腫瘤的過繼性細胞免疫治療

學習內(nèi)容與要求掌握腫瘤的過繼性細胞免疫治療的定義及原理。熟悉LAK、TIL、CD3AK、CIK、CTL細胞的制備方法及研究進展。當前第1頁\共有72頁\編于星期四\11點概述腫瘤的過繼性細胞免疫治療(Adoptivecellularimmunotherapy，ACI或AIT)是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞(特異性的和相對特異性的)直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體免疫反應殺傷腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。

當前第2頁\共有72頁\編于星期四\11點簡要歷史回顧20世紀60年代：發(fā)現(xiàn)細胞免疫引起組織器官移植排斥啟發(fā)人們應用過繼性細胞免疫治療腫瘤。20世紀80年代：85年，Rosenberg報道LAK/IL-2治療晚期惡性腫瘤具有療效。86年，報道TIL。1991年，斯坦福大學的SchmidtWolf等報道了CIK細胞。當前第3頁\共有72頁\編于星期四\11點一）淋巴因子激活的殺傷細胞

(Lymphokineactivatedkillercells,LAK)病人外周淋巴細胞（體外）IL-2激活回輸病人當前第4頁\共有72頁\編于星期四\11點LAK治療方法優(yōu)點只對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性；基本無毒副作用；不依賴荷瘤者免疫功能；可與其他療法聯(lián)合使用；無免疫抑制作用。當前第5頁\共有72頁\編于星期四\11點LAK細胞殺傷腫瘤細胞的作用機制LAK細胞的異質(zhì)性LAK細胞表面存在多種與腫瘤識別相關的特異性分子。LAK殺傷腫瘤細胞不受MHC限制當前第6頁\共有72頁\編于星期四\11點LAK細胞殺傷腫瘤細胞的作用機制

效靶細胞結(jié)合后，通過分泌細胞毒顆粒，在Ca2+存在時，釋放其中的穿孔素、絲氨酸酯酶、TNF樣分子等殺傷介質(zhì)，直接殺傷靶細胞。通過LAK細胞表面的殺傷分子(如m-LT)直接殺傷靶細胞。通過分泌其他細胞因子間接殺傷靶細胞。當前第7頁\共有72頁\編于星期四\11點同種異體LAK細胞(Allo-LAK)Allo-LAK細胞的有效性

Allo-LAK細胞的安全性當前第8頁\共有72頁\編于星期四\11點

LAK細胞分布特點和臨床療效一致，即對肺、肝、腎等器官腫瘤療效較好，而對其他器官的腫瘤療效不明顯。

LAK細胞體內(nèi)回輸后組織器官分布當前第9頁\共有72頁\編于星期四\11點LAK細胞的制備LAK細胞的來源:患者自體外周血、6～7個月齡的胎兒胸腺和脾臟細胞、同種異體外周血、臍帶血。細胞因子對LAK的誘導

IL-2/IL-15/IL-7當前第10頁\共有72頁\編于星期四\11點（二）腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)1）腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）激活病人Tumor分離淋巴細胞IL-2回輸當前第11頁\共有72頁\編于星期四\11點當前第12頁\共有72頁\編于星期四\11點TIL細胞的特征TIL細胞的異質(zhì)性

CD3、CD4、CD8T細胞TIL的作用機理誘導腫瘤細胞凋亡機制：TIL分泌細胞因子誘導調(diào)亡；釋放穿孔素引起凋亡。當前第13頁\共有72頁\編于星期四\11點

影響TIL擴增和轉(zhuǎn)化的因素

影響因素作用

抗原輻射滅活的自身腫瘤抗原刺激TIL生長高水平表達HLA-1抗原的腫瘤細胞誘導TIL中CD4＋CTL細胞產(chǎn)生缺乏HLA-1抗原的腫瘤細胞誘導TIL中CD4＋細胞產(chǎn)生細胞因子低濃度IL-2(10-20U/ml)誘導對自身腫瘤細胞的特異性殺傷

