臍血干細(xì)胞分化與應(yīng)用

臍血干細(xì)胞分化與應(yīng)用第一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一“干細(xì)胞”的概念在數(shù)十年前就已有介紹，但是直到目前，仍然還無法從形態(tài)或表型界定干細(xì)胞，而只能根據(jù)其功能定義。干細(xì)胞具有兩種特定的功能。增殖功能指干細(xì)胞具有自我更新能力，可以生成更多的干細(xì)胞；分化功能則指干細(xì)胞能分化成為各種祖細(xì)胞，后者可以進(jìn)一步分化成各種特定成熟細(xì)胞系。因此，目前干細(xì)胞的最好界定方法是功能學(xué)法。第二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ES)被認(rèn)為是最多能的干細(xì)胞群體，具有最大的發(fā)展?jié)撃埽瑢?duì)胚胎細(xì)胞或組織的利用還存在倫理學(xué)爭(zhēng)議。成體干細(xì)胞。在許多成人組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種干細(xì)胞群體存在，如骨髓中的造血干細(xì)胞，以及其他骨髓衍生干細(xì)胞(BMSC)能分化為血細(xì)胞和多種組織細(xì)胞。為了避免潛在的倫理學(xué)問題，克服免疫不相容性，在未來的組織工程中自身成人干細(xì)胞可能成為理想的選擇。臍帶血干細(xì)胞的特性和用途可能有效地替代骨髓和外周血。第三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)以識(shí)別干細(xì)胞表面標(biāo)記物作為基礎(chǔ)，如CD34、AC133、STRO-1和神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75等已經(jīng)用于干細(xì)胞的純化實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞淘選、熒光激活細(xì)胞分類、免疫磁性選擇和免疫吸附柱分離等。目前有證據(jù)表明，如果利用某種單一的標(biāo)記物分子進(jìn)行干細(xì)胞分離，而對(duì)不表達(dá)該標(biāo)記物的新干細(xì)胞群體尚未充分研究，則不能完全肯定分離結(jié)果。例如，干細(xì)胞活性與CD34分子在細(xì)胞膜上的表達(dá)不完全相關(guān)，小鼠體內(nèi)存在一大群“靜默”干細(xì)胞，它們不表達(dá)CD34分子但仍具有完整的重建能力。在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在類似的CD34陰性休眠生血干細(xì)胞。因此，在未來實(shí)驗(yàn)中應(yīng)設(shè)計(jì)新的方案，以成熟細(xì)胞系的標(biāo)記物作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)會(huì)更有效。第四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一為了克服干細(xì)胞數(shù)量少的不足，眾多學(xué)者已經(jīng)在探索干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法。但是，如何在長期的擴(kuò)增過程中使干細(xì)胞不分化而又保持其多系分化能力成為一大難題。在干細(xì)胞臨床實(shí)際應(yīng)用中，理論上認(rèn)為需要一個(gè)無基質(zhì)、無血清的體外系統(tǒng)，并用已知的細(xì)胞因子和生長因子維持。白細(xì)胞介素-3(IL-3)、干細(xì)胞因子(SCF)和Flt-3配體(FL)具有非細(xì)胞系特異性的早期生血刺激作用，可用于臍血干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)。血小板衍生生長因子(PDGF)-BB和表皮生長因子(EGF)是最有效的人類骨髓衍生干細(xì)胞克隆生長支持因子。從人類發(fā)育中的腦皮層中已成功分離出神經(jīng)前細(xì)胞，并利用表皮生長因子和纖維母細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)使其擴(kuò)增。進(jìn)一步的研究，如系統(tǒng)性分析生長因子受體的表達(dá)，將有助于設(shè)計(jì)新的干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方案。第五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一在干細(xì)胞研究中，熱點(diǎn)之一是調(diào)控細(xì)胞向預(yù)定群體分化。過去數(shù)年間，關(guān)于干細(xì)胞在體內(nèi)以及體外分化成各種成熟細(xì)胞的報(bào)道大批涌現(xiàn)。干細(xì)胞最重要的細(xì)胞外調(diào)控信號(hào)之一是生長和分化因子。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族成員對(duì)胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)脊干細(xì)胞有顯著的促分化效應(yīng)，Wnt家族分子在多種不同的細(xì)胞分化中也起著重要作用。但是，由于還無法得到純化的功能性Wnt蛋白，對(duì)于多種Wnt因子的確切效應(yīng)的更深入研究受到了限制。除了各種分泌因子外，整合膜蛋白和整合素、細(xì)胞外基質(zhì)在干細(xì)胞調(diào)控微環(huán)境中也發(fā)揮作用。第六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。產(chǎn)生和作用的高效性、多樣性、瞬時(shí)性。細(xì)胞因子的作用通過與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而起作用。一般培養(yǎng)細(xì)胞中細(xì)胞因子的使用量為5ng~100ng/ml,有量效關(guān)系。細(xì)胞因子間有協(xié)同作用、相加作用、拮抗作用用于細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子

