酶工程考試重點

酶：是由活細胞產(chǎn)生的，具有高效、專一催化功能的生物大分子。分為蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）酶工程：是生物技術(shù)的重要分支，它是酶學(xué)和微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機結(jié)合而產(chǎn)生的交叉科學(xué)技術(shù)，他是從應(yīng)用的目的出發(fā)，研究酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的一門技術(shù)性科學(xué)?？煞譃榛瘜W(xué)酶工程和生物酶工程。化學(xué)酶工程主要指天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究與應(yīng)用；生物酶工程是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，主要包括①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）②修改酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）③設(shè)計新的酶基因，合成自然界不曾有的新酶。酶工程的主要任務(wù)是經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人為操作，獲得人們所需要的酶，并通過各種方法使酶充分發(fā)揮其催化功能。食品酶工程是將酶工程的理論與技術(shù)應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域，將酶學(xué)基本原理與食品工程相結(jié)合，為新型食品及食品原料的發(fā)展提供技術(shù)支持。鎖鑰學(xué)說：當?shù)孜锲鹾系矫傅鞍椎幕钚灾行臅r，很像一把鑰匙插入到一把鎖中，因而使底物發(fā)生催化反應(yīng)。 中間產(chǎn)物學(xué)說：第五必須首先與酶形成中間復(fù)合物，然后再轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，并重新釋放出游離的酶。 誘導(dǎo)契合學(xué)說：酶分子的構(gòu)象與底物原來并非恰當吻合，只有當?shù)孜锓肿优c酶分子相碰撞時，可誘導(dǎo)酶蛋白的構(gòu)象變得能與底物配合，才結(jié)合形成中間絡(luò)合物，進而引起第五份子發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化。核酸類酶：具有催化活性的RNA酶催化作用的特點：①酶的溫和性②專一性③高效性④可調(diào)性機理：降低反應(yīng)活化能。酶活性的調(diào)節(jié)：《1》酶的可逆共價調(diào)節(jié)：指酶蛋白分子上的某些殘基在另一種酶的催化下進行可逆的共價修飾，從而使酶在活性形式與非活性形式之間相互轉(zhuǎn)變的過程；《2》酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)：指某些化合物（成為配給或效應(yīng)物）與酶的活性中心以外的位點結(jié)合后，引起酶蛋白構(gòu)象的變化，從而改變酶活性的方式，能發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶稱為別構(gòu)酶。別構(gòu)酶有多亞基，兩中心（活性中心（負責對底物的結(jié)合與催化）、別構(gòu)中心（可結(jié)合效應(yīng)物，負責調(diào)解酶促反應(yīng)的速率））協(xié)同效應(yīng)：指蛋白質(zhì)和一個配體（包括底物和效應(yīng)物）結(jié)合之后，可以影響蛋白質(zhì)和另一個配體之間的結(jié)合能力。同工酶：指能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶。沒作用的高效性機制：①鄰位效應(yīng)及定位效應(yīng)②底物分子形變③酸堿催化④共價催化⑤金屬離子催化⑥活性部位微環(huán)境的影響⑦協(xié)同催化雙底物酶促反應(yīng)動力學(xué)：（一）順序機制：主要特征：酶結(jié)合底物和釋放產(chǎn)物是按一定順序進行。①有序順序機制（底物與酶的結(jié)合以及產(chǎn)物的釋放有嚴格的順序）②隨機順序機制（兩個底物與酶的結(jié)合順序是隨機的）（二）乒乓反應(yīng)機制：反應(yīng)過程中底物與產(chǎn)物是交替的與酶結(jié)合?！鶎儆谄古覚C制的酶大多是具有輔酶的。