IL-2+IL-4促進TIL細胞的增殖

GM-CSF+IL-2促進CTL細胞的增殖

IL-6促進腎癌來源的TIL增殖和特異性與非特異性的CTL的產(chǎn)生

IL-7促進TIL的增殖

GM-CSF+IL-2擴增TIL和提高TIL的殺傷活性抑制因子

IL-10+TGF-β抑制TIL生長和殺傷活性前列腺素抑制TIL的轉(zhuǎn)化當前第14頁\共有72頁\編于星期四\11點細胞毒藥物對TIL的影響

化療藥物對TIL毒性大于對腫瘤細胞的殺傷性，因而在應用TIL過繼免疫治療時不宜同時使用化療藥物.當前第15頁\共有72頁\編于星期四\11點TIL細胞的制備方法

TIL來源：①手術切除或活檢的瘤體組織；②癌性胸水、腹水中淋巴細胞；③轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。TIL體外激活：(1)白介素系統(tǒng)；

(2)TNF-α與IL-2的協(xié)同作用；(3)TIL與自身瘤細胞、自身淋巴細胞共同培養(yǎng)；(4)淋巴因子基因轉(zhuǎn)導TIL；(5)雙功能抗體導向TIL。

當前第16頁\共有72頁\編于星期四\11點TIL的臨床應用及展望

TIL細胞的臨床應用受到許多因素制約發(fā)展方向：①增強TIL細胞增殖力以及特異性殺傷腫瘤細胞活性；②與其它細胞因子聯(lián)合治療，提高療效；③改變TIL細胞的輸注途徑，縮短距離，使TIL細胞能更有效地達到并聚集瘤體處；④提高T細胞分泌Th1型細胞因子的能力，抑制分泌Th2型細胞因子。當前第17頁\共有72頁\編于星期四\11點抗CD3

McAb激活的殺傷細胞(CD3AK)

CD3AK細胞是指用特定的抗CD3McAb激發(fā)免疫活性細胞的增殖并誘導相關細胞因子的表達和分泌，從而產(chǎn)生的可有效攻擊腫瘤的殺傷細胞，故稱之為抗CD3McAb激活的殺傷細胞(anti-CD3McAbactivatedkillercells,CD3AK)。

當前第18頁\共有72頁\編于星期四\11點當前第19頁\共有72頁\編于星期四\11點CD3AK細胞的免疫學特征

CD3AK細胞中含有高比例的CD3＋細胞和CD56＋或CD57＋細胞。通過自體輔佐細胞(單核或巨噬細胞)提呈處理過的抗原作用于TCR可激活T細胞。作用于TCR-CD3復合物的抗CD3McAb可模擬這種效應。當前第20頁\共有72頁\編于星期四\11點CD3AK細胞制備人外周血單個核細胞(淋巴細胞)

加入CD3McAb再加入低劑量的IL-2當前第21頁\共有72頁\編于星期四\11點CD3AK細胞治療腫瘤的優(yōu)點

CD3AK細胞選擇性地殺傷腫瘤細胞CD3AK細胞具有更為廣譜的殺傷腫瘤作用CD3AK細胞增殖能力大大優(yōu)于LAK細胞CD3AK細胞的增殖和維持可以不依賴或少依賴外源的IL-2當前第22頁\共有72頁\編于星期四\11點多種細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokinesinducedkillers,CIK)

將人外周血或骨髓單個核細胞在體外用多種細胞因子與CD3McAb共同培養(yǎng)一段時間后獲得的殺傷細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokines-inducedkillercells,CIK細胞)當前第23頁\共有72頁\編于星期四\11點CIK細胞的制備分離獲取外周血單個核細胞

誘導活化(IL-2,,Anti-CD3McAb,IFN-γ,PHA)高效擴增（IL-2,Anti-CD3McAb,IFN-γ,PHA）外周血收集CIK/TIL，全身/局部回輸當前第24頁\共有72頁\編于星期四\11點細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyteCTL)

T淋巴細胞通過TCR-CD3復合物、MHC分子、抗原肽及協(xié)同刺激分子共同刺激，增強T淋巴細胞增殖及效應。

當前第25頁\共有72頁\編于星期四\11點當前第26頁\共有72頁\編于星期四\11點CTL細胞的制備①分離腫瘤細胞；②調(diào)變腫瘤細胞：用直接導入方法或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的轉(zhuǎn)移方法向腫瘤細胞導入B7基因，并檢測腫瘤細胞表達B7分子的情況；③誘導CTL：用調(diào)變修飾后的腫瘤細胞與效應細胞共同培養(yǎng)，誘導高活性的CTL；④分離CTL用于臨床治療。當前第27頁\共有72頁\編于星期四\11點過繼性免疫療法存在的問題

