北中大中藥鑒定學實驗指導02選做實驗

PAGEPAGE32選做實驗2.1中藥的光譜鑒定2.1.1熒光鑒定內容提要本實驗采用熒光法對不同藥用部位的19種中藥進行品種鑒定。通過實驗掌握熒光鑒定中藥的基本理論、基本方法和基本技術。掌握常用中藥熒光鑒別的特征。原理熒光鑒定是利用中藥中所含的某些化學成分（通常具有共軛雙鍵體系和芳香環(huán)分子）在吸收自然光或紫外光后能發(fā)生熒光的性質，對中藥及其所含成分進行鑒定。本實驗主要是通過熒光定性分析以鑒定中藥的品種或質量。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器熒光分光光度計，紫外分析燈（365nm，254nm），試管，燒杯，吸管，漏斗，濾紙，廣口瓶，索氏提取器，超聲波提取器，離心機，粉碎機，天平，電爐子等。2)材料藥材：牛膝，川牛膝，黃連，秦艽，麥冬，蜈蚣，珍珠。粉末或飲片：板藍根，葛根，白芷，川芎，丹參，蘇木，厚樸，秦皮，木瓜，梔子，石韋，天麻。（2）試劑1%氨水，乙醚，乙醇，氫氧化鈉試液，鹽酸，氯仿，三氯化鋁試液，石油醚(60~90℃)。操作步驟（1）熒光檢查1）牛膝取牛膝斷面，置紫外光燈下觀察，顯黃色熒光；滴加1%氨水后，顯淡黃綠色熒光（川牛膝新鮮斷面置紫外光燈下顯淡綠色熒光，滴加1%氨水后，顯綠黃色熒光）。2）黃連取黃連藥材斷面置在紫外光燈下觀察，顯金黃色熒光，木質部尤為顯著。3）板藍根取板藍根水煎液，置紫外光燈下觀察，顯藍色熒光。4）葛根取葛根粉末少量在紫外光燈下觀察，顯亮藍色熒光。5）白芷取白芷粉末0.5g，加乙醚適量，冷浸，振搖，放置，取上清液2滴，點于濾紙上，置紫外光燈下觀察，顯黃綠色熒光。6）川芎取川芎橫切面置紫外光燈下觀察，顯亮淡紫色熒光，外皮顯暗棕色熒光。7）秦艽取秦艽藥材橫切面，置紫外光燈下觀察，顯黃白色或金黃色熒光。8）丹參取丹參粉末5g，加水50mL，煮沸15～20min，放冷，濾過，濾液置水浴上濃縮至黏稠狀，放冷后，加乙醇3～5mL使溶解，濾過，濾液作如下試驗：取濾液數滴，點于濾紙條上，干后，置紫外光燈下觀察，顯亮藍灰色熒光。將此紙條懸掛在氨水瓶中（不接觸液面），20min后取出，置紫外光燈（365nm）下觀察，顯淡亮藍綠色熒光。9）麥冬取麥冬切片置紫外光燈下觀察，顯淺藍色熒光。10）蘇木取蘇木粉末10g，置帶塞試管中，加水50mL，密塞，反復振搖并放置4h，濾過，濾液顯橘紅色，置紫外光燈下觀察，顯黃綠色熒光。取濾液加氫氧化鈉試液2滴，顯猩紅色，置紫外光燈下觀察，顯藍色熒光，再加鹽酸使成酸性后，溶液變?yōu)槌壬米贤夤鉄粝掠^察，顯黃綠色熒光。11）厚樸取厚樸粗粉3g，加氯仿30mL，回流30min，濾過。取濾液，在紫外光燈下，頂面觀顯紫色，側面觀顯二層，上層黃綠色，下層黃綠色熒光。12）秦皮取秦皮少許浸入水或乙醇中，浸出液在日光下可見碧藍色熒光。13）木瓜取木瓜粉末1g，加70%乙醇10mL，回流1h，濾過，取濾液備用。取濾液滴于濾紙上，待干，噴三氯化鋁試液，干燥后，置紫外光燈下觀察，顯藍色熒光。14）梔子取梔子粉末0.2g，加水5mL，水浴加熱3min，取上清液滴于濾紙上，揮干，置紫外光燈下觀察，顯天藍色熒光。15）石韋取石韋粉末2g，加95%乙醇溶液20mL回流提取30min，取濾液加蒸餾水6mL，再加石油醚(60~90℃)20mL抽提，分取乙醇層，在水浴上蒸干，殘渣加95%乙醇溶液8mL溶解，取溶液滴于濾紙上，干后置紫外光燈下觀察。廬山石韋顯黃色熒光，石韋與有柄石韋均顯藍色熒光。16）蜈蚣取蜈蚣水浸液在紫外光燈（254nm）下觀察，呈現亮綠色熒光。17）珍珠取珍珠橫剖面置熒光燈下觀察，天然珍珠顯淺藍色熒光，養(yǎng)殖珍珠顯亮黃綠色熒光，通常環(huán)周部分較明亮。