北京培訓(xùn)中心兩蟲全流程

流程選擇回收率

當(dāng)前第1頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)兩蟲檢測全流程樣品預(yù)處理（SamplePretreatment）.染色鏡檢（StainingandMicroscopy）.免疫磁分離（IMS）.過濾.淘洗.離心.當(dāng)前第2頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（QC）10L

采樣量當(dāng)前第3頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾當(dāng)前第4頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

濾芯結(jié)構(gòu)過濾時(shí)水流流向淘洗時(shí)水流流向

79層多孔網(wǎng)狀泡沫層，兩種規(guī)格交互疊放，由790mm壓縮至30mm，螺栓固定。濾芯兩個(gè)過濾層：外層區(qū)域?yàn)槌鯙V器，內(nèi)層濾核為選擇性濾器（此結(jié)構(gòu)在提高污水樣品過濾速度的同時(shí)，保證有效地捕獲隱孢子蟲卵）。淘洗時(shí)，目標(biāo)微生物以反流的形式更方便地進(jìn)行有效淘洗?？商幚砀邼岫仍?。

取樣流速可達(dá)4L/min。當(dāng)前第5頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

實(shí)驗(yàn)室過濾當(dāng)前第6頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

現(xiàn)場過濾當(dāng)前第7頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

現(xiàn)場過濾——兩蟲移動(dòng)取樣箱當(dāng)前第8頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

濾器

濾芯

采樣管

水表

保溫袋

自封袋

現(xiàn)場過濾——兩蟲移動(dòng)取樣箱當(dāng)前第9頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾根據(jù)客戶需要合理設(shè)計(jì)的取樣箱。解決現(xiàn)場采樣問題，并使得現(xiàn)場采樣操作簡便。

解決部分無兩蟲檢測設(shè)備的送樣問題。

現(xiàn)場過濾——兩蟲移動(dòng)取樣箱當(dāng)前第10頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

現(xiàn)場過濾當(dāng)前第11頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——過濾

現(xiàn)場過濾當(dāng)前第12頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——淘洗Filta-MaxXpress兩蟲快速法淘洗設(shè)備穩(wěn)定的高回收率（大于70%）。淘洗時(shí)間90s，目前全球淘洗速度最快的設(shè)備。一鍵操作，操作簡單。

不同樣品的結(jié)果一致性高，性能穩(wěn)定。當(dāng)前第13頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)樣品預(yù)處理——離心離心機(jī)應(yīng)放在牢固的工作臺(tái)或地板上，盡量減少晃動(dòng)。離心管連同適配器一起配平，保證誤差在0.5g以內(nèi)，盡量減少擺動(dòng)。離心機(jī)設(shè)定2000g離心力，工作時(shí)間15分鐘。離心機(jī)應(yīng)選用無剎車系統(tǒng)的（自然停止大約需7分鐘）。

當(dāng)前第14頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合，形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，在外磁場中，復(fù)合物被吸附而滯留在磁場中，使其與其他物質(zhì)分離。

定義當(dāng)前第15頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離當(dāng)前第16頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離當(dāng)前第17頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離

試劑盒當(dāng)前第18頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離樣品量：沉淀混勻時(shí)間：1-2小時(shí)依次取下L型試管90°旋轉(zhuǎn)2分鐘棄上清1XbufferA沖洗磁珠180°旋轉(zhuǎn)1分鐘棄上清后酸化分離

實(shí)驗(yàn)流程當(dāng)前第19頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離

沉淀物體積對于沉淀量小于0.5mL的樣品，直接再懸浮成10mL.對于沉淀量大于0.5mL的樣品，按照上述公式，即每0.5mL沉淀懸浮成10mL。比如，2mL沉淀應(yīng)該懸浮成40mL，具體免疫磁分離過程可以取其中一分部進(jìn)行。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，20L原水的沉淀量一般1-2mL；100L處理水的沉淀量一般小于0.5mL。當(dāng)前第20頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)免疫磁分離

結(jié)果計(jì)算如出廠水檢測出3個(gè)隱孢子蟲，帶入共計(jì)進(jìn)行計(jì)算：Y=（3×10mL)/(10mL×100L)=0.03個(gè)/L如原水沉淀量2mL，懸浮成40mL，免疫磁分離取了其中10mL，檢出3個(gè)隱孢子蟲，帶入并計(jì)算：Y=（3×40mL)/(10mL×20L)=0.6個(gè)/L當(dāng)前第21頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢

染色試劑盒單克隆熒光抗體染色試劑復(fù)染液封固劑DAPI染色試劑陽參1倍洗脫緩沖液當(dāng)前第22頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢

異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)分子量為389.4，最大吸收光波長為490~495nm，最大發(fā)射光波長為525~530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加硫氰酸基團(tuán)得到的，硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實(shí)現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記。能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。儲(chǔ)存條件：4℃避光保存。當(dāng)前第23頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用與熒光顯微鏡觀測。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發(fā)。當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。能快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。使用過程中應(yīng)注意操作與拋棄的處理程序。當(dāng)前第24頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)濃度2mg/mL，用時(shí)需要5000倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。當(dāng)前第25頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢

鏡檢當(dāng)前第26頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢

兩蟲孢囊與卵囊特征——賈第蟲孢囊外形：卵形或橢圓形直徑：11-14um當(dāng)前第27頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢

兩蟲孢囊與卵囊特征——隱孢子蟲卵囊外形：類似球直徑：4-6um當(dāng)前第28頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢

兩蟲孢囊與卵囊特征蘋果綠外殼：充要條件大小和形狀當(dāng)前第29頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢FITC染色DAPI染色DIC觀察當(dāng)前第30頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢當(dāng)前第31頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢當(dāng)前第32頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)染色鏡檢當(dāng)前第33頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)如何提高回收率

采用商售PBS淘洗液試劑品牌貨號PBSSigmaP4417-50TABNaOHFluka38215-1EA-RHClFluka35335-1LTween20SigmaP7949-100ML當(dāng)前第34頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)如何提高回收率

采用商售HCL和NaOH試劑，或標(biāo)配所需酸堿當(dāng)前第35頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)如何提高回收率

對容器和管子進(jìn)行潤洗使用0.05%的吐溫20或者吐溫80，對于樣品接觸的所有容器都進(jìn)行潤洗，將潤洗的液體也加入樣品。當(dāng)前第36頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)如何提高回收率

離心后，謹(jǐn)慎去除上清液可采取虹吸，棄去上清。管子上插上槍頭，使得震動(dòng)最小。當(dāng)前第37頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)如何提高回收率

謹(jǐn)慎清洗玻片隱孢子蟲和賈第蟲可能在染色過程被沖走，為了避免此情況發(fā)生，請輕輕的移走玻片上的液體。當(dāng)前第38頁\共有39頁\編于星期六\1點(diǎn)如何提高回收率

玻片干燥過程可影響回收率IMS過程中的酸如果沒有有效中和可以破壞賈第蟲的孢囊外表，引起賈第蟲染色過程中的變化。這可以導(dǎo)致鏡檢過程中賈第蟲的漏檢?？?/p>