造血干細(xì)胞：Flt-3ligand,SCF,TPO,IL-3,IL-7,IL-11

樹突狀細(xì)胞：GM-CSF,G-CSF,IL-1beta,IL-4,TNFalpha

神經(jīng)干細(xì)胞：EGF,FGF-basic

間充質(zhì)干細(xì)胞：EGF,PDGF-AA

胚胎干細(xì)胞：FGF-basic

用于細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞因子

Activins,BMPs,Cripto-1,Dkk-1,FGF-8,GDFs,Lif,Nodal,Noggin,Notch,Shh,TGFbeta,Wnts第七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一第八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一造血干細(xì)胞CD133、CD34等+間充質(zhì)干細(xì)胞CD13、29、44、105等+SCF、CSF

、IL-3,6

等可刺激細(xì)胞擴(kuò)增采用密度梯度離心法和貼壁法分離采用密度梯度離心法和免疫磁珠法分離調(diào)整培養(yǎng)基偏酸性，1%pen-strep不同誘導(dǎo)分化條件分化為不同細(xì)胞第九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一臍血造血干細(xì)胞的含量等于或超過骨髓。造血譜系標(biāo)記,如CD3、CD14、CD19、CD34、CD45等呈陽性。在體外對(duì)臍血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)使用SCF加G-CSF、

GM-CSF、IL-3、IL-6等作為刺激因子培養(yǎng)

,細(xì)胞集落形成增加,臍血中的造血干細(xì)胞有更大的潛在分化和增殖能力。從臍血中分離出單核細(xì)胞,在體外培養(yǎng),貼壁細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞和間充質(zhì)樣細(xì)胞兩種,間充質(zhì)樣細(xì)胞表達(dá)多種間葉祖細(xì)胞(MPCs)的相關(guān)抗原(SH-2、SH-3、SH-4、ASMA、MABl470、CDl3、CD29、CD44、CD105)。用含2%和5%較低血清濃度的條件下,臍血單個(gè)核細(xì)胞可分化成較為均一的間充質(zhì)樣細(xì)胞,并可以在數(shù)量上擴(kuò)增的同時(shí),保持其多向分化的潛能，在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等。第十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一采用MiniMACS分選系統(tǒng)分離臍血CD34+細(xì)胞,其純度可達(dá)到(83.13±10.73)%,得率一般為1%。采用新鮮的臍血分離CD34+單個(gè)核細(xì)胞。一般(2～5)×108臍血單個(gè)核細(xì)胞能分離出(3～5)×106CD34+細(xì)胞。第十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一臍血、成人外周血和骨髓CD34+含量（x±S）

標(biāo)

本

標(biāo)本數(shù)（n）

CD34+含量（%）

成人骨髓73.19±1.05*Δ

臍血

482.14±1.23**成人外周血

480.19±0.14

*骨髓與臍血比較P<0.05；**臍血與外周血比較P<0.001

Δ骨髓與外周血比較P<0.001

臍血中CD34+含量與新生兒性別、體重、臍血血象和產(chǎn)婦年齡的關(guān)系

（1）臍血中CD34+含量與新生兒性別關(guān)系：

男性CD34+細(xì)胞百分率為1.87±0.79

女性CD34+細(xì)胞百分率為2.51±1.49

兩者比較有顯著性差異（P<0.001），女性高于男性。

（2）新生兒體重、產(chǎn)婦年齡（24~39歲）與CD34+百分比無相關(guān)性（P>0.05）

（3）臍血血象與臍血CD34+細(xì)胞含量關(guān)系無相關(guān)性（P>0.05）第十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一

臍血和成人外周血淋巴細(xì)胞表型及NK細(xì)胞活性（x±S）

臍血成人血CD350.0±12.4Δ73.3±8.9CD440.1±12.440.7±7.1CD813.8±4.3Δ27.0±5.5CD4/CD83.2±1.5Δ1.6±0.4CD1616.9±6.2Δ11.9±6.3NK-A17.8±12.4Δ40.8±21.6