（2）熒光光譜取天麻粉末38mg，置具塞試管中，加乙醇10mL，密塞，超聲波提取60min，離心，取上清液作為供試品溶液。選擇激發(fā)波長λex(max)254nm，用熒光分光光度計測定。供試品在302nm和592nm波長處有特征峰。要點及難點解答（1）必須指出，并不是所有的中藥或其成分都有發(fā)生熒光的性質。有些中藥本身不發(fā)生熒光，但若用酸、堿或熒光染色處理后，就可能使某些成分在紫外光線下變?yōu)榭梢娚?。有的中藥附有地衣或有多量霉菌生長，也可能有熒光出現，因此熒光鑒定還可用于檢查某些中藥的變質情況。此外，在色譜分析應用上，也可能使吸附在吸附柱上、紙條上及薄層板上的各種成分產生熒光色譜。（2）中藥熒光檢查所用的紫外分析燈，在沒有特殊注明的情況下，波長均為365nm。（3）熒光鑒定法靈敏度高，能夠測定出10－4~10－9mol/L濃度的熒光物質。（4）熒光鑒定中藥有直接熒光法和間接熒光法兩種類型，直接熒光法是根據中藥本身所含物質產生熒光的特性直接觀察或測定；間接熒光發(fā)是利用具有高靈敏度的熒光試劑使無熒光或熒光很弱的中藥產生熒光載測定，或通過化學反應使中藥中的化學成分產生熒光基團再進行測定。習題與作業(yè)（1）習題1）用熒光法鑒定中藥的原理與基本方法。2）總結常用中藥熒光定性鑒定的主要特征。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果。2.1.2可見-紫外光譜鑒定內容提要本實驗采用可見-紫外光譜法對不同藥用部位的9種中藥進行品種或質量鑒定。通過實驗掌握可見-紫外光譜鑒定中藥的基本理論、基本方法和基本技術。掌握常用中藥可見-紫外光譜鑒別的特征。原理本方法是用分光光度計測定中藥中被測物質在紫外光區(qū)和可見光區(qū)特定的波長處或一定的波長范圍光的吸收度，對中藥進行定性或定量分析。（1）紫外光譜法是利用中藥中所含成分有不飽和結構及共軛雙鍵結構，在紫外光的照射下，能引起物質內部原子、分子、運動狀態(tài)的變化，消耗一部分能量后再透射出來，通過棱鏡或光柵分成按波長順序排列的吸收光譜，不同物質產生的紫外吸收光譜各不相同。由于不同中藥所含不飽和成分的差異，即根據光譜圖所提供的參數，如最大吸收波長、最小吸收波長、肩峰及吸收系數等作為鑒定的依據。（2）可見吸收度光譜法僅適用鑒定本身具有顏色或能與顯色劑作用呈現顏色的中藥及其化學成分。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器紫外分光光度計，硅膠干燥器，分析天平，錐形瓶，濾紙，漏斗，容量瓶（10mL，100mL，500mL），水浴鍋，3號垂熔玻璃漏斗，樣品篩，碘量瓶，分液漏斗，索氏提取器，粉碎機等。2)材料粉末或藥材：紅花，五味子，黃親，半夏，天麻，蟾酥，附子，血竭，赤芍。（2）試劑丙酮，無水乙醇，氯仿，甲醇，乙醇，乙醚，氨試液，0.25mol/L硫酸溶液等。操作步驟1）紅花黃色素吸收度測定：取本品置硅膠干燥器中干燥24h，研成細粉，精密稱取0.1g，置錐形瓶中，加水150mL，浸泡1h，時時振搖，用濾紙濾過，濾液置500mL量瓶中，用水分數次洗滌濾紙上的殘渣至洗液無色，加水至刻度，搖勻，用分光光度法在401nm的波長處測吸收度，不得低于0.40。紅色素吸收度測定：取上述細粉約0.25g，精密稱定，置錐形瓶中，加80%丙酮溶液50mL，置50℃水浴上溫浸90min，放冷，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，收集濾液于100mL量瓶中，用80%丙酮溶液25mL分次洗滌，洗液并入量瓶中，加80%丙酮溶液至刻度，搖勻，用分光光度法測定在518nm的波長處測吸收度，不得低于0.20。