園藝植物生物技術(shù)第七章2

第七章植物基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與技術(shù)

李英(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院)Tel科樓B6018E-mail:yingli@當(dāng)前第1頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)課程主要內(nèi)容第一章緒論第二章園藝植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)第三章園藝植物脫毒與離體快速繁殖第四章園藝植物種質(zhì)離體保存與無性變異系篩選第五章園藝植物的細(xì)胞工程第六章園藝植物的染色體工程第七章植物基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與技術(shù)第八章園藝植物基因的分離與克隆第九章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建第十章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化第十一章轉(zhuǎn)基因技術(shù)在園藝植物育種的應(yīng)用第十二章園藝植物的分子標(biāo)記第十三章園藝植物生物信息學(xué)第十四章園藝植物生物技術(shù)的安全性評(píng)價(jià)與管理授課教師:李英,王建軍,侯喜林當(dāng)前第2頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

基因工程是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)的系列操作技術(shù)總稱。外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。當(dāng)前第3頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)第七章植物基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)與技術(shù)第一節(jié)植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識(shí)第二節(jié)植物基因工程常用的工具酶第三節(jié)植物基因工程常用的載體第四節(jié)植物基因工程的基本技術(shù)當(dāng)前第4頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)第一節(jié)植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識(shí)核酸：是以核苷酸為基本單位組成的生物大分子。DNA,RNA核苷酸:堿基，戊糖，磷酸A,T,G,C;A,U,G,CΒ-D-2脫氧核糖遺傳物質(zhì)？當(dāng)前第5頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第6頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)第一節(jié)植物遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)知識(shí)DNA的結(jié)構(gòu)與功能RNA的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能遺傳信息的傳遞基因的概念當(dāng)前第7頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)一、DNA的結(jié)構(gòu)與功能？DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)指DNA分子中脫氧核苷酸按照一定的排列順序，通過磷酸二脂鍵連接形成的多核苷酸。又稱堿基順序。DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)。DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋進(jìn)一步扭結(jié)、折疊形成的更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)稱為DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種雙螺旋結(jié)構(gòu)可再次螺旋形成超螺旋結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第8頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第9頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第10頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)生物的遺傳信息儲(chǔ)存于DNA的核苷酸序列中，生物界物種的多樣性就在于DNA分子4種核苷酸千變?nèi)f化。當(dāng)前第11頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)DNAModel當(dāng)前第12頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA分子在水性環(huán)境和生理?xiàng)l件下最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度或相對(duì)濕度時(shí)，DNA結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。當(dāng)前第13頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的存在可能有兩方面的生物學(xué)意義，一方面，DNA雙鏈經(jīng)過盤繞壓縮使松弛性DNA更為緊密，體積更小，更能保持穩(wěn)定。另一方面，影響DNA雙螺旋的解鏈過程，從而影響與其他大分子如蛋白質(zhì)、酶的結(jié)合。當(dāng)前第14頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)二、RNA的結(jié)構(gòu)與功能mRNAmRNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。tRNAtRNA是細(xì)胞內(nèi)分子質(zhì)量最小的一類核酸，由70~120核苷酸構(gòu)成。rRNA是最多的一類RNA，也是3類RNA中相對(duì)分子質(zhì)量最大的一類RNA，它與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成核糖體，其功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的合成。rRNA單獨(dú)存在時(shí)不執(zhí)行其功能，它與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機(jī)”。當(dāng)前第15頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第16頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第17頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第18頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第19頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第21頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)由氨基酸通過肽鍵連接成一條多肽鏈，由一個(gè)氨基酸的羥基和另一個(gè)氨基酸的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)產(chǎn)生。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽采取的不同構(gòu)象。兩種主要形式是α螺旋和β折疊，二者都由多肽的不同氨基酸之間形成的氫鍵所穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)指將多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分折疊成為三維構(gòu)型而形成的。主要被氫鍵、二硫鍵和疏水作用所穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)即兩條或更多已形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鍵組合在一起形成一個(gè)多亞基蛋白。不是所有蛋白都有四級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第22頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)定義：蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。1.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)主要化學(xué)鍵：肽鍵