Δ臍血與成人血比較，P<0.01。

第十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一臍血清與成人外周血清中IL-2、TNFα、SIL-2R水平（x±S）

標(biāo)本樣品數(shù)量IL-2（pg/ml）TNFα（pg/ml）SIL-2R（pg/ml）臍血404240181.4±113.35.51±0.92214.0±96.1成人血373537305.2±125.47.45±1.58112.1±72.5

P值<0.01<0.01<0.01不同血清培養(yǎng)體系中臍血CFU-GM產(chǎn)率（x±S，n=5）

刺激因子

臍血清臍血清+GM-CSF胎牛血清

胎牛血清+GM-CSF

集落產(chǎn)率/10.6±3.837.4±11.6*012.8±4.0

1×105

細(xì)胞

*臍血清與胎牛血清比較P<0.01

臍血清對(duì)臍血細(xì)胞有體外促增殖作用，而胎牛血清則無此作用，說明臍血清含有促CFU-GM生長的造血活性物質(zhì)。在培養(yǎng)體系中加入GM-CSF時(shí)，集落數(shù)都增加，但臍血清組增加顯著，說明臍血清中含有與外源性GM-CSF協(xié)同因子。

第十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一臍血清與成人外周血清中集落刺激活性（CSA）、白細(xì)胞介素3（IL-3）、粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）水平臍血、成人血清中CSA、IL-3、GM-CSF活性比較（x±S）

血清臍血清（U/ml）外周血清（U/ml）

CSA248.30±155.974.38±1.89GM-CSF197.78±111.01112.09±91.91*IL-3638.3±205.966.8±39.3

臍血中含有高水平的CSA，之中以IL-3含量為主，而GM-CSF含量很低。t值12.9，

P值<0.001

研究方法：1．粒系集落計(jì)數(shù)法

2．臍血粒巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM）微量培養(yǎng)法

3．MTT法第十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一(1)來源豐富,易于獲得;(2)取血時(shí)對(duì)于母體和嬰兒均無痛苦;(3)臍血可以長期儲(chǔ)存

;(4)發(fā)生移植物抗宿主病的發(fā)生率低

;HLA-DR、CD80、CD86陰性表達(dá);其中,HLA-DR位點(diǎn)是異基因移植時(shí)免疫排異反應(yīng)發(fā)生的主要位點(diǎn);CD80和CD86是移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生的最重要共刺激通路B7/CD28的信號(hào)分子。(5)臍血中含各種原始細(xì)胞如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞,具有較強(qiáng)的增殖分化的能力;(6)臍血中各種病毒感染的幾率相對(duì)較少。近年來,臍血由于其獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn),儲(chǔ)存數(shù)量及進(jìn)行臍血治療的患者日益增多。第十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一第十七頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一SCF/CSF/IL-3等刺激細(xì)胞擴(kuò)增bFGF/EGF/NGF/IGF等促進(jìn)細(xì)胞定向分化CD34+細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化多種細(xì)胞因子的組合會(huì)更好。但細(xì)胞因子和細(xì)胞因子之間存在協(xié)同作用、拮抗作用、疊加作用等IL-3能促進(jìn)G0期造血干細(xì)胞（靜默干細(xì)胞）進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，IL-6可協(xié)同IL-3支持多能干細(xì)胞分化增殖。第十八頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一臍血單個(gè)核細(xì)胞106/cm2

接種于MesencultTM培養(yǎng)液(StemCell公司)中,調(diào)整培養(yǎng)基偏酸性，1%pen-strep，37℃、5%CO2培養(yǎng)。1周后,更換培養(yǎng)基,棄掉未貼壁細(xì)胞。以后每3d換液1次。細(xì)胞長到80%融合時(shí),用1∶1的2.5g/L的胰蛋白酶和0.2g/LEDTA混合液消化(在顯微鏡下控制消化時(shí)間),以8.0×103/cm2