2）五味子稱取本品粉末（陰干，水分10%~15%，過20~40目篩）2份，每份約1g，分置于碘量瓶中，各加水、無水乙醇20.0mL，室溫浸泡2h，振搖，濾過，作為供試品溶液。先將供試品溶液上機掃描測試，吸收度上限超過3.0時，應將供試品溶液用相同溶劑稀釋至吸收度上限不超過3.0。水溶液在285.0nm、208.5nm處有最大吸收，無水乙醇溶液在285.0nm、240.0nm處有最大吸收。3）蟾酥取本品1%的氯仿提取液，蒸干后用甲醇溶解，測定其紫外光譜，在波長300nm附近有最大吸收。4）黃芩取本品粉末0.2g，加乙醇5mL，浸漬24h，濾過。取濾液，用乙醇稀釋為1mg/mL的溶液，以乙醇為空白，用紫外分光光度計測定，于278nm、219nm、320±1nm處有吸收峰。5）半夏取本品粉末0.2g，加乙醇20mL，放置12h，濾過，濾液供測試用。樣品在212±3nm、220±2nm處有最大吸收。6）附子取黑順片或白附片粗粉4g，加乙醚30mL與氨試液5mL，振搖20min，濾過。濾液置分液漏斗中，加0.25mol/L硫酸液20mL，振搖提取，分取酸液測定其紫外光譜，在231nm與274nm波長處有最大吸收。7）天麻取本品粉末0.2g，加乙醇10mL，加熱回流1h，濾過。取濾液1mL，置10mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，用分光光度法測定，在270nm的波長處有最大吸收或出現1個肩峰。8）血竭取本品粉末30.0mg，精密稱量，置50mL量瓶中，加乙醇適量，浸泡10min后用力振搖20min使溶解，加乙醇至刻度，搖勻，置1cm石英吸收池中，以同批乙醇作空白，照紫外分光光度法測定，在270±1nm處有最大吸收。9）赤芍取本品粉末0.2g，加乙醇20mL，放置12h，濾過，濾液用乙醇稀釋，制成1mg/mL溶液，測定其紫外吸收光譜,本品在277±2nm波長處有最大吸收。要點及難點解答（1）中藥的紫外吸收光譜是多種成分特征吸收光譜疊加而成的，在一定的條件下，中藥多成分的復雜組合也有一定的規(guī)律性，從而在紫外疊加光譜上顯示出一定的特異性和穩(wěn)定性。（2）分光光度計紫外光區(qū)的波長范圍200~400nm；可見光區(qū)的波長范圍400~760nm。（3）測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近必須符合下列要求：溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內不得超過0.40；在241~250nm范圍內不得超過0.20；在251~300nm范圍內不得超過0.10；在300nm以上不得超過0.05。習題與作業(yè)（1）習題1）用可見-紫外光譜法鑒定中藥的原理與基本方法。2）總結常用中藥的紫外光譜定性鑒定的主要特征。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄實驗結果。2.1.3紅外光譜鑒定內容提要本實驗采用紅外光譜法對不同藥用部位的6種中藥進行品種或質量鑒定。通過實驗掌握紅外光譜鑒定中藥的基本理論、基本方法和基本技術。掌握常用中藥紅外光譜鑒別的特征。原理紅外光譜法是以紅外區(qū)域電磁波連續(xù)光譜作為輻射源照射供試品，記錄供試品吸收曲線的一種物理光學分析方法。中藥的紅外光譜鑒定是通過測定其粉末、提取物或化學單體的紅外吸收曲線反映中藥所含各組分官能團的差異，以鑒別中藥的品種和質量，主要用于中藥的定性鑒別。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器紅外分光光度計，樣品篩，試管，燒杯，容量瓶（5mL），供試品瓶，粉碎機等。