二硫鍵的位置屬于一級(jí)結(jié)構(gòu)研究范疇。當(dāng)前第23頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)3021當(dāng)前第24頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)2.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。定義：穩(wěn)定因素：

氫鍵

當(dāng)前第25頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（一）肽單元(peptideunit)

參與組成肽鍵的6個(gè)原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽鍵平面。它是蛋白質(zhì)構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)單位。當(dāng)前第26頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)肽單元HHHH當(dāng)前第27頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第28頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(-helix)

-折疊(-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

當(dāng)前第29頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）-螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn):

①多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)。②每圈螺旋含3.6個(gè)氨基酸，螺距為0.54nm。③每個(gè)肽鍵的亞氨氫和第四個(gè)肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。氫鍵與螺旋長軸基本平行。當(dāng)前第30頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第32頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（三）-折疊①多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈位于鋸齒結(jié)構(gòu)的上下方。②兩段以上的β-折疊結(jié)構(gòu)平行排列，兩鏈間可順向平行，也可反向平行。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β-折疊結(jié)構(gòu)。氫鍵與螺旋長軸垂直。

當(dāng)前第33頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第34頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第35頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（四）-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲-轉(zhuǎn)角：無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結(jié)構(gòu)。①肽鏈內(nèi)形成180o回折。②含4個(gè)氨基酸殘基，第一個(gè)氨基酸殘基與第四個(gè)形成氫鍵。③第二個(gè)氨基酸殘基常為Pro。當(dāng)前第36頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)-轉(zhuǎn)角：當(dāng)前第37頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（五）模體蛋白質(zhì)分子中，二個(gè)或三個(gè)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)具有特殊功能的空間構(gòu)象，被稱為模體(motif)。當(dāng)前第38頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)螺旋－環(huán)－螺旋

鋅指當(dāng)前第39頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)3.蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。穩(wěn)定因素：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。定義當(dāng)前第40頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

肌紅蛋白(Mb)N端C端當(dāng)前第41頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(domain)大分子蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)常可分割成一個(gè)或數(shù)個(gè)球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。當(dāng)前第42頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)結(jié)構(gòu)域Triosephosphateisomerase當(dāng)前第43頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)亞基之間的結(jié)合力主要是氫鍵和離子鍵。4.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。每條具有完整三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈，稱為亞基(subunit)。當(dāng)前第44頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)血紅蛋白（Hb）的四級(jí)結(jié)構(gòu)當(dāng)前第45頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第46頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（1.）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系牛核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵當(dāng)前第47頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性當(dāng)前第48頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（2）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val

·Glu·····C(146)當(dāng)前第49頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。當(dāng)前第50頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)肌紅蛋白與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)（3.）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系當(dāng)前第51頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（4.）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。當(dāng)前第52頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)蛋白質(zhì)構(gòu)象病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。當(dāng)前第53頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)瘋牛病瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病當(dāng)前第54頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)1.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（Watson

＆Crick,1953）四、遺傳信息的傳遞TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962當(dāng)前第55頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)CentralDogma2.中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-2004當(dāng)前第56頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明（Temin1970

）補(bǔ)充的中心法則當(dāng)前第57頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)五、基因的概念三大成就40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。當(dāng)前第58頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)現(xiàn)在人們認(rèn)為，基因是實(shí)體，它的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA或RNA，基因是具有一定遺傳效應(yīng)的DNA分子中特定的核苷酸序列，它是遺傳信息傳遞和性狀分化、發(fā)育的依據(jù)，基因是可分的。根據(jù)基因的產(chǎn)物可將其分為結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、無翻譯產(chǎn)物基因。簡而言之，基因是一個(gè)含有特定遺傳信息的核苷酸序列，它是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。當(dāng)前第59頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)第二節(jié)植物基因工程常用的工具酶限制性內(nèi)切核酸酶DNA連接酶DNA聚合酶其他工具酶當(dāng)前第60頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)常用工具酶及其功能限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶5′末端切除單核苷酸當(dāng)前第61頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)一、限制性內(nèi)切核酸酶限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。

