生物芯片分類及應用

一、

概念、分類及應用1當前第1頁\共有73頁\編于星期四\19點（一）、兩個概念生物芯片

主要指通過平面微細加工技術在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測?；蛐酒夹g是通過微陣列技術,將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。2當前第2頁\共有73頁\編于星期四\19點微陣列芯片（Microarray）微型實驗室芯片(Lab-on-a-chip)液體芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分類及應用3當前第3頁\共有73頁\編于星期四\19點Lab-on-a-chip微型實驗室芯片是通過在芯片上刻成微流路徑從而將涉及生物檢測的主要步驟—樣品準備/生化反應/結(jié)果檢測—整合在一張芯片上。4當前第4頁\共有73頁\編于星期四\19點5當前第5頁\共有73頁\編于星期四\19點6當前第6頁\共有73頁\編于星期四\19點LiquichipBead,Capturemolecule,Analyte,Reportermolecule是構(gòu)成liquichip的4個主要部分。Bead上帶有兩種熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例可以將bead分為多種。目前已有48種，正在開發(fā)中。Capturemolecule:作用相當于探針，能特異性的與被檢測物結(jié)合。Analyte:樣品中被檢測的成分。Reportermolecule:帶有熒光的報告分子，能特異性的與被檢測物結(jié)合。7當前第7頁\共有73頁\編于星期四\19點Liquichip反應的一般步驟：1.先將capturemolecule結(jié)合在bead上，2.將這種標記了的bead與樣品反應。Capturemolecule可以與相應的analyte特異性的結(jié)合，3.此時再加入熒光標記的，特異結(jié)合analyte的reportermolecule。4.檢測：用liquichipworkstation進行檢測。原理是同時對bead和reportermolecule上的熒光進行檢測。從而確定被結(jié)合的analyte的種類和數(shù)量。

8當前第8頁\共有73頁\編于星期四\19點Liquichip技術特點描述1．基于bead的這種固相反應技術，具有靈敏度高、信號強度高、靈活性好、所需樣品量少的特點。2．與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，有兩大優(yōu)勢，反應速度更快，靈活性更好。3．由于檢測方法的特點，在大部分的實驗過程中，都不需要洗脫步驟，省時，且不會破壞反應的動態(tài)平衡。4．有配套的蛋白表達和純化體系。（his-tag）

9當前第9頁\共有73頁\編于星期四\19點Lquichip應用領域：蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)功能研究蛋白表達譜分析。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受體-配基分析、蛋白質(zhì)核酸相互作用分析分析。

10當前第10頁\共有73頁\編于星期四\19點微陣列芯片蛋白芯片基因芯片

11當前第11頁\共有73頁\編于星期四\19點蛋白芯片(ProteinChips)高通量微陣列蛋白分析方法利用抗體抗原結(jié)合原理，采用化學發(fā)光或熒光檢測

標記抗體或抗原，來檢測抗原或抗體。12當前第12頁\共有73頁\編于星期四\19點蛋白芯片應用免疫學分析

蛋白與蛋白之間相互作用

DNA與蛋白質(zhì)分子相互作用13當前第13頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片基因芯片是通過微陣列技術,將高密度DNA片段陣列通過高速機器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術。微陣列技術巨大優(yōu)勢在于它可以并行地宏量獲取生物信息，借助此技術發(fā)展的生物芯片則提供了以核酸雜交為基礎的基因水平的表達監(jiān)控，多態(tài)性研究和基因分型。從而使我們對基因表達調(diào)控有更深入的了解。14當前第14頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray15當前第15頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片

按內(nèi)涵劃分：

cDNA芯片

Oligo芯片:25mer(affymetrix),70mer(Operon)，80mer（Clontech）,

按功能劃分：

基因組芯片：

檢測某一基因是否存在，若存在，拷貝數(shù)是多少。探針是DNA.