2)材料粉末：黃芩，赤芍，血竭（進口血竭）達馬膠，松香，全蝎，蟬蛻，天麻。（2）試劑溴化鉀，乙醚，50%乙醇等。操作步驟1）黃芩取本品粉末，采用溴化鉀壓片法測其紅外光譜。本品在2927cm-1、1614cm-1、1027cm-1有特征峰，在1451cm-1、1360cm-1、1247cm-1處有3個小峰并列出現。2）赤芍取本品粉末（過200目篩），采用溴化鉀壓片法測其紅外光譜，本品在2930cm-1、1622cm-1、1050cm-1、1317cm-1、781cm-1處有特征峰(圖8-43)。3）血竭取進口血竭乙醚提取物測定其紅外光譜，特征吸收峰是1120cm-1、1610cm-1（摻假物達馬膠的紅外吸收峰是1380cm-1、1460cm-1、1707cm-1，以1707cm-1為特征吸收峰；松香的特征吸收峰主要是1692cm-1、1280cm-1）。4）全蝎取本品粉末，采用溴化鉀壓片法測其紅外光譜，本品在2925cm-1、2854cm-1、1658cm-1、1536cm-1、1240cm-1、1745cm-1處有特征峰。5）蟬蛻取本品粉末，采用溴化鉀壓片法測其紅外光譜，本品在2962cm-1、2930cm-1、1656cm-1、1546cm-1、1259cm-1、1031cm-1處有特征峰。6）天麻取本品粉末2μg，采用溴化鉀壓片法測其紅外光譜，供試品在1700～1600cm-1有1個中強的寬吸收，峰位為1645cm-1?；蛉”酒?0%乙醇浸出物(10.0mg/2.0mL)，供試品在1510cm-1處有1明顯的、尖銳的吸收峰，在1235cm-1處有1個明顯的寬吸收峰。要點及難點解答（1）用紅外光譜法鑒定中藥，實質上就是解析紅外光譜或與標準光譜進行對照，從紅外光譜所提供的信息來確定未知中藥的種類及其性質。紅外光譜法主要用于中藥的定性鑒定，在定性分析中，應選用適宜的樣品處理方法及測量條件，以便與標準光譜進行對照。（2）紅外區(qū)的波長范圍是0.76～500μm，在可見光與微波之間，習慣上按紅外線的波長將紅外波譜分成3個區(qū)段，即近紅外區(qū)、中紅外區(qū)和遠紅外區(qū)，其中紅外區(qū)是應用最廣泛的區(qū)段。進行紅外光譜分析時，首先應根據對象不同，采用各種分離手段，保證被測樣品的純度。供試品制備可根據物態(tài)的不同采用不同的方法進行，如液體樣品采用液膜法和溶液法；固體樣品采用壓片法、糊劑法、薄膜法、溶液法；氣體樣品純化后可直接用氣體池進行測定。（3）采用紅外光譜法鑒定生物類中藥，一般應固定供試品的條件，如品種、產地、商品規(guī)格或加工方法等。（4）供試品的粉末均過200目篩。習題與作業(yè)（1）習題1）用紅外光譜法鑒定中藥的原理與基本方法。2）總結常用中藥的紅外光譜定性鑒定的主要特征。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果。2.2中藥的電泳鑒定內容提要本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）法對苦杏仁等7種中藥的進行品種或質量鑒定。通過實驗掌握電泳鑒定中藥的基本理論、基本方法和基本技術。掌握常用中藥電泳鑒別的特征。原理電泳是一種分離和鑒定混合物中帶電離子的技術。本實驗是利用中藥含有蛋白質帶電荷的成分，在同一電場作用下，由于各組分所帶電荷的性質、電荷數目以及分子質量不同，而泳動方向和速度不同，在一定時間內，各成分的泳動率不同，結合譜帶數和染色不同達到鑒定的目的。聚丙烯酰胺凝膠電泳是由丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，并以此為支持物的電泳技術。