Ⅰ型限制性內(nèi)切酶Ⅱ型限制性內(nèi)切酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶當(dāng)前第62頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)定義：凡在識(shí)別并切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。名稱屬名（大寫）種名（小寫）株名分離序號(hào)來源菌體EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacollR株HindⅢHindⅢHaemophilusInfluenzaed株HindⅡHindⅡHaemophllusInfluenzaed株HpaⅠHpa/ⅠHaemophllusParainfluenzae限制性內(nèi)切酶的命名舉例當(dāng)前第63頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)Ⅱ型限制酶的作用性質(zhì)1、基本特性：（1）識(shí)別位點(diǎn)為4~8個(gè)核苷酸序列；（2）識(shí)別位點(diǎn)即為切割位點(diǎn)；（3）位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。5‘…GCT

GAATTC

GAG…3’3‘…CGA

CTTAAG

CTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)當(dāng)前第64頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)切割方式通常有三種：①在識(shí)別順序兩條鏈對(duì)稱軸上同時(shí)切斷磷酸二酯鍵，形成齊平末端。如HaeⅢ，PvuII。②在識(shí)別順序兩條鏈對(duì)稱軸上兩側(cè)同時(shí)從5’端切斷磷酸二酯鍵，形成5’磷?；?-5個(gè)核苷酸單鏈粘性末端。如EcoRⅠ。③在識(shí)別順序兩條鏈對(duì)稱軸上兩側(cè)同時(shí)從3’端切斷磷酸二酯鍵，形成3’羥基端2~5個(gè)核苷酸單鏈粘性末端。如PstⅠ。當(dāng)前第65頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

當(dāng)前第66頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

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退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP當(dāng)前第67頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)PstI等產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

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A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP當(dāng)前第68頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第69頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)二、DNA連接酶（一）DNA連接酶和T4DNA連接酶DNA連接酶1976年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)。目前應(yīng)用的多數(shù)來自于大腸桿菌，稱為E.coliDNA連接酶。分子量74000dal,輔因子NAD+,其作用是封閉雙螺旋骨架上具有5‘-磷?；?’-羥基的缺口，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick（T4DNA連接酶）當(dāng)前第70頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)T4DNA連接酶T4DNA連接酶來自于T4噬菌體感染的E.coli，為T4噬菌體自身的表達(dá)產(chǎn)物。分子量6.8萬dal，輔因子位ATP，該酶既能連接粘性末端，亦能連接齊平末端。修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’當(dāng)前第71頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶當(dāng)前第72頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）連接酶的作用

用DNA連接酶，可催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組分子。具體做法是，在體外將具有粘性末端的DNA限制片斷，插入到適當(dāng)載體分子上，再用DNA連接酶連接，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。當(dāng)前第73頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化學(xué)合成的具有粘性末端的DNA片段。當(dāng)前第74頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)三、DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段T4DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶T7噬菌體DNA聚合酶當(dāng)前第75頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（一）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要作用是采用缺口平移法標(biāo)記DNA，制備放射性DNA探針，用于核酸雜交分析。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’-3’的聚合酶活性；

2.5’-3’的外切酶活性；

3.3’-5’的外切酶活性（較低）。當(dāng)前第76頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)舒替蘭酶處理，去除全酶中的5’3’外切核酸酶活性，保留了5’3’聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性。當(dāng)前第77頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（三）T4DNA聚合酶T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一種模板依賴的DNA聚合酶，可以在結(jié)合有引物的單鏈DNA模板上，從5‘→3’方向催化DNA合成反應(yīng)。T4

DNA

Polymerase具有3‘→5’外切酶活性，但不具有5‘→3’外切酶活性。

特點(diǎn)：可以用于將5‘端突出末端補(bǔ)平或3’端突出末端削平。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’DNA外切酶活性對(duì)于單鏈DNA要比雙鏈DNA活性更高，即單鏈DNA要比雙鏈DNA中的非配對(duì)鏈部分更容易被T4