表達譜芯片：確定基因表達的途徑與表達產(chǎn)物。探針是RNA或cDNA

測序芯片：通過探針與微陣列的配對分析獲得探針的序列結(jié)果。16當前第16頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片應用基因表達檢測多態(tài)性分析遺傳圖譜定位基因分型通過雜交反應測定序列17當前第17頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片應用領域遺傳疾病研究癌癥家系遺傳疾病普通基因突變疾病感染性疾病藥物篩選動物植物遺傳篩選育種

個人基因身份證環(huán)境監(jiān)測18當前第18頁\共有73頁\編于星期四\19點（三）、生物芯片應用優(yōu)勢高通量平行分析樣品自動化程度高省時省力所需樣品試劑少保護環(huán)境成本低19當前第19頁\共有73頁\編于星期四\19點生物芯片應用優(yōu)勢生物信息數(shù)據(jù)累積為生物信息公共數(shù)據(jù)庫添加更多數(shù)據(jù)有利于研究基因序列與生物表型之間的關系有助于理解疾病發(fā)生的機制20當前第20頁\共有73頁\編于星期四\19點二、生物芯片制作技術介紹21當前第21頁\共有73頁\編于星期四\19點生物芯片制作方法分類22當前第22頁\共有73頁\編于星期四\19點

原位合成

(InSituSynthesis)化學合成原子印章原位光刻合成23當前第23頁\共有73頁\編于星期四\19點原位光刻合成美國著名的Affymetrix公司率先開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻專利技術，是生產(chǎn)高密度寡核苷酸基因芯片的核心關鍵技術。24當前第24頁\共有73頁\編于星期四\19點

原位光刻合成原理Lightdirectedoligonucleotidesynthesis.Asolidsupportisderivatizedwithacovalentlinkermoleculeterminatedwithaphotolabileprotectinggroup.Lightisdirectedthroughamasktodeprotectandactivateselectedsites,andprotectednucleotidescoupletotheactivatedsites.Theprocessisrepeated,activatingdifferentsetsofsitesandcouplingdifferentbasesallowingarbitraryDNAprobestobeconstructedateachsite.25當前第25頁\共有73頁\編于星期四\19點預先合成后點樣

(off-chipsynthesis)接觸式點樣非接觸式點樣26當前第26頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片點樣的方式接觸式點樣---適合于DNA芯片的制作即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上27當前第27頁\共有73頁\編于星期四\19點接觸式點樣Best!28當前第28頁\共有73頁\編于星期四\19點ArrayItChipMakerPins帶有細槽的不銹鋼針尖載樣能力:200to600nL點樣體積:250pLto2.5nL(pinsize)點樣直徑:100μmto500μm(pinsize)DippingofpinforsamplepickupTouchingofslidewithpintoleavespotControlprintvolumewithpinsize29當前第29頁\共有73頁\編于星期四\19點StealthandChipmakerPin(TeleChem)30當前第30頁\共有73頁\編于星期四\19點Chipmaker點樣技術31當前第31頁\共有73頁\編于星期四\19點StealthPins32當前第32頁\共有73頁\編于星期四\19點CatalogNumberSpotDiameter(μm)Uptakevolume(μl)DeliveryVolume(nl)Minimumspotspacing(μm)Maximumsubgridperpin(spots)Density(spots/cm2)MaximumnumberOfspots(18mm×72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,40033當前第33頁\共有73頁\編于星期四\19點TeleChem公司點樣針技術不斷發(fā)展的專利針技術共有30種針供選擇與斯坦福大學共同發(fā)展專利pin,帶樣穩(wěn)定，樣品利用率高單次帶樣可連續(xù)點樣達200--1500次特殊不銹鋼材料，適用于各種溶液實際點樣直徑75--250um,可根據(jù)不同樣品選擇相應pin相當容易更換pin和pinhead以適應不同需要34當前第34頁\共有73頁\編于星期四\19點基因芯片點樣的方式非接觸式點樣---適合于蛋白芯片的制作

它是以電磁閥或壓電原理將樣品直接噴至固相支持物表面35當前第35頁\共有73頁\編于星期四\19點非接觸式噴點技術ThermalSolenoid螺線管PiezoelectricDP36當前第36頁\共有73頁\編于星期四\19點Synquad：通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機結(jié)合起來精確控制滴液

Piezoelectric：用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術，兩個壓電晶體同時加脈沖通電觸發(fā)這兩個壓電晶體往噴管中間變形擠壓噴管側(cè)壁，噴管出現(xiàn)收縮壓迫液體從噴嘴噴出。