在電泳開始階段，由于連續(xù)pH梯度作用，將供試品壓縮成1條狹窄的區(qū)帶（濃縮效應），再加上整個電泳過程中存在的分子篩效應和電荷效應，從而提高供試品的分離效果。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器SCR-穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀或CYY-Ⅲ穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，ZVS-100型垂直板電泳槽，恒溫培養(yǎng)箱，離心機，分析天平，扭力天平，真空干燥器，微量進樣器，燒杯（100mL，500mL，1000mL），量筒（10mL，100mL，1000mL），刻度吸管（1mL，2mL，10mL），試管，離心管，大培養(yǎng)皿，玻璃注射器（5mL，10mL，20mL），剪刀，鑷子，研缽，濾紙，粉碎機等。2)材料藥材或粉末：苦杏仁，桃仁，蘄蛇，烏梢蛇，金錢白花蛇，小茴香，蒔蘿子。（2）試劑分離膠緩沖液，分離膠貯液，濃縮膠緩沖液，濃縮膠貯液，電極緩沖液，40%蔗糖溶液，過硫酸銨溶液，四甲基乙二胺，溴酚藍指示劑，考馬斯亮藍染色液，脫色液等。操作步驟（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本方法1）供試品液的制備取純凈的供試品約1g，加入稀釋4倍的濃縮膠緩沖液（或電極緩沖液、稀醇液等）0.5~1mL，研磨成勻漿，3500rpm離心15min，取上清液加等體積的40%蔗糖溶液[3]，4℃保存，供點樣用。2）電泳槽的安裝垂直板電泳槽的式樣很多，目前流行的是用有機玻璃做的由兩個半槽組成的方形或長方形電泳槽。兩半槽之間夾著凝膠模子，模子的兩側形成正負2個槽，供裝電極緩沖液用。凝膠模子由兩塊玻璃裝入1個塑料或硅酮橡膠的夾套內構成。玻璃板先用熱的去污劑輕輕擦洗或用洗液浸泡，然后用水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗，直立干燥，禁止用手接觸潔凈的玻璃板面。手持玻璃板兩邊，將兩塊玻璃板裝入夾套內，然后垂直地放入兩半槽之間，長螺桿固定。上螺絲時，要按順序逐步擰緊，均勻用力。電泳槽裝好后，將瓊脂熔化，放冷后注入正極槽的小池內，使在凝膠模子的下部凝結成約5mm厚的瓊脂層。3）分離膠與濃縮膠的制備將分離膠緩沖液、分離膠貯液、過硫酸銨溶液、蒸餾水按1∶2∶1∶4的比例（V/V）混合，配成分離膠液16mL；將濃縮膠緩沖液、濃縮膠貯液、過硫酸銨溶液、40%蔗糖溶液按1∶2∶1∶4的比例（V/V）混合，配成濃縮膠液4mL。將配好的兩種膠液及20~50mL新鮮蒸餾水置真空干燥器內抽氣20min。分離膠液中加入四甲基乙二胺30μL，混勻，立即緩緩注入已安裝好的凝膠模子中，注意防止氣泡。分離膠液上覆蓋約3mm后的蒸餾水，靜置1h以上，待分離膠與水層間界面清晰時，用濾紙條小心吸凈水層。插上電泳槽模板，使其底部距分離膠上層約1cm。向濃縮膠液中加入四甲基乙二胺15μL，混勻后注入凝膠模子中，靜置30min，濃縮膠變?yōu)槿榘咨?，垂直向上小心取出電泳槽模板。向正負電極槽內加入電極緩沖液共約800mL，兩槽內液面介于高低玻璃板之間。4）點樣用微量進樣器吸取供試品溶液20~40μL，注入電泳槽底部即可。5）電泳將正負極電泳槽分別與電泳儀的正負極相連，在負極槽電極緩沖液中加溴酚藍指示劑1~2滴，打開電源，開始電泳。電泳采用穩(wěn)流控制，開始時電流15mA，當樣品進入分離膠后，電流25mA。為防止溫度過高，可將電泳槽放在冰箱內。當溴酚藍前沿行至距瓊脂層約1cm時，停止電泳，整個過程約需3h。6）染色與保存打開電泳槽，取出膠板，標記前沿。