DNA

Polymerase所消化。T4

DNA

Polymerase的3‘→5’外切酶活性比KlenowFragment要高約200倍。

當(dāng)前第78頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（四）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）這類酶來自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以RNA為模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反轉(zhuǎn)錄酶兩種。當(dāng)前第79頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（五）T7噬菌體DNA聚合酶

T7噬菌體DNA聚合酶來源于T7噬菌體感染的E.coli，為兩種緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合體，一種是噬菌體基因5蛋白，另一個(gè)是宿主蛋白的硫氧還蛋白。T7噬菌體DNA聚合酶是所有DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)的一個(gè)，產(chǎn)物平均長度要大得多，在測定核苷酸序列時(shí)有優(yōu)勢(shì)。它的活性功能與T4噬菌體DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶類似，但3‘--5’外切活性為Klenow的1000倍。T7噬菌體DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于長模板的引物延伸。Sequenase（測序酶）是美國UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌體DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。SequenaseVersion2切除了所有的3'--5'外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對(duì)長片段進(jìn)行測序的理想用酶。當(dāng)前第80頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)四、其他工具酶末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶DNA甲基化酶S1核酸酶當(dāng)前第81頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（一）末端轉(zhuǎn)移酶

分子克隆中常用的末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是存在于前淋巴細(xì)胞及分化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNA聚合酶，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶。在二價(jià)陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子的3‘-OH。若dNTP為T或C，此二價(jià)陽離子首選CO2+；若dNTP為A或G此二價(jià)陽離子首選Mg2+。在基因工程中，利用末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板，dNTP中任何一個(gè)都可以作為反應(yīng)前體物的特征，給平末端DNA片段3‘-OH加上同聚物poly(C)或poly(G)，也可以加上poly(T)或poly(A)，形成同聚物加尾構(gòu)建重組技術(shù)。當(dāng)前第82頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）堿性磷酸酶堿性磷酸酶：來自于大腸桿菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛腸（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成為5’-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。當(dāng)前第83頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)堿性磷酸酶的活性當(dāng)前第84頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)堿性磷酸酶的應(yīng)用當(dāng)前第85頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（三）DNA甲基化酶原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統(tǒng)中的一員，用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。在E.coli中，大多數(shù)都有三個(gè)位點(diǎn)特異性的DNA甲基化酶。甲基化酶使DNA分子的腺嘌呤或胞嘧啶堿基甲基化，免受內(nèi)源性限制酶切割，從而將能被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的未被甲基化的DNA分子和不可識(shí)別的甲基化方式的DNA分子區(qū)別開來，起到保護(hù)DNA分子的作用。當(dāng)前第86頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)（四）S1核酸酶來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNA，用于將粘性末端水解成平末端及cDNA發(fā)夾式結(jié)構(gòu)的處理。當(dāng)前第87頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)核酸酶SⅠ的應(yīng)用當(dāng)前第88頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)第三節(jié)園藝植物基因工程常用的載體能將目的基因攜帶至宿主細(xì)胞并可在其中自主復(fù)制的遺傳因子謂之為基因工程載體。當(dāng)前第89頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)相關(guān)概念有用基因亦稱為目的基因或插入物用于接受重組DNA的擴(kuò)增載體及其插入物或表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞謂之宿主插入物的擴(kuò)增過程稱為分子克隆攜帶重組DNA分子的宿主為基因工程細(xì)胞（菌）或重組細(xì)胞（菌）當(dāng)前第90頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)基因工程載體的必備條件1、能自主復(fù)制2、具有可供選擇的遺傳標(biāo)記3、具克隆位點(diǎn)4、能攜帶大小不同的外源性目的基因、載體分子量要小,

載力要大5、載體特征明確：基因，酶切位點(diǎn)，核苷酸序列當(dāng)前第91頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體當(dāng)前第92頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)一、質(zhì)粒質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子質(zhì)粒的生物學(xué)性質(zhì)①分子量小，差異顯著，1-500kb。②易于在宿主間轉(zhuǎn)移和遷移。③在宿主內(nèi)可伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制，與宿主呈共生關(guān)系。④且其存在與否與宿主生死無關(guān)。⑤編碼宿主染色體不具有的基因，賦予宿主細(xì)胞額外遺傳特性（如抗生素抗性）當(dāng)前第93頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)pBR322