由于腫瘤細胞的不均一性及效應細胞的異質(zhì)性造成療效的不確定性;體外大量擴增過繼免疫細胞技術有待開發(fā)；輸注的細胞向腫瘤組織的聚集性弱;體內(nèi)過繼免疫機制的進一步明確；與其它腫瘤治療方法的有機整合需要進一步完善；缺乏統(tǒng)一的能指示臨床轉(zhuǎn)歸的的免疫檢測指標；當前第28頁\共有72頁\編于星期四\11點單克隆抗體與腫瘤分子靶向治療當前第29頁\共有72頁\編于星期四\11點概述腫瘤分子靶向治療：利用腫瘤組織或細胞所具有的特異性(或相對特異的)結(jié)構(gòu)分子作為靶點，使用某些能與這些靶分子特異結(jié)合的抗體、配體等達到直接治療或?qū)蛑委熌康牡囊淮箢愔委煼椒ā?/p>

當前第30頁\共有72頁\編于星期四\11點分子靶向治療的靶點細胞受體信號轉(zhuǎn)導細胞周期血管生成當前第31頁\共有72頁\編于星期四\11點單克隆抗體在腫瘤分子靶向治療中的地位

腫瘤抗體靶向治療的發(fā)展歷史

腫瘤單克隆抗體靶向治療的作用機制當前第32頁\共有72頁\編于星期四\11點腫瘤抗體靶向治療的發(fā)展歷史鼠源性多克隆抗血清是最早被用于治療腫瘤的抗體分子

1975年利用雜交瘤技術成功地制備McAb，大大推動了腫瘤生物靶向治療的進展

近十年來已研究制備出人鼠嵌合抗體、人源化抗體和完全人源抗體當前第33頁\共有72頁\編于星期四\11點抗體的結(jié)構(gòu)和功能當前第34頁\共有72頁\編于星期四\11點抗體作為腫瘤的靶向治療得益于抗體兩個關鍵性技術的突破：人鼠嵌合抗體、人源化抗體和完全人源抗體技術及制備技術的成熟，基本上可以克服鼠源性抗體用于人體產(chǎn)生抗抗體的問題抗體庫的建立和篩選以及多價重組抗體制備技術的發(fā)展，使人們能夠直接獲得特異性強和親和力高的單克隆抗體。當前第35頁\共有72頁\編于星期四\11點1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。當前第36頁\共有72頁\編于星期四\11點①嵌合抗體鼠源V區(qū)人源C區(qū)小鼠雜交瘤細胞人B細胞V區(qū)基因C區(qū)基因鼠源V區(qū)鼠源C區(qū)當前第37頁\共有72頁\編于星期四\11點

構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。構(gòu)建重組表達載體當前第38頁\共有72頁\編于星期四\11點2鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術。

CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。

當前第39頁\共有72頁\編于星期四\11點②人源化抗體小鼠雜交瘤細胞人B細胞CDR區(qū)基因V支架區(qū)

C區(qū)基因當前第40頁\共有72頁\編于星期四\11點③完全人源化抗體小鼠B細胞敲除小鼠

Ig基因人Ig基因Ag骨髓瘤細胞雜交瘤細胞當前第41頁\共有72頁\編于星期四\11點

由于抗體技術的發(fā)展，至今全球已報道的抗體有１０多萬種，其中基因工程抗體有１０００多種，人源化抗體２００多種。目前國際上已有５００多種抗體用于診斷和治療，ＦＤＡ至今已批準１８種抗體上市，其中８種是用于治療腫瘤的靶向抗體。

