發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基設計

培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質和原料。同時培養(yǎng)基也為微生物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它所必須的條件。

發(fā)酵培養(yǎng)基的作用：

滿足菌體的生長促進產物的形成培養(yǎng)基當前第1頁\共有54頁\編于星期五\18點發(fā)酵培養(yǎng)基的要求：①培養(yǎng)基能夠滿足產物最經濟的合成。②發(fā)酵后所形成的副產物盡可能的少。③培養(yǎng)基的原料應因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產上的供應。④所選用的培養(yǎng)基應能滿足總體工藝的要求，如不應該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。當前第2頁\共有54頁\編于星期五\18點第一節(jié)培養(yǎng)基的類型及功能培養(yǎng)基按其組成物質的純度、狀態(tài)、用途可分為三大類型

一、按營養(yǎng)物質來源分為

合成培養(yǎng)基：原料其化學成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過程的物質變化規(guī)律

培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產

天然培養(yǎng)基：采用天然原料

原料來源豐富（大多為農副產品）、價格低廉、適于工業(yè)化生產

原料質量等方面不加控制會影響生產穩(wěn)定性

半合成培養(yǎng)基：在天然培養(yǎng)基中加入一些化學藥品補充無機鹽成分當前第3頁\共有54頁\編于星期五\18點二、按物理狀態(tài)分為固體培養(yǎng)基

：適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產。

半固體培養(yǎng)基：即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%，主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基：80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。四、按生產用途（從發(fā)酵生產應用考慮）培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面）培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。

三、按培養(yǎng)基用途分為：基礎培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基

當前第4頁\共有54頁\編于星期五\18點孢子培養(yǎng)基要求：能使菌體生長快，產生孢子數(shù)量大、質量好，且不會引起菌種變異。特點C、N源不宜多，否則只長菌絲，少長或不長孢子；無機鹽濃度要適當控制，否則會影響孢子的顏色和孢子量。當前第5頁\共有54頁\編于星期五\18點種子培養(yǎng)基要求營養(yǎng)豐富、完全，氮和維生素的含量高些；培養(yǎng)基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子發(fā)芽生長，保證球形；pH要穩(wěn)定；最后一級盡可能接近發(fā)酵培養(yǎng)基，常加入少量發(fā)酵合成期才大量需要的物質。當前第6頁\共有54頁\編于星期五\18點發(fā)酵培養(yǎng)基目的：使接種菌絲生長并能高效表達，獲得高的發(fā)酵產量，同時組分盡可能單一，以保證高的得率。要求營養(yǎng)豐富完全，有利于產物合成；不能大量加入快C、快N源，應和慢C、N源相結合；在產物分泌期間，pH穩(wěn)定；加入適量合成所需的物質，如前體等，進行定向發(fā)酵；采用中間補料，以提高發(fā)酵單位；原料的考慮——成本問題當前第7頁\共有54頁\編于星期五\18點培養(yǎng)基有哪些化學成分組成？這些成分的來源有哪些（尤其是C、N源）？各成分的作用是什么？在應用天然C、N源時應注意什么問題？第二節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及來源

當前第8頁\共有54頁\編于星期五\18點一、碳源1、作用提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分。

提供合成目的產物所必須的碳成分。2、來源糖類、油脂、有機酸、正烷烴當前第9頁\共有54頁\編于星期五\18點3、工業(yè)上常用的糖類①葡萄糖

所有的微生物都能利用葡萄糖。但是會引起葡萄糖效應。

工業(yè)上常用淀粉水解糖，但是糖液必須達到一定的質量指標。當前第10頁\共有54頁\編于星期五\18點不同的制糖工藝生產的糖液質量差別很大當前第11頁\共有54頁\編于星期五\18點②糖蜜糖蜜是制糖生產時的結晶母液，它是制糖工業(yè)的副產物。