是一種人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒

特點(diǎn)：①帶有多種抗藥性的強(qiáng)選擇標(biāo)記②具有低分子量，高拷貝③外源DNA插入不影響復(fù)制功能④有多種核酸內(nèi)切限制酶單切割位點(diǎn)命名:p：表示質(zhì)粒

BR:分別取自兩位主要構(gòu)建者F.Bolioax

和R.L.Rodrignez姓氏的頭一個(gè)字母

322:指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)當(dāng)前第94頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖1、來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的ampr2、來源于pSC101質(zhì)粒的tetr3、來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)當(dāng)前第95頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)①自身分子量小4363bp②同時(shí)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)③具有較高的拷貝數(shù)當(dāng)前第96頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)pUC質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒是在pBR322載體質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5‘端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。pUC取名是根據(jù)它們的加州大學(xué)(UniversityofCalifornia)的科學(xué)家J.Messing和J.Vieria于1987年首先構(gòu)建的當(dāng)前第97頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)(1)pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)pUC系列質(zhì)粒載體包括以下四個(gè)組成部分：①來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)ori）；②氨芐青霉素抗性基因Ampr，但它的DNA中核苷酸序列已發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn)；③大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ`基因；④位于lacZ’基因中的靠近5`端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。當(dāng)前第98頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal5-溴-4-氯靛藍(lán)（藍(lán)色）當(dāng)前第99頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)(2)pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)①具有更小的分子量(2686bp)和更高的拷貝數(shù)(500～700)②適用于組織化學(xué)方法檢測重組體③具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以更方便的插入外源基因當(dāng)前第100頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)二、噬菌體載體(一)λ噬菌體DNA1、λ噬菌體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)λ噬菌體為雙鏈DNA病毒，宿主為E.Coli。在宿主內(nèi)有溶菌和溶源兩種形式，在溶源方式中，噬菌體感染宿主后其DNA整合到宿主染色體DNA中，伴隨宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。當(dāng)前第101頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第102頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)λ噬菌體DNA是有48502bp組成的線性雙螺旋分子，分子量3.1×107dal。迄今已定位的基因至少61個(gè)，其中一半?yún)⑴c了噬菌體生命周期的活動(dòng)，我們稱這類基因?yàn)棣耸删w的“必要基因”；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因?yàn)棣耸删w的“非必要基因”。這為其作為基因工程噬菌體的基礎(chǔ)。當(dāng)前第103頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)2、

λ噬菌體DNA克隆載體野生型的λDNA不適宜作為克隆載體。因?yàn)棰牌浞肿恿枯^大，⑵常用的限制酶切點(diǎn)較多。如EcoRI切點(diǎn)5個(gè)，HindⅢ切點(diǎn)7個(gè)，而這些切點(diǎn)大多位于溶菌周期生長所必須基因內(nèi)，容納不下比其更大的外源性DNA片段，必須對(duì)其進(jìn)行改造。當(dāng)前第104頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)改造后，可構(gòu)建兩類λ噬菌體派生載體①取代型載體或替換型載體（replacementvector）它具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA

區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。如λEMBL4

和Charon40。當(dāng)前第105頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)②插入型載體（insertionvectors）只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)（也有一些具有兩個(gè)插入位點(diǎn)）。外源性DNA克隆到插入型的λ載體分子上會(huì)使噬菌體的某中生物功能喪失，即所謂插入失活效應(yīng)。如免疫功能失活的和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。當(dāng)前第106頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)特點(diǎn)：以λ噬菌體DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子必須包裝成完整病毒顆粒后才具有感染宿主的能力。經(jīng)包裝后重組DNA分子轉(zhuǎn)化率提高100-1000倍。這類載體可以有效克隆15kb大小的外源基因。當(dāng)前第107頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)1、概述λ噬菌體一般有效克隆外源基因范圍僅為15kb左右，但有些基因可達(dá)35-40kb，甚至更大，同時(shí)λ噬菌體不能夠同時(shí)克隆兩個(gè)連鎖基因。為此，1978年，J.Collins及B.Hohn等人發(fā)展出科斯質(zhì)粒載體，可滿足以上需要?！癱osmid”一詞是由英文“cossite-carryingplasmid”縮寫而成，其愿意是指帶有粘性末端位點(diǎn)(cos)的質(zhì)粒。三、柯斯載體(cosmid)