PH影響酶促反應(yīng)速率的原因：①影響酶分子的構(gòu)象②影響酶和底物的解離③影響酶活性中心基因解離④影響中間復(fù)合物的解離抑制劑對酶促反應(yīng)的影響：（一） 不可逆的抑制作用①專一性不可逆抑制：KS型、Kcat型②非專一性不可逆抑制（二） 可逆的抑制作用①競爭性抑制作用（抑制劑通常與底物結(jié)構(gòu)類似，與底物競爭酶的結(jié)合部位，并與酶形成可逆的復(fù)合物）抑制程度取決于底物和抑制劑的相對濃度，且這種抑制作用可以通過提高底物濃度的方法來解除※特點：Vm不變Kmf②非競爭性抑制作用：底物，抑制劑與酶的結(jié)合互不相干，二者可獨立地與酶結(jié)合※特點：Km不變Vm；③反競爭性抑制作用：抑制劑必須在酶與底物結(jié)合后才能與之結(jié)合※特點：Km；Vm；酶的比活力（比活性）：指每克酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)對同一種酶來說，酶的比活力越高，純度越高。別構(gòu)酶：又稱變構(gòu)酶，多為較復(fù)雜的寡聚糖，含有兩個或多個亞基修飾酶：某些酶蛋白肽鏈上的側(cè)鏈基團在另一酶的催化下可與某些化學(xué)基團發(fā)生共價結(jié)合或解離，從而改變酶的活性，這一調(diào)節(jié)酶活性的方式稱為酶的共價修飾調(diào)節(jié)，酶稱為~~結(jié)構(gòu)酶：也稱組成酶，是細胞內(nèi)天然存在的酶，以恒定速率和恒定數(shù)量生成，含量較為未定，受外界影響很小。誘導(dǎo)酶：指當細胞中加入特定誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶，其含量在誘導(dǎo)物存在下顯著提高，這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身?，F(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)：①分批發(fā)酵②補料--分批發(fā)酵③半連續(xù)發(fā)酵④連續(xù)發(fā)酵⑤高細胞密度培養(yǎng)提高酶發(fā)酵產(chǎn)量的方法：.《1》酶的合成調(diào)控機制：（一）酶生物合成的誘導(dǎo)（能夠誘導(dǎo)某些酶合成的化合物稱為酶的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的使用可以顯著提高酶產(chǎn)量，分三類：①酶的作用底物②酶的底物類似物酶的反應(yīng)產(chǎn)物）（二）酶生物合成的阻礙（為避免分解代謝阻礙①采用難以利用的碳源②采用分次添加碳源的培養(yǎng)方法③添加一定量的CAMP）可通過控制末端產(chǎn)物濃度接觸阻礙《2》控制發(fā)酵條件提高酶產(chǎn)量《3》通過基因突變??《4》通過基因重組??《5》添加表面活性劑，添加產(chǎn)酶促進劑，添加誘導(dǎo)物，控制阻礙物※酶生物合成的模式：①同步合成型②延續(xù)合成型③中期合成型④滯后合成型首選是②延續(xù)合成型。為提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，它屬于延續(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別）酶分離純化的一般原則：①減少或防止酶的變性失活②酶的提?、勖傅募兌扰c保存酶的純化（鹽析法，等點沉淀法，有機溶劑沉淀法，共沉淀法，雙水相萃取法，反膠團萃取法，凝膠層析法，透析法）酶的分離純化三個基本環(huán)節(jié)：①抽提（把酶從原料中抽提出來，并盡可能的減少雜質(zhì)引入，得到粗酶溶液）②純化（把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或把酶從酶溶液中分離出來）③制劑（把分離純化后的酶制備成各種不同的劑型）細胞破碎分機械破碎法和非機械破碎法兩大類:①滲透壓法②酶溶法③化學(xué)法④勻漿法研磨法⑥凍融法⑦超聲波破碎法⑧壓榨法提取影響因素：①目的酶在提取溶劑中溶解度的大?、诿赣晒滔鄶U散到液相的難易程度③溶劑的PH④提取時間⑤溫度（一般0-5°C；）⑥攪拌與氧化濃縮方法有①蒸發(fā)濃縮法②超濾濃縮法③冷凍濃縮法④凝膠過濾濃縮法⑤沉淀法⑥透析法⑦吸收濃縮法純化方法有①鹽析法②等點沉淀法③有機溶劑沉淀法④共沉淀法⑤雙水相萃取法⑥反膠團萃取法⑦凝膠層析法⑧透析法結(jié)晶主要影響因素：①酶的純度（50%以上）②酶蛋白的濃度③晶種④溫度⑤合適的飽和度⑥PH⑦金屬離子⑧攪拌⑨重結(jié)晶⑩其他 主要方法：①鹽析法②有機溶劑法③微量蒸發(fā)擴散法④透析平衡法⑤等電點法酶純度方法評析標準：一是酶活回收率；二是比活力提高的倍數(shù)；三是方法的重現(xiàn)性純化操作每一步都不可避免的造成活性損失，原因有二：一是由于部分酶變性失活；二是由于各種純化方法的分辨率有限，部分酶可能連同雜蛋白一起被除去。酶活回收率是純化后樣品的總酶活占純化前樣品的總酶活的百分比，它反映了純化過程中酶活力的損失情況，這一比值越高說明酶活的保存率越高，酶活的損失越少。比活力的提高倍數(shù)則反映了純化方法的效率。純化后比活力提高越多，總活力損失越少，純化效果就越好。 實際上，純化倍數(shù)與回收率不節(jié)能兼顧，兩者存在一定的矛盾，如鹽析操作時，沉淀范圍越寬，酶活回收率越高，但是純化倍數(shù)卻越低。