單克隆抗體靶向治療當前第42頁\共有72頁\編于星期四\11點當前第43頁\共有72頁\編于星期四\11點至2000年底，在美國藥品市場上生物技術藥物有76種，其中抗體藥物有15種2003年治療用單抗的銷售總額已超過52億美元;2006年預計50~60個治療性單抗上市;2010年預計單抗銷售額200億美元;美國已占全球單抗市場90%—一支獨秀;完全人源化單抗現(xiàn)有多個處于臨床前階段。當前第44頁\共有72頁\編于星期四\11點腫瘤單克隆抗體靶向治療的作用機制直接作用ADCC作用：(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)CDC作用（complement-dependentcytoxicity,CDC）通過McAb的主動免疫

當前第45頁\共有72頁\編于星期四\11點當前第46頁\共有72頁\編于星期四\11點CDC作用：抗體的Fc段與補體成分C1q結(jié)合，通過經(jīng)典途徑激活補體，導致腫瘤細胞溶解死亡。當前第47頁\共有72頁\編于星期四\11點間接作用：抗體結(jié)合同位素、化療藥物或細胞毒素，通過攜帶抗腫瘤制劑，直接抵達腫瘤局部，提高抗腫瘤制劑的療效。當前第48頁\共有72頁\編于星期四\11點當前第49頁\共有72頁\編于星期四\11點抗人白細胞分化抗原的抗體治療白細胞分化抗原（CD分子）是白細胞在正常分化成熟不同譜系和不同階段以及活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記。多種抗人白細胞分化抗原已用于腫瘤的治療靶點。當前第50頁\共有72頁\編于星期四\11點抗CD20抗體

85%-90%的淋巴瘤屬于B細胞來源。CD20存在于超過90%B淋巴細胞。造血干細胞、漿細胞、淋巴祖細胞以及其它組織均無表達，人體血清中亦無游離CD20的存在。CD20不會輕易從細胞膜上脫落。當前第51頁\共有72頁\編于星期四\11點抗CD20抗體（美羅華（Rituximab，Rituxan），第一個通過FDA批準應用于臨床的人鼠嵌合型單抗。作用機制：激活補體介導的溶解及參與抗體依賴細胞介導的細胞毒作用，有效殺滅CD20陽性的B淋巴瘤細胞；增加化療藥物的細胞毒作用并誘導凋亡。當前第52頁\共有72頁\編于星期四\11點同位素結(jié)合性抗體同位素免疫結(jié)合可用于抗體攜帶同位素到達腫瘤細胞，產(chǎn)生殺腫瘤的局部治療效果；還可作為臨床檢測腫瘤的一種敏感的工具。Zevalin（澤娃靈）釔９０（90Y）同位素標記的鼠源性抗CD20抗體與癌變的B—淋巴細胞表面的CD-20抗原結(jié)合，殺死癌細胞。當前第53頁\共有72頁\編于星期四\11點抗CD33結(jié)合性抗體

CD33可以在90%的AML原始細胞上被檢出。幾乎在所有的正常早期髓系、紅系前體細胞上均有表達，但在正常造血干細胞或非造血細胞上并不表達。沒有證據(jù)表明與CD33抗體結(jié)合可以引起凋亡。當前第54頁\共有72頁\編于星期四\11點單抗能特異性捕捉腫瘤抗原，用抗體攜帶化療藥物，可提高化療藥物在腫瘤的局部劑量，減少化療藥物的全身毒性反應。2000年FDA批準用于治療急性復發(fā)性髓性白血病的Mylotarg（麥羅塔）是由抗CD33單抗與抗腫瘤抗生素calicheamicin（卡奇霉素）構(gòu)成的偶聯(lián)物，也是第一個獲批準用于臨床治療的以化療藥物為“彈頭”的抗體藥物。

當前第55頁\共有72頁\編于星期四\11點腫瘤放射免疫靶向治療利用特異性抗體作載體，與能釋放β或α射線的放射性核素耦合，注入體內(nèi)與腫瘤細胞特異性結(jié)合，實現(xiàn)對瘤體的內(nèi)照射治療。一般用于治療白血病及淋巴瘤。鼠源性抗體作載體。當前第56頁\共有72頁\編于星期四\11點阻斷信號傳導通路的靶向治療許多腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達。EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的抑制有關。

