分解纖維素的微生物的分離

課題3分解纖維素的微生物的分離當(dāng)前第1頁\共有46頁\編于星期五\18點一、課題背景

閱讀課本27頁基礎(chǔ)知識部分第一、二段，回答下列問題：1.纖維素在生物圈的分布狀況？

纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。（一）纖維素與纖維素酶當(dāng)前第2頁\共有46頁\編于星期五\18點

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因為它們能夠產(chǎn)生纖維素酶。草食性動物是怎樣消化食物中纖維素的？胃中生活著大量分解纖維素的微生物，能產(chǎn)生纖維素酶，將纖維素分解成葡萄糖。當(dāng)前第3頁\共有46頁\編于星期五\18點纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶2.纖維素酶的組成及作用？當(dāng)前第4頁\共有46頁\編于星期五\18點3、纖維素的分解能分解纖維素的微生物有各種細(xì)菌、真菌和少數(shù)放線菌。方法：濾紙崩潰法4、纖維素酶活性的測定實驗：當(dāng)前第5頁\共有46頁\編于星期五\18點濾紙崩潰法體會纖維素酶作用的實驗：當(dāng)前第6頁\共有46頁\編于星期五\18點①取二支20mL的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？當(dāng)前第7頁\共有46頁\編于星期五\18點纖維素酶是一種，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即、CX酶和，前兩種酶使纖維素分解成，第三種酶將纖維二糖分解成。復(fù)合酶C1酶葡萄糖苷酶是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，纖維素的分解需要在的催化作用下完成。棉花纖維素酶基礎(chǔ)知識填空：纖維二糖葡萄糖當(dāng)前第8頁\共有46頁\編于星期五\18點下列生物能分解纖維素的是（）①人②兔③牛④蘑菇⑤纖維桿菌A.①②③④⑤B.②③⑤C.②③④⑤D.③⑤C當(dāng)前第9頁\共有46頁\編于星期五\18點（二）纖維素分解菌的篩選1、篩選纖維素分解菌的方法是______________。該方法可以通過________反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法顏色閱讀課本課本28頁相關(guān)部分，回答下列問題：當(dāng)前第10頁\共有46頁\編于星期五\18點2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被_________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_____________為中心的________，我們可以通過____________來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈剛果紅染色法：這種方法能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進(jìn)行篩選當(dāng)前第11頁\共有46頁\編于星期五\18點練一練：1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A.纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖當(dāng)前第12頁\共有46頁\編于星期五\18點2.利用剛果紅染色法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩

選出了纖維素分解菌當(dāng)前第13頁\共有46頁\編于星期五\18點當(dāng)前第14頁\共有46頁\編于星期五\18點土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（操作流程）（此步可省略）三、實驗操作當(dāng)前第15頁\共有46頁\編于星期五\18點本實驗流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖以后，再將菌液涂布到選擇培養(yǎng)基上?！寂詸谒伎碱}〗當(dāng)前第16頁\共有46頁\編于星期五\18點①分布環(huán)境:1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中操作步驟生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。②原因:當(dāng)前第17頁\共有46頁\編于星期五\18點③實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。當(dāng)前第18頁\共有46頁\編于星期五\18點〖旁欄思考題〗為什么要在富含纖維素的環(huán)境中找纖維素分解菌？在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高〖旁欄思考題〗將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm的腐殖土壤中。當(dāng)前第19頁\共有46頁\編于星期五\18點1、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于______（固體、液體）培養(yǎng)基，原因是____________________?！举Y料二】選擇培養(yǎng)液體沒有添加瓊脂成分當(dāng)前第20頁\共有46頁\編于星期五\18點2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。①目的：②制備選擇培養(yǎng)基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。當(dāng)前第21頁\共有46頁\編于星期五\18點培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機(jī)鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機(jī)鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水當(dāng)前第22頁\共有46頁\編于星期五\18點3、該培養(yǎng)基對微生物________（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機(jī)制是_______________________________________________________。以纖維素粉為唯一碳源，能分解纖維素的微生物可以大量繁殖具有當(dāng)前第23頁\共有46頁\編于星期五\18點按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。4、梯度稀釋101102103104105106當(dāng)前第24頁\共有46頁\編于星期五\18點5.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備鑒別培養(yǎng)基:（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。當(dāng)前第25頁\共有46頁\編于星期五\18點若設(shè)置一個對照實驗說明選擇培養(yǎng)的作用，應(yīng)控制的變量是將__________改為_________。你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用？葡萄糖纖維素粉當(dāng)前第26頁\共有46頁\編于星期五\18點〖思考2〗實驗流程中“選擇培養(yǎng)”的目的是什么？其目的是增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。當(dāng)前第27頁\共有46頁\編于星期五\18點

參照課本29頁旁欄中的比例配置，回答下列問題a.旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？b.這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑有選擇作用，本配方中的碳源是纖維素，所以能分解纖維素的微生物可以大量繁殖當(dāng)前第28頁\共有46頁\編于星期五\18點〖旁欄思考題〗為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用當(dāng)前第29頁\共有46頁\編于星期五\18點【資料三】剛果紅染色法方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)方法二：在倒平板時就加入剛果紅當(dāng)前第30頁\共有46頁\編于星期五\18點方法一

缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。

方法二

缺點一是由于培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質(zhì)，可以使能產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)；缺點二有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅，形成明顯的透明圈與，纖維素分解菌不易區(qū)分。優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題。當(dāng)前第31頁\共有46頁\編于星期五\18點比較項目分解尿素的細(xì)菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目的將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)當(dāng)前第32頁\共有46頁\編于星期五\18點選擇培養(yǎng)的操作方法將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。思考：據(jù)“搖床”、“震蕩”分析纖維素分解菌的異化作用類型？四、操作提示當(dāng)前第33頁\共有46頁\編于星期五\18點

1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。五、結(jié)果分析與評價當(dāng)前第34頁\共有46頁\編于星期五\18點為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_____________實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有______發(fā)酵和______發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進(jìn)行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶液體固體葡萄糖六、課題延伸當(dāng)前第35頁\共有46頁\編于星期五\18點分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實驗設(shè)計土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)梯度稀釋前置染色法后置染色法課堂總結(jié)挑選出產(chǎn)生透明圈的菌落當(dāng)前第36頁\共有46頁\編于星期五\18點D1、下列材料中纖維素含量最高的是()A．楊樹B．小麥C．玉米D．棉花當(dāng)前第37頁\共有46頁\編于星期五\18點C2、纖維素酶能夠分解()A．纖維素的微生物B．淀粉的微生物C．纖維素D．淀粉當(dāng)前第38頁\共有46頁\編于星期五\18點B3、剛果紅能與哪項物質(zhì)形成紅色復(fù)合物()A．纖維二糖B．纖維素C．葡萄糖D．麥芽糖當(dāng)前第39頁\共有46頁\編于星期五\18點B4、尋找纖維素分解菌應(yīng)到…()A．濕潤的環(huán)境中B．富含纖維素的環(huán)境中C．富含無機(jī)鹽的環(huán)境中D．池塘中當(dāng)前第40頁\共有46頁\編于星期五\18點D5、纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基有選擇作用，原因在于其含有()A．NaNO3B．KClC．酵母膏