叢枝菌根真菌生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

PAGE3叢枝菌根真菌生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了叢枝菌根真菌生產(chǎn)技術(shù)的術(shù)語和定義、環(huán)境條件、叢枝菌根真菌樣品采集、叢枝菌根真菌孢子的分離提取、單孢培養(yǎng)、擴(kuò)繁培養(yǎng)、收獲菌種及生產(chǎn)檔案。本標(biāo)準(zhǔn)適用于叢枝菌根真菌菌種生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB15618土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）GB5084農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB/T32721-2016污染物對菌根真菌的影響孢子萌發(fā)試驗(yàn)NY/T1113—2006微生物肥料術(shù)語3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1叢枝菌根真菌能與植物根系形成叢枝菌根的真菌。3.2孢子真菌的無性繁殖體。3.3孢子果菌絲體包被的孢子群。3.4菌絲體菌絲分枝后的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。3.5菌絲菌絲體的絲狀結(jié)構(gòu)。3.6單孢培養(yǎng)利用濕篩分離技術(shù)分離出純凈的孢子，并將一個(gè)孢子再次接種于擴(kuò)繁宿主植物幼苗根部以獲得單一菌種的方法。3.7擴(kuò)繁培養(yǎng)將單孢分離后的培養(yǎng)物和擴(kuò)繁宿主植物一起接種于滅菌的沸石、河沙混合基質(zhì)，澆灌霍格蘭茨（Hoagland）營養(yǎng)液，培養(yǎng)后可獲得其加富培養(yǎng)物。4環(huán)境條件土壤環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合GB15618的規(guī)定，空氣環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合GB3095的規(guī)定，農(nóng)田灌溉水質(zhì)應(yīng)符合GB5084的規(guī)定。5叢枝菌根真菌樣品采集9月底~10月初，選取長勢良好目標(biāo)植物，去掉地表大塊沙石和其它雜物，用鐵鍬或小鏟沿植物周圍往下挖，取樣深度0cm~30cm，盡量將整個(gè)根系挖出，剪去植物地上部分，連根帶土大約2kg裝入塑料袋。6叢枝菌根真菌孢子的分離提取濕篩傾析法分離提取孢子。土壤樣品20g~50g放進(jìn)食品攪拌機(jī)杯，加入600ml水，高速轉(zhuǎn)3s~5s。對于黏性或結(jié)塊較大土壤，先在水中浸泡20min~30min。打碎的材料倒出，依次通過3個(gè)土壤標(biāo)準(zhǔn)篩（上層孔徑0.8mm，中層孔徑0.25mm，下層孔徑0.055mm）。用流水沖洗每層篩子，直至流出的水是清水。上層篩大孢子洗滌、轉(zhuǎn)移到大培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下觀察。下層篩子殘余物轉(zhuǎn)至50ml含有20%/60%蔗糖梯度的離心管中離心，3000r/min離心2min~3min。離心管中上清液倒至較小篩子，用水沖洗1min~2min，轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下用解剖針和毛細(xì)吸管將孢子與有機(jī)碎屑分離，按形態(tài)分開孢子，放入置于培養(yǎng)皿的表面皿，或有蓋瓶中，4℃下存放48h以上。復(fù)檢挑出并丟棄變色、有斑、內(nèi)含物異常、過度透明或孢子表面有細(xì)菌或真菌生長的孢子。換水，將孢子貯于4℃下24h~48h再次檢查典型孢子，根據(jù)孢子的顏色、大小、孢子果等形態(tài)特征將孢子分類，水洗并轉(zhuǎn)移至放有滅菌蒸餾水的表面皿中備用（不長于7d）。7單孢培養(yǎng)7.1培養(yǎng)基質(zhì)沸石和河沙按1:1混合，裝布袋，在105℃下蒸汽滅菌1h~2h，間隔24h重復(fù)1次，放置7d~14d后使用。7.2培養(yǎng)容器50穴苗盤，54cm×28cm×10cm，每穴容積約110cm3，可以整盤使用，也可以剪開成排或單獨(dú)使用。使用前用10%次氯酸鈉浸泡30min，清洗，淋干。7.3宿主植物高粱，播種前將種子在40％甲醛1:100的溶液中浸泡15min，用水沖洗數(shù)次。7.4單孢培養(yǎng)流程裝入滅菌的沸沙培養(yǎng)基質(zhì)至每穴2/3處。體視顯微鏡下用毛細(xì)吸管吸取新鮮、光亮、飽滿的孢子滴放在裝好的基質(zhì)上，加1cm~2cm的滅菌沸沙培養(yǎng)基質(zhì)于孢子上，表面播種高梁種子2粒~3粒，覆蓋0.5cm滅菌基質(zhì)，澆水，移至光照室或溫室培養(yǎng)90d~120d。8擴(kuò)繁培養(yǎng)8.1培養(yǎng)基質(zhì)同7.1。8.2培養(yǎng)容器普通塑料花盆，高度10cm~25cm，用10%次氯酸鈉溶液浸泡30min，清洗，淋干。也可以用70％~75％的乙醇溶液浸泡或擦拭。8.3宿主植物玉米，播種前將種子在1％H2O2消毒10min，用蒸餾水清洗干凈后浸泡4h于培養(yǎng)箱中28℃催芽。8.4擴(kuò)繁培養(yǎng)流程將單孢培養(yǎng)苗盤中的高梁苗與培養(yǎng)物一起取出，放在已消毒的塑料（或者PVC）盤中，用滅菌的刀切取1/4，進(jìn)行濕篩，在體視顯微鏡下檢查孢子、菌絲及根系侵染。將滅菌的沸沙培養(yǎng)基質(zhì)裝至塑料盆的1/3處，將上述檢查后確定已有侵染的剩余3/4培養(yǎng)物與高梁苗，直立于塑料盆中心位置，周圍再填滿滅菌的沸沙培養(yǎng)基質(zhì)，澆水，每盆播種玉米種子2粒~4粒，覆蓋1cm~2cm滅菌基質(zhì)，移至光照室或溫室培養(yǎng)120d~150d。8.5擴(kuò)繁培養(yǎng)營養(yǎng)液霍格蘭茨（Hoagland）營養(yǎng)液配置見表1，每7d澆1次營養(yǎng)液，每升基質(zhì)1次使用50m~70ml，如果觀察到缺乏營養(yǎng)的現(xiàn)象時(shí)連續(xù)澆營養(yǎng)液2d~3d。表1霍格蘭茨（Hoagland）營養(yǎng)液配方成分母液濃度（g/L）營養(yǎng)液濃度（ml/L）KH2PO41361KNO31015Ca（NO3）22365MgSO4246.52H3BO32.861MnCl2.4H2O1.811ZnSO4.7H2O0.221CuSO4.5H2O0.081H2MnO4.H2O0.021FeEDTA（EDTAFeSO4.7H2O）7.455.5718.6擴(kuò)繁培養(yǎng)光照使用LED植物補(bǔ)光燈，每天補(bǔ)光4h~6h。8.7擴(kuò)繁培養(yǎng)溫度培養(yǎng)室溫度維持在15℃~30℃。8.8擴(kuò)繁培養(yǎng)濕度使用pH6.5~7.5的自來水澆水，基質(zhì)含水量保持在田間持水量的55%~65%。澆水容器不應(yīng)接觸到培養(yǎng)基質(zhì)表面，澆水時(shí)基質(zhì)或水不應(yīng)潑濺到外面，以免造成盆與盆間菌種的污染。9收獲菌