糖蜜主要含有蔗糖，總糖可達50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。當前第12頁\共有54頁\編于星期五\18點不用加工方法對甘蔗糖蜜的影響當前第13頁\共有54頁\編于星期五\18點糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質，其中有些是有用的，但是許多都會對發(fā)酵產生不利的影響，需要進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物質：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶）生物素（發(fā)酵控制）預處理：澄清→脫鈣→脫除生物素例：檸檬酸發(fā)酵有害物質：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）預處理：→黃血鹽當前第14頁\共有54頁\編于星期五\18點②淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格底難利用，可以解除葡萄糖效應當前第15頁\共有54頁\編于星期五\18點二、氮源

氮源主要用于構成菌體細胞物質（氨基酸，蛋白質、核酸等）和含氮代謝物。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。

1、無機氮源種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH當前第16頁\共有54頁\編于星期五\18點

無機氮源被菌體作為氮源利用后，培養(yǎng)液中就留下了酸性或堿性物質，這種經微生物生理作用（代謝）后能形成酸性物質的無機氮源叫生理酸性物質，如硫酸胺，若菌體代謝后能產生堿性物質的則此種無機氮源稱為生理堿性物質，如硝酸鈉。正確使用生理酸堿性物質，對穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程的pH有積極作用。所以選擇合適的無機氮源有兩層意義：

滿足菌體生長穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程中的pH當前第17頁\共有54頁\編于星期五\18點2、有機氮源來源：工業(yè)上常用的有機氮源都是一些廉價的原料，花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒糟。成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等當前第18頁\共有54頁\編于星期五\18點氮源使用的一些相關問題：

有機氮源和無機氮源應當混合使用早期：容易利用易同化的氮源—無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質

有些產物會受氮源的誘導和阻遏例：蛋白酶的生產

有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力

開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍然是令人感興趣的課題當前第19頁\共有54頁\編于星期五\18點三、無機鹽及微量元素1、作用：各種不一樣（低濃度促進生長，高難度抑制生長）2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產品，以實驗決定4、使用注意點A.對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮當前第20頁\共有54頁\編于星期五\18點例：鐵離子青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20μg/ml

發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）例：黑曲酶NRRL-330，生產α-淀粉酶，pH對酶活的影響

pH酶活不加4.25120分鐘加K2HPO45.4530分鐘加KH2PO44.6275分鐘當前第21頁\共有54頁\編于星期五\18點四、生長因子、前體和產物促進劑

從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。

1、生長因子

如以糖質原料為碳源的谷氨酸生產菌均為生物素缺陷型，以生物素為生長因子，生長因子對發(fā)酵的調控起到重要的作用。

有機氮源是這些生長因子的重要來源，多數(shù)有機氮源含有較多的B族維生素和微量元素及一些微生物生長不可缺少的生長因子。當前第22頁\共有54頁\編于星期五\18點

前體指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中合成到產物物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大的提高。2、前體青霉素：分子量356苯乙酸：分子量136當前第23頁\共有54頁\編于星期五\18點作用：前體有助于提高產量和組份。用量：前體的用量可以按分子量衡算，具體使用有個轉化率的問題。例：6000單位/ml的青霉素G，需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%實際使用時的轉化率在46-90%之間例某廠單耗為：0.337（kg/10億青霉素）轉化率為：13.8/[(0.337/0.6)*36]=68%當前第24頁\共有54頁\編于星期五\18點用法：前體使用時普遍采用流加的方法。前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07%。

前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化，流加也有利于提高前體的轉化率。當前第25頁\共有54頁\編于星期五\18點3、產物促進劑所謂產物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產量的添加劑。當前第26頁\共有54頁\編于星期五\18點

促進劑提高產量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進劑本身是酶的誘導物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產；也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。當前第27頁\共有54頁\編于星期五\18點五、水

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大。

水源質量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。對于釀造行業(yè)，水的重要性不言而喻。對于常規(guī)發(fā)酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清潔的水。當前第28頁\共有54頁\編于星期五\18點第三節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化