當(dāng)前第108頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)定義：科斯質(zhì)粒是人工構(gòu)建的，含有λDNA的粘性(cos)末端序列、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)及質(zhì)粒一個(gè)抗藥性標(biāo)記的、兼具質(zhì)粒與λ噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的特殊載體。當(dāng)前第109頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第110頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第111頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第112頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)2、Cosmid的特點(diǎn)目前已有許多不同類型的科斯質(zhì)粒載體，其特點(diǎn)如下：①具有λ噬菌體的特性；②具有質(zhì)粒載體特性；③具有高容量的克隆能力；④具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。當(dāng)前第113頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)四、人工染色體載體

YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。真核生物染色體的幾個(gè)關(guān)鍵部分：著絲粒端粒自主復(fù)制序列當(dāng)前第114頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第115頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)第四節(jié)植物基因工程的基本技術(shù)核酸分離技術(shù)核酸電泳技術(shù)核酸體外擴(kuò)增技術(shù)分子雜交技術(shù)當(dāng)前第116頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)一、核酸分離技術(shù)（一）

DNA的提取CTAB法SDS法當(dāng)前第117頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中當(dāng)前第118頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)1.RNA的不穩(wěn)定性由于核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量豐富，加熱后仍能夠正確折疊恢復(fù)活性，不易失活（二）

RNA的提取當(dāng)前第119頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

2’-deoxyribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&thymineDNAisapolymerof

2’-deoxyribonucleotidesGCTAp5’end3’endCGTAHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2NH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OOOPOCH2ONCCOHNCHCOCH31’2’3’4’5’3’當(dāng)前第120頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)RNAisapolymerofribonucleotides

ribosesugarsPhosphodiesterlinkagesDirectionalchain(5’to3’)4Basespurines:adenine&guaninepyrimidines:cytosine&uracilGCUApCGUA5’end3’end1’2’3’4’5’3’OHHO-CH2OH2N-CCCHNNNCHCONOOOPOCH2OOCNNCHCCHNH2OHOOOPOCH2ONCHCOHNCHCOOHNH2CCNNNCHCNHCOOOPOCH2OO-PO32OH當(dāng)前第121頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)RNAiseasilyhydrolyzedunderalkalineconditionsThereactionproceedsthrougha2’,3’-cyclicmonophosphateintermediate.EnzymatichydrolysisofRNAbyRNaseproceedsthroughasimilarintermediate.BecauseDNAlacksthe2’-OHgroup,itisstableunderalkalineconditions.....OPO-CH2OOONOHOOPOCH2OONOHOOPOO...OHONOHOOPOO...HOCH2O....OPO-CH2OONOOPOOH+....OPO-CH2OOONOHOOPOHOmixtureof2’-and3’-monophosphatederivativesH2OshortenedRNARNA當(dāng)前第122頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)提取RNA的注意事項(xiàng)(1)玻璃制品、塑料制品和電泳槽:玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。(2)研究人員造成的污染:經(jīng)常更換新手套(3)污染的溶液:避免交叉污染。當(dāng)前第123頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)常用RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。異硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制劑，裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。當(dāng)前第124頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)RNA提取的步驟材料的裂解雜質(zhì)的去除RNA的吸附或沉淀異硫氰酸胍，亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，異戊醇抽提去除雜物，使DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相。硅質(zhì)材料的吸附或用異丙醇沉淀濃縮RNA。經(jīng)DEPC處理的水溶解RNA當(dāng)前第125頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)材料準(zhǔn)備及裂解盡量使用新鮮材料，植物組織選取雜質(zhì)少生長較快的幼嫩部位，現(xiàn)取現(xiàn)提。組培細(xì)胞及血液應(yīng)盡量離心去除培養(yǎng)液和上清，消化系統(tǒng)的組織選取雜質(zhì)少的部位,細(xì)菌和酵母需要?jiǎng)驖{處理。對(duì)不能馬上提取的樣品切成小塊后立即投入液氮冷凍，或投入專門的RNA樣品儲(chǔ)存液中保存。液氮研磨時(shí)不要使液氮揮發(fā)凈，隨時(shí)補(bǔ)充；加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。當(dāng)前第126頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)雜質(zhì)的抽提采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，使蛋白質(zhì)、多糖和DNA分布到中間層和有機(jī)相中，RNA留在水相中對(duì)脂肪含量較多的樣品注意不要吸入油質(zhì)層，可以再次用有機(jī)溶劑抽提當(dāng)前第127頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)RNA的沉淀和溶解含RNA的水相過吸附柱，通過去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等雜質(zhì)或使用異丙醇沉淀RNA應(yīng)充分的混勻并放置10min左右離心收集沉淀，70％乙醇洗滌，晾干用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來洗脫或溶解RNA樣品收集后或需長期保存時(shí)應(yīng)置于－70℃或加入RNase抑制劑，分裝使用當(dāng)前第128頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)二、核酸電泳技術(shù)自從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。當(dāng)前第129頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)基因組DNA的檢測提取的基因組DNA片段在20kb－30kb之間高質(zhì)量的基因組DNA