將凝膠板浸于考馬斯亮藍R250染色液內，37℃染色1h。染色后用蒸餾水沖去凝膠表面附著的染料，再用脫色液脫色。經常更換脫色液，直到背景清晰為止。凝膠板可放入脫色液中長期保存。（2）常用中藥的電泳鑒定1）苦杏仁及桃仁供試品溶液的制備：分取供試品粉末各約1.0g，分別加入25%濃縮膠緩沖液1mL，超聲提取30min，3500rpm離心20min，吸取上清液，加入40%蔗糖溶液（1∶1），混勻。電泳方法：吸取上述2種溶液各20μL，分別點樣于同一聚丙烯酰胺凝膠膠片上，用溴酚藍示蹤，電泳（初始電流15mA，穩(wěn)流25mA），取出膠片，用考馬斯亮藍R250溶液染色，脫色至譜帶清晰。結果：苦杏仁有3個特征性主譜帶，與桃仁有明顯的區(qū)別。2）蘄蛇、烏梢蛇及金錢白花蛇供試品溶液的制備：分取供試品粉末各約1.0g，加入生理鹽水4mL，研磨成勻漿，離心15min（4000r/min），取上清液，加入1倍量丙酮，離心15min（4000r/min），加入1/2體積的40%蔗糖液，備用。電泳方法：吸取上述溶液各20L，分別點樣于同一聚丙烯酰胺凝膠膠片上，用溴酚藍示蹤。電泳（分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為2.5%；初始電流10mA，穩(wěn)流15mA）取出膠片，放入7%醋酸溶液中固定10min，用0.2%考馬斯亮藍R250染色30min，取出，用蒸餾水洗，再放入含20%甲醇和7%醋酸的脫色液中，脫色30min。結果：蘄蛇有7條譜帶，一級帶2條、二級帶3條、三級帶2條。烏梢蛇有一級帶3條，二級帶和三級帶各2條，擴散帶1條。金錢白花蛇有一級帶2條，二級帶4條，三級帶2條。3）小茴香供試品溶液的制備：取小茴香粉末約1.0g，加入25%濃縮膠緩沖液1mL，超聲提取30min，離心20min（3500r/min），吸取上清液，加入40%蔗糖溶液（1∶1），混勻備用。易混藥材供試溶液的制備：取蒔蘿子同上法制備。電泳方法：吸取上述2種溶液各20μL，分別點樣于同一聚丙烯酰胺凝膠膠片上，用溴酚藍示蹤，電泳（初始電流15mA，穩(wěn)流25mA），取出膠片，用考馬斯亮藍R250溶液染色，脫色至譜帶清晰。結果：供試品與易混品比較，具有4個特征性譜帶。要點及難點解答（1）經高溫或炮制處理的藥材，很可能會因蛋白質的失活而難以得到理想的電泳圖譜。（2）新配制的過硫酸銨溶液在4℃下可保存1周。（3）加蔗糖溶液增加提取液的密度，以便于樣品液沉于樣品槽底部。（4）瓊脂層既可導電，又具有密封作用。（5）一定要將水層徹底除去，且注意不能破壞分離膠的水平表面。習題與作業(yè)（1）習題1）用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定中藥的實驗步驟與方法。2）常用中藥電泳鑒定的主要特征。（2）作業(yè)記錄實驗結果并進行分析，繪制各供試品的電泳圖譜。2.3鹿茸的特異PCR鑒定內容提要本實驗采用中藥基因鑒定法中的特異PCR分析原理與技術，對鹿茸的品種或質量進行鑒定。通過實驗了解生物鑒定法的基本理論、基本方法和基本技術。掌握鹿茸不同品種的特異PCR鑒定特征和基本方法。原理1985美國科學家K.Mullis及同事發(fā)明的聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，簡稱PCR）技術使人們可以在體外輕易地大規(guī)模擴增DNA的片段。該技術因此而獲得了1993年的諾貝爾獎。其原理是在試管中以極少量樣品DNA作模板，在一對引物的引導下，通過DNA聚合酶的作用和高溫變性、適溫復性和延伸的循環(huán)往復，在1~2h之內將DNA片段合成上百萬倍。