在實際操作過程中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適宜的方法。較好的重現(xiàn)性是評價酶分離純化方法的必要條件，操作材料要有較好的穩(wěn)定性，操作條件要容易控制。酶分子的化學(xué)修飾：可以定義為在體外利用修飾劑所具有的的各類化學(xué)基團的特性，直接或經(jīng)一定的活化步驟后與酶分子上的某種氨基酸殘基（一般盡可能選用非酶活必需基團）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，從而改造酶分子的結(jié)構(gòu)與功能。酶分子修飾：指通過對主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對酶分子進行改造。酶分子修飾方法：（一） 金屬離子置換修飾：過程①酶的分離純化②除去原有的金屬離子③加入置換離子（二） 大分子修飾（共價/非共價）采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。過程：①修飾劑的選擇②修飾劑的活化③修飾④分離（三） 臺聯(lián)有限水解修飾 （四）分子側(cè)鏈的修飾 （五）氨基酸置換修飾（六）物理修飾（七）酶分子的親和修飾固定化酶：指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶?！伴L效的酶”優(yōu)點：①多數(shù)情況下，酶經(jīng)固定化后穩(wěn)定性提高②固定化酶催化的反應(yīng)過程更易控制③固定化酶具有一定的機械強度，可以用攪拌或裝柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反應(yīng)的連續(xù)化和自動化操作④固定化酶與游離酶相比更適于應(yīng)用多酶體系?！盁o公害催化劑”缺點：①固定化可能造成酶的部分失活，酶活力損失②酶催化微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致反應(yīng)動力學(xué)發(fā)生改變③固定化使酶的使用成本增加，工廠的初始投資增大④固定化酶一般只適用于水溶性的小分子底物，不適宜大分子底物⑤固定化酶與完整菌體細胞相比，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子參加的反應(yīng)⑥胞內(nèi)酶進行固定化時必須經(jīng)過酶的分離純化操作酶的固定方法：吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法、交聯(lián)法固定化酶的形狀與性質(zhì) P195固定化酶（細胞）的活力酶反應(yīng)器：以酶或固定化酶作為催化劑進行酶催化反應(yīng)的裝置。分罐式、管式和膜式。根據(jù)反應(yīng)物狀態(tài)分為均相酶反應(yīng)器和固定酶反應(yīng)器；按操作方式分批式/連續(xù)/流加式操作。參數(shù)logP:該參數(shù)用以描述有機溶劑的極性與酶活力之間的關(guān)系，其中P值為溶劑在正辛醇和水腫的分配系數(shù)，logP越大，溶劑的疏水性越強，logP越小，溶劑親水性越強PH記憶：酶的反應(yīng)速度與其冷凍干燥前水溶液的PH密切相關(guān)，反應(yīng)得最適PH接近于水溶液中的最適PH，即有機溶液中的酶能夠記憶它冷凍干燥或丙酮沉淀前所在緩沖液PH酶合成調(diào)節(jié)的機制：①單一效應(yīng)物調(diào)節(jié)②兩種效應(yīng)物的共同調(diào)節(jié)③弱化調(diào)節(jié)金屬離子在酶調(diào)節(jié)中的作用：酶活性中心的組成部分②金屬離子在酶與底物間起橋梁作用③維持酶的空間構(gòu)象46.酶的成產(chǎn)方法？（一） 提取分離法特點：自然界生物材料多樣且十分廣泛，價格也相對便宜該生產(chǎn)方法受制與生物資源、地理環(huán)境、氣候條件等因素，產(chǎn)量低，難以滿足實際生產(chǎn)的需要，價格成本也較生物合成法高，適用于目前還難以實現(xiàn)生物合成或化學(xué)合成的酶（二） 生物合成法（三） 化學(xué)合成法特點:化學(xué)合成的成本高，而且只能合成那些化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)清楚的酶，使化學(xué)合成法受到限制，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，可生產(chǎn)既有酶的催化特點，又克服酶化不足的高效非酶催化劑等。發(fā)酵產(chǎn)酶的主要方法？各有何特點？（一） 分批發(fā)酵：指經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基在接種后開始培養(yǎng)直到結(jié)束。優(yōu)點：操作簡單，周期短，染菌的機會減少，生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。