DP37當前第37頁\共有73頁\編于星期四\19點非接觸式點樣：

synQUADTechnology38當前第38頁\共有73頁\編于星期四\19點??AspirateandPrintforMakingArrays39當前第39頁\共有73頁\編于星期四\19點CharacteristicsofsynQUADTechnologyWidedispenserangeLownanolitertohighmicroliterExcellentlinearityPreciseandaccurateCV’stypicallylessthan10%Precisionlessthan5%Non-contactdispensemechanismEasiermechanicalalignment(384,1536,…)“On-the-fly”printingpossibleCapableofdispensingontomembranesorslidesMultipleliquidhandlingmodesAspirate/DispenseContinuousReagentDispensing40當前第40頁\共有73頁\編于星期四\19點synQUADvsPiezoelectricPrintingsynQUAD/nQUADPatentedbyCartesianUsescommerciallyavailablecomponentsRobustandreliabledeliverymechanismLownanolitertolowmicroliterdispensevolumemaximumdensity:200to400spots/cm2PiezoelectricAbbottholdskeypatentsontechnologyDispensesusceptibletoairbubblesMid-picoliterdispensevolume~2500spots/cm241當前第41頁\共有73頁\編于星期四\19點三、

生物芯片檢測系統(tǒng)CCD掃描儀

非共聚焦激光掃描儀激光共聚焦掃描儀42當前第42頁\共有73頁\編于星期四\19點數(shù)值孔徑與采光效率NA0.3NA0.8NA=sin(),whereisthe?angleofthecone43當前第43頁\共有73頁\編于星期四\19點激光共聚焦（聚焦）Thefluorescencesourceisattheobjectivelens’focusLightgoesthroughthepinholetothedetector44當前第44頁\共有73頁\編于星期四\19點激光共聚焦（非聚焦）Fluorescencesourcebelowfocus(e.g.outoffocus)Outoffocuslightismostlyblockedatthepinhole45當前第45頁\共有73頁\編于星期四\19點ConfocalArtifactRejection

NoPinholeWithPinholeDustartifactsreducedbyatleastafactorof1046當前第46頁\共有73頁\編于星期四\19點CCDCameraSystemsAdvantages:FewmovingpartsFastscanningofbrightsamplesDisadvantages:NAlimitedtoabout0.40:LessappropriatefordimsamplesOpticalscattercanlimitperformanceNeedto“stitch”togetherlargeimagesConfocalLaserScannersAdvantagesSmalldepthoffocusreducesartifactshighlightcollectionefficiency.PMTdetectorshavethehighestsensitivityinthevisiblerange47當前第47頁\共有73頁\編于星期四\19點DNAscopeLM+

激光共聚焦芯片掃描儀48當前第48頁\共有73頁\編于星期四\19點xxyzxMACROscope?Filters49當前第49頁\共有73頁\編于星期四\19點HowtheScanSystemWorksF-thetaTelecentricScanSystemSampleScanningMirrorLaserScanLensBAC50當前第50頁\共有73頁\編于星期四\19點HowtoscanawholesampleHomeSensorScanningMirrorSampleLaserScanLens51當前第51頁\共有73頁\編于星期四\19點DNAscopeLM+優(yōu)點

共聚焦面積寬:20mm70mm可以掃描多種介質(zhì)(ImagesbothGlassSlideMicroarraysandCLONDIAGATtubes)背景噪聲低，信噪比高全自動成像，分析結(jié)果Smallfootprint(W20cmxL30cmxH20cm)52當前第52頁\共有73頁\編于星期四\19點

ImagingArraysBothDry&WetDryPBSbufferCy3Cy5Cy3andCy5labeledproteindottedonglasssubstrateandimagedat5micronresolutioninbothdryandwetformats53當前第53頁\共有73頁\編于星期四\19點Tube1Tube2Cy3ImagesoftwoClondiagArrayTubes54當前第54頁\共有73頁\編于星期四\19點四、

生物芯片技術思路的比較55當前第55頁\共有73頁\編于星期四\19點ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip20nor80n<2,000n>50,000n sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis56當前第56頁\共有73頁\編于星期四\19點cDNA芯片的缺點由于不同的基因長短不同，Tm值各異，成千上萬的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難同一。同一個體中總是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物種存在基因重疊序列的相互干擾，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制，結(jié)果的準確性也受到影響。有些組織中在DNA雙鏈中的無意義鏈中存在重疊的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表達方式很難用cDNA芯片來區(qū)分。PCR產(chǎn)物是結(jié)合穩(wěn)定的DNA雙鏈，加入探針后在雜交中必然存在競爭性抑制，影響探針和模板的結(jié)合能力和穩(wěn)定性，進一步影響cDNA芯片的分辨能力和結(jié)果的可信度，這對于低豐度的基因影響尤為明顯。PCR產(chǎn)物濃度不均一也可能導致錯誤的結(jié)論。

