第五章基因組測(cè)序技術(shù)

第五章基因組測(cè)序技術(shù)第一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一一些主要模式生物基因組測(cè)序概況1995年

7月，第一個(gè)基因組——流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）的全序列發(fā)

表，大小為1.8Mb；

1996年

10月，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）

的基因組全部測(cè)序完成；

1997年

9月，大腸桿菌（Escherichiacoli）基因組全部測(cè)

序完成，全長(zhǎng)5Mb；2001年

12月，線蟲(chóng)（Caenorhabditiselegans）基因組測(cè)序完成.第二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一一些主要模式生物基因組測(cè)序概況2000年：3月，Celera公司完成果蠅（Drosophilamelanogaster）基因組（180Mb）的全部測(cè)序工作，在當(dāng)時(shí)所有已測(cè)序的基因組中是最大的

，同時(shí)這也證明了“全基因組鳥(niǎo)槍法”的可行性；

2000年

12月，第一個(gè)植物基因組——擬南芥（Arabidopsisthaliana）基因組被全部測(cè)序

，大小為125Mb.第三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、測(cè)序流程1.構(gòu)建生物基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)

DNA的提取和制備→酶切制備克隆用DNA片段

→與載體連接→轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

→篩選鑒定→擴(kuò)增培養(yǎng)。2.從基因組文庫(kù)中提取DNA大片段，進(jìn)行測(cè)序：將DNA用超聲波（或限制性?xún)?nèi)切酶）切成能夠測(cè)序的小片斷(200-500bp)→小片斷和載體結(jié)合，植入細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增（或用PCR擴(kuò)增）→從細(xì)菌中提取出繁殖好的質(zhì)粒→酶切，制取測(cè)序的DNA片段3.測(cè)序：上測(cè)序儀測(cè)序。4.利用重疊技術(shù)，排出DNA大片段的序列。第四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、DNA測(cè)序的方法雙脫氧鏈終止法測(cè)序化學(xué)降解法測(cè)序自動(dòng)化測(cè)序非常規(guī)DNA測(cè)序第五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（一）Sanger的雙脫氧鏈末端終止法

1.基本原理:

通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序。第六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一Cambridge的F.Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測(cè)定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：

①DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；②該酶能夠用2‘，3’--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3‘-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測(cè)序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無(wú)5'→3'外切酶活性?；驹?第七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶

4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸

↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬?？寺NADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無(wú)5’→3′外切酶活性C無(wú)3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基第八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊPOH3ˊP325ˊ5ˊPOH3ˊHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制備單鏈DNA加放射性引物第九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一ddGTPddATPddTTPddCTP5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG聚合產(chǎn)物分別在4個(gè)泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列第十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）Maxam-Gilbert的化學(xué)降解法1.基本原理是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長(zhǎng)度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸序列。第十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2技術(shù)路線將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳,讀取DNA的核苷酸順序第十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一Maxam-Gilbert測(cè)序法的特異斷裂32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATSpecificReactiontoG

化學(xué)法無(wú)放射線片段不能顯像斷裂處斷裂處ATCGATCGAT第十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)

堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對(duì)N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開(kāi)嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶第十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊHOOH5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊ32PP325ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊ32POH3ˊ硫酸二甲酯甲酸肼肼＋NaClGG+AT+CC堿性磷酸單酯酶除去5ˊ磷酸基多核苷酸磷酸激酶γ-32P-ATP分離單鏈DNA分別在4個(gè)試管中進(jìn)行特異斷裂第十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一GG+AT+CC5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG斷裂產(chǎn)物分別在4個(gè)泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列第十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一化學(xué)法測(cè)序?qū)嵗哙さ谑隧?yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一改進(jìn)的特異化學(xué)切割反應(yīng)第十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（三）自動(dòng)化測(cè)序1.基本原理與鏈終止法測(cè)序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)記黃色熒光,ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基.第二十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（四）非常規(guī)測(cè)序1.毛細(xì)管電泳

用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳,節(jié)省時(shí)間,加快測(cè)序進(jìn)程,其他程序同鏈終止法或化學(xué)測(cè)序法.2.光點(diǎn)測(cè)序

脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA3’-末端時(shí)會(huì)釋放1個(gè)焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,并發(fā)出光亮.由此,往反應(yīng)液中每次只加入1種核苷酸,當(dāng)加入的核苷酸結(jié)合時(shí),反應(yīng)液發(fā)出亮點(diǎn),并記錄核苷酸種類(lèi);當(dāng)核苷酸未結(jié)合時(shí),反應(yīng)液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來(lái)測(cè)定DNA序列.