帶型單一無拖尾現(xiàn)象DNA濃度及純度的檢測（A260=1約50μg/mL雙鏈DNA；A260/280約為1.8）

當(dāng)前第130頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)RNA的檢測電泳槽系統(tǒng)的處理含有甲醛的瓊脂糖凝膠電泳RNA純度及濃度的檢測（A260=1，約40μg/mLRNA；

A260/A280

約為1.9-2.1）當(dāng)前第131頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對(duì)之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（EtBr）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。當(dāng)前第132頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。當(dāng)前第133頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場凝膠電泳。當(dāng)前第134頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)三、核酸體外擴(kuò)增技術(shù)——PCR技術(shù)PCR基本概念PCR基本原理及示意圖PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序由基本PCR拓展的相關(guān)技術(shù)當(dāng)前第135頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)PCR技術(shù)

（Polymerasechainreaction）當(dāng)前第136頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)

PCR(Polymerasechainreaction)即：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，也稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)。是1985年由美國的KaryB.Mullis等人首創(chuàng)并由美國Getus公司開發(fā)的一項(xiàng)專利，應(yīng)用該方法可使極微量的特定DNA片斷在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增到百萬倍。具有特異性強(qiáng)，靈敏度高和快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，因而發(fā)展迅速，應(yīng)用范圍越來越廣泛，不僅可用于基因表達(dá)調(diào)控，基因克隆與測序，特異基因篩選等基礎(chǔ)研究，而且在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993KaryB.Mullis（1944–）

LaJolla,CA,USA1.PCR基本概念當(dāng)前第137頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)2.PCR技術(shù)的基本原理

根據(jù)已知的待擴(kuò)增的DNA片段序列，人工合成與該DNA兩條鏈末端互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引物，在體外將DNA模板在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR全過程可分為DNA模板變性、退火、延伸三個(gè)步驟，經(jīng)若干循環(huán)所組成。首先高溫作用使模板DNA變性解鏈，然后降低溫度使引物與模板DNA鏈退火，在TaqDNA聚合酶作用及dNTP底物存在下，引物鏈將沿著5’