的密度接種于傳代培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。第十九頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一定向誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化：取傳至第3代的MSCs按4×105/L密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片，用含有1mmol/Lβ-巰基乙醇的DMEM（20％FCS）預(yù)誘導(dǎo)24h，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L二甲基亞砜和100mmol/L丁化羥基苯甲醚的無血清DMEM進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔30分鐘在倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞型態(tài)變化。第二十頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一貼壁細(xì)胞以間充質(zhì)細(xì)胞為主，同時(shí)有大量破骨樣細(xì)胞傳代后，破骨樣細(xì)胞減少，逐漸形成MSCs傳代1-2周后，MSCs融合，增殖能力強(qiáng)第二十一頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一第二十二頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一心血管、腦血管、外周血管等缺血性病變引起多種臨床疾病，如冠心病、心肌梗塞、腦血栓、脈管炎、股骨頭壞死、糖尿病足等….10幾年前人們已開始血管再生的試驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用。如將VEGF質(zhì)粒直接注入閉塞的外周動(dòng)脈,4周后血管造影顯示側(cè)支血管增加,多普勒超聲檢查示血流量增加80%,外周動(dòng)脈閉塞的間歇性跛行和冠心病應(yīng)用中有明顯療效。近年,內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPC)與血管新生的關(guān)系及在治療性血管新生中的作用受到特別的注意。第二十三頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一成年后EPC主要分布于骨髓,外周血液中也有少量EPC,約為2～4EPC/ml,在急性心肌梗死時(shí)為10～40EPC/ml,臍帶血中可達(dá)1000～4000EPC/ml,其特異的細(xì)胞表面標(biāo)志為CD34+、Flk21+與AC133+。VEGF是EPC的增殖與分化的必需誘導(dǎo)因子,GM-CSF也促進(jìn)EPC的增生與分化,而血管抑制素(angiostatin)起抑制作用。此外,他汀類藥物可將EPC從骨髓動(dòng)員至外周血并增加其功能與活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：

1）給后肢缺血的裸鼠注入人臍血EPC能顯著增加局部血流量與微血管密度。

2）給心肌梗死的裸鼠靜脈注射EPC可促進(jìn)新血管的形成,并減少缺血心肌細(xì)胞的凋亡。

3）年幼(3月)小鼠骨髓EPC能促進(jìn)老年(18月)小鼠的心肌血管增生與心臟功能改善。

4）將VEGF基因轉(zhuǎn)染至EPC,使后者具有更高的增殖活性與功能,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí),轉(zhuǎn)染有VEGF的EPC增加細(xì)胞的增殖與參與血管形成,促進(jìn)缺血心肌與肢體的血管新生,達(dá)到改善功能與保護(hù)肢體的目的。

第二十四頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一LygaseClosedCircleCohesiveEndsLinearDoubleStrandedOpenedCircle第二十五頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一血管新生是當(dāng)前醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究的熱點(diǎn),治療性血管新生在心臟血管與外周血管狹窄的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有很好的效果,并且已在數(shù)百例心與外周動(dòng)脈缺血患者進(jìn)行了臨床一、二期試驗(yàn)治療,取得了一定的成績。但由于對(duì)人有效灌注所需的管腔面積要比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大得多,因此取得理想治療效果要困難得多。一些重要的問題尚待進(jìn)一步解決:①確定合適的劑量以及更合理地聯(lián)合運(yùn)用多種誘導(dǎo)因子?②延長轉(zhuǎn)染的基因在體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間?③是否有使機(jī)體其他部位不該增生的血管增生的危險(xiǎn)?

治療性血管新生為心與外周血管疾病的防治開辟了一個(gè)新的途徑,并可能特別適用于那些不能用藥物、介入和/或手術(shù)治療,或治療效果不好的患者。此外,這種新的治療方法也可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與手術(shù)傷口愈合,將有廣泛的應(yīng)用前景。第二十六頁，共二十九頁，編輯于2023年，星期一血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種內(nèi)皮細(xì)胞專一性絲裂原和血管新生強(qiáng)烈的刺激因子。內(nèi)皮細(xì)胞表面的兩個(gè)酪氨酸激酶受體Flt-1與Flt-1/KDR與VEGF結(jié)合后,傳導(dǎo)相應(yīng)的增殖與遷移信號(hào),使內(nèi)皮細(xì)胞增殖,形成新的毛細(xì)血管并重構(gòu)與穩(wěn)定。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)及其受體FGR2,血管生長素1(Ang-1)及其受體Tie-1與Tie-2,胎盤生長因子(PlGF),肝細(xì)胞生長因子(HGF),血管生成素(angiogenin)、血小板衍生生長因子(PDGF)與環(huán)氧化酶-2也是重要的促血管