第二十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.DNA芯片測(cè)序基本原理將各種排列順序的寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上,每個(gè)點(diǎn)播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測(cè)的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會(huì)在確定位置發(fā)出信號(hào),然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對(duì)比組裝,拼接成完全的DNA順序.第二十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一利用基因芯片進(jìn)行雜交測(cè)序的原理第二十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、測(cè)序及序列的組裝的策略（一）隨機(jī)測(cè)序與序列組裝

隨機(jī)測(cè)序也稱(chēng)”鳥(niǎo)槍法”.

第二十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一ABC小片段測(cè)序計(jì)算機(jī)拼裝鳥(niǎo)槍法(Shotgun)測(cè)序的問(wèn)題CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP錯(cuò)裝第二十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一實(shí)例:流感嗜血桿菌基因組的測(cè)序及順序組裝超聲波打斷純化的基因組DNA↓瓊脂糖電泳收集1.6～2.0Kb的區(qū)段、純化

↓構(gòu)建到質(zhì)粒載體中↓隨機(jī)挑選19687個(gè)克隆,進(jìn)行28643次測(cè)序,得到可讀順序?yàn)?1631485bp↓組裝成140個(gè)覆蓋全基因組范圍的獨(dú)立的順序重疊群,↓第二十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一各重疊群間仍有間隙

順序間隙物理間隙

↓↓

載體或宿主菌選用不當(dāng)而被丟失的順序測(cè)序時(shí)遺漏的測(cè)序解決辦法:通過(guò)相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫(kù)解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫(kù)第二十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一序列組裝原理:直接從已測(cè)序的小片段中尋找彼此重疊的測(cè)序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.優(yōu)點(diǎn):不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測(cè)序計(jì)算機(jī)拼裝第二十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）限制測(cè)序限制測(cè)序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA順序進(jìn)行組裝.

一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測(cè)序中也采用這一方法.

如高等植物擬南芥基因組的測(cè)序完全依據(jù)克隆重疊群,先進(jìn)行各個(gè)BAC克隆的隨機(jī)測(cè)序,再進(jìn)行序列組裝；

水稻基因組測(cè)序計(jì)劃采取得策略與此相同.第三十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（三）指導(dǎo)測(cè)序與序列組裝建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥(niǎo)槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥(niǎo)槍法”或”指導(dǎo)測(cè)序”。在人類(lèi)基因組進(jìn)入測(cè)序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下:A構(gòu)建平均為2Kb的人類(lèi)基因組質(zhì)粒文庫(kù),進(jìn)行雙向測(cè)序;B構(gòu)建平均10Kb的人類(lèi)基因組質(zhì)粒文庫(kù),進(jìn)行雙向測(cè)序,讀取2個(gè)端部順序;C參考人類(lèi)基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點(diǎn),進(jìn)行序列組裝，排成重疊克隆群.第三十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb),利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測(cè)序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測(cè)序拼裝第三十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一兩種策略的比較鳥(niǎo)槍法策略指導(dǎo)測(cè)序策略不需背景信息構(gòu)建克隆群

(遺傳、物理圖譜)時(shí)間短需要幾年的時(shí)間需要大型計(jì)算機(jī)得到的是草圖(Draft)得到精細(xì)圖譜第三十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（四）其他測(cè)序路線1.重要區(qū)域優(yōu)先測(cè)序人們對(duì)感興趣的基因或與疾病相關(guān)的基因優(yōu)先測(cè)序.如:人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合區(qū)位于第6號(hào)染色體,與人類(lèi)免疫系統(tǒng)有關(guān)，因而優(yōu)先測(cè)序.第三十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.EST(Expressedsequencetag)測(cè)序

EST是一種重要的基因組圖分子標(biāo)記,以EST為探針很容易從cDNA文庫(kù)中篩選全基因,又可從BAC克隆中找到其基因組的基因序列.