將不同待測藥材的DNA片段擴增出來比較其異同，就可以地明確無誤地鑒定藥材的分類歸屬。基因是物種進化的基礎，每種基因在生物一生中都承擔其相應的功能，因而，基因的序列是比較保守的，往往某個基因會在種上表現出變異或進化的特征，特異PCR鑒定就是根據這一特點，先對某物種種上群體的特定基因進行序列比對研究，找出序列差異。然后設計出能特異性的鑒別某個物種的特異引物對，并以此引物對來鑒定供試品。本實驗以不同品種鹿茸為材料分別提取的DNA，并以此作為PCR擴增待檢模板，用已制備的馬鹿茸特異引物對供試品模板進行PCR擴增，擴增結果具有特異性。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器PCR基因擴增儀，潛水式凝膠電泳儀，紫外光燈，乳缽，微量進樣器，離心機，分析天平，扭力天平，燒杯，量筒，三角瓶，刻度吸管（1mL，2mL，10mL），試管，離心管，培養(yǎng)皿，濾紙等。2)材料馬鹿茸，花鹿茸。任選其他鹿茸DNA。（2）試劑Taq酶(0.9U)，10mM/LdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP），50mM/L馬鹿特異PCR引物對（primer1：5′GTTATGTAAACAAGACTGTTCGCCAGAGTACTACCGGC3′,primer2：5′TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT3′），1.4％瓊脂糖，溴化乙錠（EB），25mM/LMgCl2，10×Buffer（緩沖溶液），ddH2O，液氮，1×TAE電泳緩沖液等。操作步驟（1）模板的制備取馬鹿茸約0.3g，用刀片刮去表面層，無菌水清洗若干次，晾干，置潔凈的乳缽內，加液氮研磨至細粉末，移入10mL的離心管中，用SDS(十二烷基硫酸鈉)法提取DNA，作為供試品模板。同法制備梅花鹿茸的DNA，作為對比品模板。（2）引物的選擇馬鹿茸的特異PCR引物對。（3）PCR擴增反應體系50uL反應體系（表），實驗設1個DNA空白對照。表PCR擴增反應體系

1個反應n個反應10×Buffer5uL×nMgCl23uL×ndNTP1uL×nprimer1/primer2各0.2uL×nDNA2uL(約30ng)×nTaq酶0.3uL×nddH2O38.3uL×n（4）PCR擴增設DNA空白對照（ck），用同樣的引物和PCR條件進行擴增反應。擴增程序：預變性94℃6min，７２℃４min；35個循環(huán)，其中94℃40s，65℃1min，72℃1min；后延伸72℃6min。４℃保存。（5）電泳取擴增產物10μL，用DNA相對分子量標準（200~2000bp）參照，走瓊脂糖凝膠電泳（1.4%的瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液），EB染色，置紫外光燈（365nm）下觀察、拍照。（6）結果分析要點及難點解答（1）PCR是一種體外擴增特定基因或DNA序列的方法，其特異性是由人工合成的引物序列所決定。雙鏈DNA分子在臨近水沸點的溫度下便會分離成兩條單鏈DNA分子（變性）；又在適當的溫度條件下，兩引物分別與DNA的兩條單鏈特異復性；在鏈式聚合酶與４種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在及合適溫度條件下，引物便按5’→3’方向復制互補DNA（延伸）。這種變性→復性→延伸的過程為一個PCR循環(huán)，一個循環(huán)使目的摸板增加1倍，下一個循環(huán)又以上一次的擴增產物作摸板，因而，PCR擴增是以2n方式擴增。理論上講，經過３０個循環(huán)反應，DNA擴增量106～109倍。