57當前第57頁\共有73頁\編于星期四\19點寡核苷酸芯片比cDNA芯片的優(yōu)點

探針序列經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因；減少二級結(jié)構(gòu)及其對雜交結(jié)果的影響

雜交溫度均一，提高雜交效率

；合成產(chǎn)物濃度均一，避免因樣品濃度差異而造成點樣量差異；可以設計檢測不同剪切方式的基因；

無需擴增，防止擴增失敗影響實驗。58當前第58頁\共有73頁\編于星期四\19點預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本

－cDNA芯片方法/步驟

試劑/儀器（萬）

人員（人）

耗時（月）

構(gòu)建或購買基因文庫

1-31-2

3-6

PCR引物設計與合成55-65萬

（2000個片段）1

3PCR產(chǎn)物純化及定量1.2/20

（2000個片段1

2點樣

點樣儀60萬

1

3天

雜交

0.3萬試劑1

2掃描

掃描儀60萬

1

1-2合計

197.5

–209.56-7

11-15

59當前第59頁\共有73頁\編于星期四\19點預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本

－自己合成寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）寡聚核苷酸的篩選及合成(2000個基因)200（每個基因用1個70堿基的寡核苷酸片段代替，合成1個堿基14元人民幣計）。1(寡核苷酸片段的篩選，還需專業(yè)的軟件)3-4個月，如購置DNA合成儀，成本？，但時間較長點樣點樣儀60萬11個月

雜交0.3萬試劑12個月掃描掃描儀60萬11-2個月總計320.3萬47-960當前第60頁\共有73頁\編于星期四\19點預合成后點樣系統(tǒng)的綜合成本

－應用Operon探針寡聚核苷酸芯片方法/步驟試劑/儀器（萬）人員（人）耗時（月）探針100點樣60（點樣儀）1

1

雜交0.3（試劑）1

2掃描60（掃描儀）1

1-2總計220.334-561當前第61頁\共有73頁\編于星期四\19點Affymetrix技術平臺綜合成本芯片２０萬雜交６小時洗滌４小時掃描４分鐘合計220萬１〈１２小時62當前第62頁\共有73頁\編于星期四\19點總結(jié)采用Affymetrix公司的生物芯片系統(tǒng)平臺比較適合于實力雄厚的科研實驗室，可以在最短的時間內(nèi)盡快獲得精確可靠的并且可能是前人未曾獲得的實驗結(jié)果，并可在國際權威雜志上獲發(fā)表，盡快在相關研究領域在國際領域占領一席之地。

63當前第63頁\共有73頁\編于星期四\19點總結(jié)采用合成后點樣的生物芯片平臺比較適合于目標定位于研發(fā)、生產(chǎn)的實驗室及生物公司。雖然購買芯片點樣掃描系統(tǒng)的經(jīng)費看起來比購買Affymetrix系統(tǒng)的費用要低，研發(fā)的方向可以結(jié)合實驗室的研究特點，比較靈活，但前期研究需要投入較大的人力、物力和時間，綜合成本并不低，而且獲得的芯片信息量小，可靠性較低，使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的芯片為材料進行的研究一般為驗證性工作，且因為材料的可靠性低，很難在國際權威雜志上獲得認可。目前開發(fā)生產(chǎn)的生物芯片尚無獲得醫(yī)療許可的產(chǎn)品。64當前第64頁\共有73頁\編于星期四\19點五、

生物芯片制作所需耗材65當前第65頁\共有73頁\編于星期四\19點

MicroarrayingAccessories（芯片配件）PinsandPrintheadsOmniGridSlidesandReagentsOmniGridEpoxy(環(huán)氧基修飾)OmniGridAmine(氨基修飾)OmniGridAldehyde(醛基修飾)CompletelineofassociatedreagentsHybridizationChambersHybChamber?Hyb