優(yōu)點(diǎn):AmRNA可直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA,而且cDNA文庫(kù)也比較容易構(gòu)建;B對(duì)cDNA文庫(kù)大量測(cè)序,即可獲得大量EST的序列;CEST為基因的編碼區(qū),不包括內(nèi)含子和基因間區(qū)域,一次測(cè)序的結(jié)果足以鑒定所代表的基因;第三十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、人類(lèi)基因組計(jì)劃

人類(lèi)基因組計(jì)劃（Humangenomeproject）于1990年啟動(dòng)，我國(guó)于1999年加入該計(jì)劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類(lèi)3號(hào)染色體短臂上約30Mb的測(cè)序任務(wù)。

第三十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.人類(lèi)基因組計(jì)劃的目的

闡明人類(lèi)基因組30億個(gè)堿基對(duì)的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類(lèi)基因，并搞清其在染色體上的位置;破譯人類(lèi)全部遺傳信息，使人類(lèi)第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我;解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律;認(rèn)識(shí)種屬之間和個(gè)體之間存在差異的起因、認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長(zhǎng)壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。第三十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.人類(lèi)基因組草圖的完成

2000年6月26日是人類(lèi)歷史上值得紀(jì)念的一天。人類(lèi)基因組的工作草圖已經(jīng)繪制完畢并于這天向全世界公布。最終完成圖要求測(cè)序所用的克隆能忠實(shí)地代表常染色體的基因組結(jié)構(gòu)，序列錯(cuò)誤率低于萬(wàn)分之一。第三十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一二000年六月二十六日克林頓宣布人類(lèi)基因組草圖繪制完成第三十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一美國(guó)國(guó)家人類(lèi)基因組研究所所長(zhǎng)弗朗西斯·柯林斯在介紹情況。

第四十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一人類(lèi)基因組草圖基本信息由31.65億bp組成含3~3.5萬(wàn)基因與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因占2%人類(lèi)基因組人類(lèi)蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲(chóng)同源46%與酵母同源第四十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2000年6月公共領(lǐng)域測(cè)序計(jì)劃工作框架圖第四十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一2001年2月16日

人類(lèi)基因組“精細(xì)圖”完成，(99%),2003年4月14日人類(lèi)基因組序列圖亦稱(chēng)“完成圖”（99.99%），提前繪制成功第四十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一A.CeleraGenomics人類(lèi)基因組的測(cè)序策略3.人類(lèi)基因組測(cè)序策略第四十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一采集5個(gè)自愿者的DNA樣品構(gòu)建3種不同插入子大小的基因組文庫(kù)2Kb,10Kb和50Kb完成約2700萬(wàn)次插入子末端測(cè)序,總長(zhǎng)14800MbGeneBank下載104018個(gè)BAC末端順序PFP發(fā)表的公開(kāi)數(shù)據(jù)主要為BAC克隆的順序,共4443.3Mb隨機(jī)測(cè)序與序列組裝方法和指導(dǎo)測(cè)序與序列組裝方法相結(jié)合進(jìn)行序列組裝第四十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一B國(guó)際人類(lèi)基因組測(cè)序策略構(gòu)建BAC克隆↓限制性酶處理獲得指紋↓根據(jù)指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群↓根據(jù)STS標(biāo)記,將BAC克隆重疊群標(biāo)定在物理圖上↓每個(gè)BAC克隆內(nèi)部采用鳥(niǎo)槍法測(cè)序,組裝↓將BAC插入順序與BAC克隆指紋極重疊群對(duì)比,將已閱讀的順序錨定到物理圖上第四十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.人類(lèi)基因組測(cè)序結(jié)果

基因數(shù)是3萬(wàn)、4萬(wàn)還是10萬(wàn)