～3’方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈，新鏈則可作為下一次反應(yīng)的模板，因此擴(kuò)增產(chǎn)物的量以指數(shù)級(jí)方式增加。通常單一拷貝的基因經(jīng)25~30循環(huán)可擴(kuò)增100萬～200萬拷貝。當(dāng)前第138頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)未擴(kuò)增的DNAA上游引物B下游引物5'端是人工合成的引物，是特定的，3'端沒有固定的終止點(diǎn)特定的擴(kuò)增產(chǎn)物在第2個(gè)循環(huán)中出現(xiàn)，以后快速擴(kuò)增，成為主要擴(kuò)增產(chǎn)物BABBABAABABABABA循環(huán)1變性退火延伸循環(huán)2變性、退火延伸靶序列未擴(kuò)增的DNA當(dāng)前第139頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)循環(huán)3n個(gè)循環(huán)后，5'端是特定的人工合成的引物，3'端沒有固定的終止點(diǎn)的DNA鏈擴(kuò)增量為2n。變性、退火延伸ABBBAABAABBABABABABBA當(dāng)前第140頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)3.PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)

完成PCR反應(yīng)的組成物質(zhì)主要有引物、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、緩沖液、Mg2+及DNA模板等，其基本特征和要求介紹如下。當(dāng)前第141頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)3.1引物引物是與待擴(kuò)增DNA片斷兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸，是決定PCR擴(kuò)增特異性的關(guān)鍵因素，引物設(shè)計(jì)與合成的好壞直接決定PCR擴(kuò)增的成效。引物設(shè)計(jì)主要考慮：⑴引物長度一般為15～30堿基，太短容易產(chǎn)生許多不同的DNA擴(kuò)增片段，產(chǎn)生與非靶序列的雜交；太長影響PCR效率。⑵堿基組成引物3’不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G（或C），引物自身及引物間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則易形成引物二聚體。⑶引物3‘不能進(jìn)行修飾，由于引物與模板結(jié)合后，是從3’開始延伸引物的，第一位的錯(cuò)配將影響擴(kuò)增效率。當(dāng)前第142頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)3.2dNTP

dNTPs是PCR反應(yīng)所必須的底物，為四種核苷酸的混合物(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。最適宜的dNTPs終濃度應(yīng)根據(jù)被擴(kuò)增片斷的長度和堿基組成來確定。當(dāng)前第143頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)3.3DNA聚合酶

目前PCR擴(kuò)增中最常用的DNA聚合酶是TaqDNA，它是由水生棲熱菌產(chǎn)生，熱穩(wěn)定性好。它的用量多少對(duì)PCR擴(kuò)增效率及特異性有一定影響。另外近年來還使用耐熱的PfuDNA聚合酶和rTthDNA聚合酶，nTthDNA聚合酶可由其將RNA反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增出大量的DNA片斷，大大減化操作程序，提高了效率。當(dāng)前第144頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)3.4緩沖液、Mg2+、DNA模板PCR常用的緩沖液是10～50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3～8.8)體系，注意不能把不同廠家的Taq酶與緩沖液交叉使用。Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑，其濃度高低明顯影響PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。一般選用2～5mmol/L的濃度。作為模板的可以是染色體DNA，也可是質(zhì)粒DNA，通常PCR反應(yīng)體系中所需的模板的量是102～105拷貝的靶序列。當(dāng)前第145頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)4.PCR反應(yīng)體系（20μl反應(yīng)體系）1.6μldNTP(2.5mmol/L)，1.6μlMg2+(10mmol/L)，0.2μlTaqE(5U/μl)，1μlDNA(25ng/μL)，1μlupperPrimer(10μmol/L)，1μllowerPrimer(10μmol/L)，2.0μl10×Buffer，11.6μlH2O當(dāng)前第146頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)PCR擴(kuò)增程序

94℃變性3min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10min。反應(yīng)停止后加溴酚藍(lán)5μL進(jìn)行電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE作電泳緩沖液。電泳結(jié)束后將凝膠置于紫外可見分析儀上觀察照相。

當(dāng)前第147頁\共有164頁\編于星期三\22點(diǎn)5.由基本PCR拓展的相關(guān)技術(shù)簡并PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)、反向PCR(invertedPCR)、巢式PCR(nestedPCR)、錨定PCRRealtimePCR分子標(biāo)記：RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplifie