)大學棉花研究所在多目標性狀聚合的修飾回交方法育種的根底上，提出了MAS的修飾回交聚合育種方法。修飾回交是將雜種品系間雜交和回交相結(jié)合的一種方法，即回交品系間的雜交法。將各具不同優(yōu)良性狀的雜交組合分別和同一輪回親本進展回交，獲得各具特點的回交品系，再把不同回交品系進展雜交聚合。目前利用分子標記技術(shù)可對目標性狀進展前景選擇，對輪回親本的遺傳背景進展背景選擇，就可以到達快速打破目標性狀間的負相關(guān)，獲得聚合多個目標性狀