人類(lèi)遺傳基因數(shù)量比原先估計(jì)的少很多。目前研究表明，人類(lèi)基因組中約有3萬(wàn)至4萬(wàn)個(gè)蛋白編碼基因，僅僅是果蠅基因數(shù)目的兩倍，人有而鼠沒(méi)有的基因只有300個(gè)。此結(jié)論是由兩大科研小組的數(shù)據(jù)是從DNA水平上得出的；而“人類(lèi)有10萬(wàn)多個(gè)基因”則是從RNA水平上得出的結(jié)論。所以，這些數(shù)據(jù)不能推翻“人類(lèi)有10萬(wàn)個(gè)基因”的說(shuō)法。第四十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一人類(lèi)基因組研究的驚人發(fā)現(xiàn)?19號(hào)染色體是含基因最豐富的染色體，而13號(hào)染色體含基因量最少?目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能?人類(lèi)基因組中存在“熱點(diǎn)”和大片“荒漠”。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無(wú)用DNA”——不包含或含有極少基因的成分?；蚪M上大約有1／4的區(qū)域沒(méi)有基因的片段。?35．3％的基因包含重復(fù)的序列。這說(shuō)明那些原來(lái)被認(rèn)為是“垃圾”的DNA也起重要作用，應(yīng)該被進(jìn)一步研究。第四十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一什么是單核苷酸多態(tài)性人類(lèi)99．9％的基因密碼是相同的，而差異不到0．1％，不同人群僅有140萬(wàn)個(gè)核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個(gè)體的遺傳基礎(chǔ)，個(gè)體的多樣性被認(rèn)為是產(chǎn)生遺傳疾病的原因。在整個(gè)基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬(wàn)分之一，從而說(shuō)明人類(lèi)不同“種屬”之間并沒(méi)有本質(zhì)上的區(qū)別。第五十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.人類(lèi)基因組計(jì)劃的意義隨著人類(lèi)基因組逐漸被破譯，一張生命之圖將被繪就，人們的生活也將發(fā)生巨大變化。人類(lèi)基因研究的意義在于它可以支持和推動(dòng)生命科學(xué)中一系列重要的基礎(chǔ)性研究。如基因組遺傳語(yǔ)言的破譯，基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，生命的起源和進(jìn)化，細(xì)胞發(fā)育、生產(chǎn)、分化的分子機(jī)理，疾病發(fā)生的機(jī)理等。第五十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（1）確定人類(lèi)基因組中約5萬(wàn)個(gè)編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。第五十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。

（4）研究空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來(lái)研究真核基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。第五十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類(lèi)DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對(duì)研究人類(lèi)基因組的遺傳與進(jìn)化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。第五十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類(lèi)基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周?chē)蛄械男再|(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類(lèi)基因組后的影響，可能指導(dǎo)人類(lèi)有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。

第五十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一（8）研究染色體和個(gè)體之間的多態(tài)性。這些知識(shí)可被廣泛用于基因診斷、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類(lèi)學(xué)的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類(lèi)歷史進(jìn)程、人類(lèi)在地球上的分布與遷移以及人類(lèi)與其他物種之間的比較。第五十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一以人類(lèi)基因組和擬南芥基因組為例說(shuō)明你對(duì)生物基因組全序測(cè)定工作的科學(xué)意義與社會(huì)意義的認(rèn)識(shí)（8分）中國(guó)科學(xué)院2002年

碩士學(xué)位研究生入學(xué)分子遺傳學(xué)試題第五十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一6.人類(lèi)基因組計(jì)劃的倫理學(xué)A個(gè)人DNA順序的隱私權(quán).如:”次等”基因攜帶者可能受到岐視,職業(yè)限制,醫(yī)療保險(xiǎn)等問(wèn)題;B基因?qū)＠麊?wèn)題第五十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一7.后人類(lèi)基因組計(jì)劃

伴隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的迅速進(jìn)展，基因的全序列逐步被完整的測(cè)出，會(huì)出現(xiàn)大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在HGP完成之后，即全部人類(lèi)基因被定序之后，還需要：破解貯存于基因組之中的遺傳語(yǔ)言;識(shí)別、分離、鑒定和克隆所有基因；搞清每個(gè)基因的功能及基因之間的相互作用和相互關(guān)系。第五十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一水稻的基因組

2002年我國(guó)科學(xué)家完成了水稻基因組定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人類(lèi)基因還要多得多。人類(lèi)基因大約有3-4萬(wàn)個(gè)，水稻有46022-55615個(gè)基因。因此水稻基因組可說(shuō)是繼人類(lèi)基因組之后，完成定序的最大基因組，也是至今已知最大的植物基因組。由于水稻是全球半數(shù)以上人口的主食，對(duì)解決全球糧食問(wèn)題具有重要意義。第六十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組學(xué)概述基因組（genome），又稱(chēng)染色體組一個(gè)物種單倍體的染色體數(shù)目，物種全部遺傳信息的總和物種遺傳信息的“總詞典”控制發(fā)育的“總程序”生物進(jìn)化歷史的“總檔案”第六十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組學(xué)（genomics）1986年提出，至今20年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳學(xué)中最重要的分支學(xué)科。對(duì)物種的所有基因進(jìn)行定位、作圖、測(cè)序和功能分析第六十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組學(xué)研究的最終目標(biāo)獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關(guān)系闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律

第六十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一經(jīng)典遺傳學(xué)在20世紀(jì)初，遺傳學(xué)剛剛誕生的時(shí)候，遺傳學(xué)家的工作主要是鑒別感興趣的基因，確定這些基因在染色體上的位置。第一個(gè)環(huán)節(jié)：尋找自發(fā)突變體，或者利用物理、化學(xué)因素誘發(fā)突變。第二個(gè)環(huán)節(jié)：通過(guò)連鎖分析確定新基因與已知基因的相互關(guān)系，繪制遺傳連鎖圖。第六十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一幾個(gè)代表物種的基因組大小第六十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!第六十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容結(jié)構(gòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)第六十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）基因定位基因組作圖測(cè)定核苷酸序列第六十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一功能基因組學(xué)（functionalgenomics）又稱(chēng)后基因組學(xué)（postgenomics)基因的識(shí)別、鑒定、克隆基因結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系基因表達(dá)調(diào)控的研究第六十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一人類(lèi)基因組計(jì)劃1990，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所和能源部投資＄30億，啟動(dòng)了人類(lèi)基因組計(jì)劃，預(yù)計(jì)15年時(shí)間完成人類(lèi)基因組全部序列的測(cè)定1996，完成標(biāo)記密度為0.6cM的人類(lèi)基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類(lèi)基因組圖譜的修訂版2002，完成測(cè)序工作第七十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組圖譜的構(gòu)建基因組計(jì)劃的主要任務(wù)是獲得全基因組序列但是，現(xiàn)在的測(cè)序方法每次只能測(cè)800～1000bp大量的測(cè)序片段要拼接要知道序列在Chr上的位置才能正確拼接基因組計(jì)劃的第一個(gè)環(huán)節(jié)：構(gòu)建基因組圖譜第七十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組圖譜遺傳圖譜（geneticmap）物理圖譜（physicalmap）第七十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳圖譜（geneticmap）采用遺傳分析的方法將基因或其它DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。第七十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳標(biāo)記有可以識(shí)別的標(biāo)記，才能確定目標(biāo)的方位及彼此之間的相對(duì)位置。構(gòu)建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標(biāo)記。包括：形態(tài)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記DNA分子標(biāo)記第七十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一多態(tài)性（polymophism）所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性！花色：白色、紅色株高：高、矮血型：A、B、O型淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結(jié)果！第七十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一形態(tài)標(biāo)記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱(chēng)表型標(biāo)記數(shù)量少很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響第七十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的?？刂菩誀畹钠鋵?shí)是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基因標(biāo)記。第七十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一果蠅連鎖圖第七十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)胞學(xué)標(biāo)記明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征染色體的核型染色體的帶型染色體的結(jié)構(gòu)變異染色體的數(shù)目變異優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境影響缺點(diǎn)：數(shù)量少、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育不利第七十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一生化標(biāo)記又稱(chēng)蛋白質(zhì)標(biāo)記就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。