當前第57頁\共有72頁\編于星期四\11點腫瘤細胞特別是EGFR+的腫瘤細胞的生長明顯依賴于EGFR信號傳導，其EGFR表達水平可比正常細胞高幾千倍。當前第58頁\共有72頁\編于星期四\11點抗EGFR的單抗

（Erbitux）作用機制：特異性與表皮生長因子受體（EGFR,HER1,c-ErbB-1）結(jié)合，競爭性抑制表皮生長因子與該受體的結(jié)合，阻止相應酪氨酸激酶磷酸化后的信號傳導過程，從而抑制細胞生長，誘導凋亡。抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子的活性。臨床療效：適用轉(zhuǎn)移性大腸癌。當前第59頁\共有72頁\編于星期四\11點HER2具有以下重要特點：①體外試驗中HER2+細胞表現(xiàn)致瘤特性；②HER2擴增／過度表達是腫瘤發(fā)生過程中的早期事件；③在各期乳腺癌中，HER2狀態(tài)長時間保持穩(wěn)定；④HER2定位于細胞膜，成為易于攻擊的潛在治療靶點當前第60頁\共有72頁\編于星期四\11點抗HER-2的單抗

（Herceptin）作用機制：與HER-2受體結(jié)合，抑制細胞生長信號傳遞通路；加速HER-2受體降解，使HER-2受體表達下調(diào)。對腫瘤細胞株可介導抗體依的細胞毒作用，殺傷靶細胞；抑制血管內(nèi)皮生長因子的生成，阻斷腫瘤內(nèi)血管組織的生長。臨床療效：適用轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

當前第61頁\共有72頁\編于星期四\11點酪氨酸激酶抑制劑Glivec(STI571，Gleevec，格列衛(wèi)）是瑞士諾華公司上市的一種抗白血病藥物。通過抑制生長因子受體酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)而抑制腫瘤細胞生長，已成功用于慢性髓細胞白血病、胃腸基質(zhì)瘤(GIST)、的治療，顯示出良好前景。當前第62頁\共有72頁\編于星期四\11點

ZD1839(Iressa，易瑞沙)

易瑞沙是一種低分子量的合成性苯胺喹唑啉，可逆轉(zhuǎn)的、選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，口服有效。可誘導細胞周期停滯、促進凋亡、抗血管生成。主要用于治療非小細胞性肺癌。采用單藥易瑞沙治療經(jīng)含鉑類化療失敗的晚期NSCLC的臨床Ⅱ期試驗結(jié)果顯示：女性和未吸煙者有更好的療效。當前第63頁\共有72頁\編于星期四\11點

抑制腫瘤血管生成的靶向治療血管生成對大多數(shù)實體瘤的生長擴張是至關重要的,一些特殊的細胞產(chǎn)物和因子可以促進血管的生成,抑制血管生成是控制腫瘤生長的一種重要的靶向治療方法?？寡苌伤幬锸怯筛鞣N不同作用機制組成的一大類藥物,可以破壞或抑制腫瘤的新生血管生成阻止腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移當前第64頁\共有72頁\編于星期四\11點腫瘤血管生成理論1971年,Dr.Folkman等提出可通過阻斷腫瘤血管的生成來抑制腫瘤的生長,防止腫瘤的轉(zhuǎn)移?；谀[瘤血管生成機理,抑制腫瘤血管生成的策略包括:利用小分子藥物和內(nèi)源性血管生成抑制因子直接抑制血管內(nèi)皮細胞增殖!遷移,抑制細胞外基質(zhì)形成,誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡;利用中和抗體、可溶性受體、受體拮抗劑阻斷血管生成因子傳遞;利用反義核酸或生物因子抑制血管生成促進因子表達。當前第65頁\共有72頁\編于星期四\11點腫瘤生長與血管生成機制(Folkman,J.Ann.Surg.,1972)

第一步：直徑大于1～2mm3的腫瘤釋放VEGF及招募bFGF因子啟動腫瘤血管生成步驟。

第二步：VEGF及bFGF刺激毛細血管內(nèi)皮細胞增殖及內(nèi)皮細胞遷移腫瘤，形成血管供給腫瘤所需營養(yǎng)物質(zhì)。

第三步：血管內(nèi)皮抑制素靶向毛細管內(nèi)皮細胞，抑制