缺點：對基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物或次級代謝物，采用分批發(fā)酵不合適，因其周期較短，一般在1-3d，產(chǎn)率較低。（二） 補料--分批發(fā)酵：在分批發(fā)酵過程中，補充因維持聲場或產(chǎn)物合成所需的養(yǎng)分和前體優(yōu)點：它能在這樣一種系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度，從而避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)和能夠按設(shè)備的通氣能力去維持適當?shù)陌l(fā)酵條件，有利于次生代謝產(chǎn)物的累積，并減緩有害代謝物的不利影響 缺點：只有料液的輸入，沒有輸出，發(fā)酵液的體積在增加（三） 半連續(xù)發(fā)酵：指過程中除了補料，還間歇排放部分發(fā)酵液。優(yōu)點：克服補料帶來的體積增加的問題，可減少有害代謝物的不斷累積，盡可能延長產(chǎn)物合成的時間。缺點：其在放掉發(fā)酵液的同時，也損失了未利用的養(yǎng)分和處于生產(chǎn)旺盛的菌體，定期補充和放液會使發(fā)酵液稀釋，送去提煉的發(fā)酵液體積更大，提取工藝的負荷會增加，可能產(chǎn)生更多的代謝有害物。.（四） 連續(xù)發(fā)酵：經(jīng)一段時間的分批培養(yǎng)后，發(fā)酵過程中一面不斷地補入新鮮的料液，一面以詳盡的流速去除發(fā)酵液，基本維持發(fā)酵液體積不變。 優(yōu)點：產(chǎn)酶效率高，生產(chǎn)穩(wěn)定性好，易于實現(xiàn)自動化 缺點：污染雜菌機會大，菌種退化可能性大（五） 高細胞密度培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)點：①微生物種類繁多，可以根據(jù)實際情況進行優(yōu)選，滿足不同生產(chǎn)微生物極易誘變，篩選，為優(yōu)良菌株的選育提供捷徑③微生物容易培養(yǎng)，培養(yǎng)基來源廣，成本低④私產(chǎn)酶活力高，繁殖快，周期短⑤利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)可實現(xiàn)自動化、連續(xù)化、規(guī)?；a(chǎn)⑥微生物的基因組較小，進行基因操作相對容易，為現(xiàn)代分子生物學(xué)在食品酶生產(chǎn)的應(yīng)用提供了良好的平臺發(fā)酵產(chǎn)酶的三大步驟：①產(chǎn)菌酶活細胞的獲得②控制發(fā)酵③分離提取優(yōu)良產(chǎn)酶菌的特點：①產(chǎn)酶效率和產(chǎn)酶量高 ②容易培養(yǎng)和管理，適合高密度發(fā)酵目的酶的活性高④產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，不易退化⑤利于酶的分離純化⑥安全可靠無毒性產(chǎn)菌酶的獲得：①自然界中分離②產(chǎn)酶菌的誘變育種③產(chǎn)酶菌的雜交育種④基因工程菌酶生物合成的模式？有何特點？每個模式可通過哪些措施提高酶產(chǎn)量？（一） 同步合成型：指酶的生物合成與細胞生長同步進行的生物合成模式特點：該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開始；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成，當細胞進入平衡期后，酶的合成隨著停止?！岣呙府a(chǎn)量措施：必須提高培養(yǎng)體系中高活力細胞的數(shù)量，采用最適宜的培養(yǎng)基，建立最合適產(chǎn)酶菌生長繁殖的培養(yǎng)條件，并在細胞進入平衡期后及時終止發(fā)酵，進行酶的分離提純（盡量提高對應(yīng)mRNA的穩(wěn)定性）（二） 延續(xù)合成型：酶的生物合成從細胞的生長階段開始，進入平衡期后，還可延續(xù)合成較長時間特點：延續(xù)合成型的酶，其生物合成可以受誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物阻遏，酶在生長達到平衡期后，仍可延續(xù)合成。mRNA相當穩(wěn)定措施：不僅要提高產(chǎn)酶菌的生長狀況，獲得更多的高活力的細胞數(shù)量，還要防止阻遏物的影響，在進入平衡期后，盡量延長產(chǎn)酶時間和產(chǎn)酶效率（三） 中期合成型：酶一般在C生長一段時間后開始合成，進入平衡期后，酶合成停止。特點：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏作用，且編碼酶的mRNA穩(wěn)定性較差 ※※提高產(chǎn)酶量的措施：注意選育抗反饋阻遏或抗分解代謝的變異菌株，要注意控制反饋阻遏或者分解代謝阻遏（提高mRNA穩(wěn)定性及接觸阻遏）（四） 滯后合成型：酶在C生長一段時間或進入平衡期