目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經驗配方，再結合所用菌種和產品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基。

當前第29頁\共有54頁\編于星期五\18點四個原則目的明確營養(yǎng)協(xié)調物理化學條件適宜經濟節(jié)約以粗代精以野代家以廢代好以簡代繁四種方法生態(tài)模擬查閱文獻精心設計試驗比較當前第30頁\共有54頁\編于星期五\18點一、培養(yǎng)基成分選擇的原則

菌種的同化能力

代謝的阻遏和誘導

合適的C、N比100：0.2～2.0

pH的要求

當前第31頁\共有54頁\編于星期五\18點培養(yǎng)基的設計了解菌種名稱、營養(yǎng)、生活史、生長環(huán)境、生理生化特性培養(yǎng)基種類的確定營養(yǎng)類型：主要底物，降解特點生長環(huán)境：溫度、pH、滲透壓（無機鹽）、耗氧情況菌代謝產物的化學結構、性質、途徑合成條件天然替代品的確定及其預處理當前第32頁\共有54頁\編于星期五\18點培養(yǎng)基的設計（續(xù)）基本培養(yǎng)基的確定來源廣泛、價廉；適于生長、繁殖、產物積累；不同階段有不同的基本培養(yǎng)基；用量的計算：C、N及前體。培養(yǎng)基的優(yōu)化單因子實驗正交實驗響應面分析方法當前第33頁\共有54頁\編于星期五\18點（一）、理論轉化率與實際轉化率

理論轉化率是指理想狀態(tài)下根據(jù)微生物的代謝途徑進行物料衡算，所得出的轉化率的大小。

實際轉化率是指實際發(fā)酵過程中轉化率的大小

如何使實際轉化率接近于理論轉化是發(fā)酵控制的一個目標

二、成分含量的確定實際轉化率往往要小于理論轉化率當前第34頁\共有54頁\編于星期五\18點例:

如在酒精生產中葡萄糖轉化為酒精的理論轉化率計算如下：

葡萄糖轉化為酒精的代謝總反應衡算式為：

C6H12O62C2H5OH+2CO2

葡萄糖轉化為酒精的理論得率為：

Y=2×46/162=0.57

當前第35頁\共有54頁\編于星期五\18點當前第36頁\共有54頁\編于星期五\18點（二）、實驗設計

培養(yǎng)基成分的含量最終都是通過實驗獲得的

合理的實驗方法多因子實驗：均勻設計正交實驗設計響應面分析等單因子實驗當前第37頁\共有54頁\編于星期五\18點③當培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減少實驗次數(shù)常采用一些合理的實驗設計方法。三、培養(yǎng)基設計的步驟①根據(jù)前人的經驗和培養(yǎng)基成分確定時一些必須考慮的問題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；當前第38頁\共有54頁\編于星期五\18點類胡蘿卜素高產菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第39頁\共有54頁\編于星期五\18點原培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第40頁\共有54頁\編于星期五\18點初步確定可能的培養(yǎng)基成分（以碳源為例）發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第41頁\共有54頁\編于星期五\18點

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分（以碳源為例）考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度0.2%比較好發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第42頁\共有54頁\編于星期五\18點結果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽：復合無機鹽0.05%發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第43頁\共有54頁\編于星期五\18點正交設計確定優(yōu)化的配方發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第44頁\共有54頁\編于星期五\18點發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第45頁\共有54頁\編于星期五\18點改進后培養(yǎng)基原培養(yǎng)基改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結果發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化當前第46頁\共有54頁\編于星期五\18點四、搖瓶水平到反應器水平的優(yōu)化配方搖瓶、反應器培養(yǎng)基研究的兩個層次

搖瓶——培養(yǎng)基設計的第一步

反應器——最終的優(yōu)化的基礎配方當前第47頁\共有54頁\編于星期五\18點例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)2SO40.8%

輕質碳酸鈣1%。發(fā)酵罐：葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%