如：同工酶、貯藏蛋白優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小缺點(diǎn)：受發(fā)育時(shí)間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息第八十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一DNA分子標(biāo)記簡(jiǎn)稱(chēng)分子標(biāo)記以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：不受時(shí)間和環(huán)境的限制遍布整個(gè)基因組，數(shù)量無(wú)限不影響性狀表達(dá)自然存在的變異豐富，多態(tài)性好共顯性，能鑒別純合體和雜合體第八十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對(duì)等位基因的差異。

如有兩個(gè)DNA分子（一對(duì)染色體），一個(gè)具有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)，酶切后形成的DNA片段長(zhǎng)度就有差異，即多態(tài)性?？蓪FLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。人類(lèi)基因組中有105個(gè)RFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩個(gè)等位基因。第八十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一RFLP分析第八十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一RFLP標(biāo)記位共顯性標(biāo)記第八十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記微衛(wèi)星又稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）。這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC另一染色體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構(gòu)成了多態(tài)性。第八十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳圖譜的構(gòu)建方法

理論基礎(chǔ):連鎖與交換基本方法:兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法第八十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物遺傳圖譜的構(gòu)建選擇研究材料（親本）構(gòu)建分離群體遺傳標(biāo)記檢測(cè)標(biāo)記間的連鎖分析第八十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一選擇親本

要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異大但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。對(duì)備選材料進(jìn)行多態(tài)(差異)性檢測(cè)，綜合測(cè)定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對(duì)或幾對(duì)材料作為遺傳作圖親本。第八十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一構(gòu)建作圖群體

第八十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳標(biāo)記的染色體定位利用遺傳學(xué)方法或其它方法將少數(shù)標(biāo)記錨定在染色體上，作為確定連鎖群的參照系。常用的方法：?jiǎn)误w分析三體分析代換系分析附加系分析第九十頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一標(biāo)記間的連鎖分析利用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離群體中所有個(gè)體的基因型根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離有計(jì)算機(jī)軟件可以應(yīng)用第九十一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一水稻遺傳圖1994年，水稻第一張高密度遺傳圖譜927個(gè)位點(diǎn)，1383個(gè)標(biāo)記1998年，1157個(gè)位點(diǎn)，2275個(gè)標(biāo)記2000年，3267個(gè)標(biāo)記高密度的遺傳圖譜為基因組測(cè)序和遺傳研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。第九十二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一人類(lèi)遺傳圖譜的構(gòu)建

不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計(jì)雜交組合，構(gòu)建分離群體！只能檢測(cè)現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型家系分析法資料有限、必須借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法第九十三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一現(xiàn)有的人類(lèi)遺傳圖譜1～22號(hào)染色體8個(gè)家系134個(gè)成員X染色體，12個(gè)家系170個(gè)成員5364個(gè)SSR標(biāo)記2335個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記間的平均距離599kb第九十四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一物理圖譜的構(gòu)建用分子生物學(xué)方法直接檢測(cè)DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置繪制成的圖譜稱(chēng)為物理圖譜。有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？

第九十五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳圖譜的缺陷分別率有限人類(lèi)只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個(gè)體測(cè)序要求每個(gè)標(biāo)記的間隔小于100kb實(shí)際是599kb第九十六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳圖譜的缺陷精確性不夠經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，交換是隨機(jī)發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點(diǎn)倒位、重復(fù)等染色體結(jié)構(gòu)變異會(huì)限制交換重組第九十七頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一酵母遺傳圖與物理圖比較A遺傳圖B物理圖第九十八頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一物理作圖的方法1、限制酶作圖2、依靠克隆的基因組作圖3、熒光原位雜交4、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖第九十九頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一限制酶作圖（restrictionmapping）第一百頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一限制酶作圖（restrictionmapping）第一百零一頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第一百零二頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第一百零三頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第一百零四頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）第一百零五頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一人類(lèi)基因組物理圖1987年，RFLP圖譜，403個(gè)標(biāo)記，10Mb1994年，5800個(gè)標(biāo)記，0.7Mb1996年，17000多個(gè)標(biāo)記，100kb完全適應(yīng)全基因組測(cè)序的要求第一百零六頁(yè)，共一百一十九頁(yè)，編輯于2023年，星期一遺傳圖與物理圖的整合有些標(biāo)記既是遺傳標(biāo)記，又是物理標(biāo)記RFLP標(biāo)記