（2）本方法可用于含有鹿茸中成藥中原料藥的品種鑒定和質量控制。（3）PCR基因擴增的最大優(yōu)點是操作簡單、結果可靠。（4）本實驗結果與不同來源的鹿茸比較，馬鹿茸在約350bp處應有1條特征性擴增譜帶。（5）PCR擴增十分靈敏，摸板和試劑污染、實驗條件的改變都會影響PCR擴增的特異性，因而造成無擴增或擴增產物不能成帶等現象。影響實驗結果的主要因素有不同生產公司或同一公司不同批號的Taq酶、引物的濃度、退火溫度等。習題與作業(yè)習題1）特異PCR鑒定中藥的原理、基本步驟和方法。2）

影響PCR擴增特異性的主要因素及其解決辦法。3）生物鑒定法在中藥鑒定中的應用范圍及實用價值。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄并分析實驗結果。2.4中藥的常規(guī)檢測2.4.1水分測定內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，測定中藥水分，以控制其質量。通過實驗熟悉中藥水分測定的常用方法和適應對象。原理中藥中含有過量的水分，不僅易霉爛變質或使有效成分分解，還會使應用稱量上相對地減少了實際用量而不能達到治療目的。中藥的水分測定法主要有下列4種方法。（1）烘干法烘干法又稱“干燥失重法”，是指供試品在規(guī)定的條件下通過干燥，根據供試品減失的重量，計算供試品中含水量。減失的重量主要指水分，也包括其他揮發(fā)性物質。（2）甲苯法是將供試品與水不相溶的有效溶劑（如二甲苯、甲苯等）相混合，利用蒸餾的方法使供試品的水分隨甲苯蒸氣蒸餾出來，經冷卻后甲苯和水互相分離，直接讀取供試品的水分含量。（3）減壓干燥法是將供試品置于減壓干燥器內，用新鮮五氧化二磷作為干燥劑吸收供試品的水分，減壓干燥（減壓至2.67kPa以下持續(xù)30min，室溫放置24h）后，迅速精密稱定重量，計算供試品中的含水量。減壓干燥可降低干燥溫度和縮短干燥時間。（4）氣相色譜法用直徑為0.25～0.18mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球作為載體，柱溫為140～150℃，熱導檢測器檢測。用無水乙醇作溶劑，使供試品中的水分氣化后進入色譜柱得到分離。但色譜條件必須符合下列要求：即用水峰計算的理論板數應大于3000，用乙醇峰計算的理論板數應大于200；水和乙醇兩峰的分離度應大于2；將無水乙醇注樣5次，水峰面積的相對標準偏差不得大于2.0%。含水量的計算采用外標法。但無水乙醇作為溶劑，含水量約3%，需要扣除。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器分析天平，扁形稱量瓶，水分測定裝置，干燥箱，干燥器，電熱套，燒杯，試管，量筒，粉碎機，培養(yǎng)皿等。2)材料藥材：柴胡，肉桂。（2）試劑甲苯，亞甲藍等。操作步驟1）柴胡的水分測定（烘干法）取柴胡（或其他供試品）顆粒2～5g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱瓶中，厚度不超過5mm（疏松供試品不超過10mm）精密稱定，打開瓶蓋在100～150℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定重量，再在上述溫度下干燥1h，冷卻，稱重，至連續(xù)2次稱重的差異不超過5mg為止。根據減失的重量，計算含水量（%）。2）肉桂的水分測定（甲苯法）水分測定裝置的安裝：測定方法：取肉桂顆粒20g,，精密稱定，置A瓶中，加甲苯200mL和玻璃珠數粒，減壓干燥法和氣相色譜法的鑒定實例略。要點及難點解答（1）烘干法適用于不含或少含揮發(fā)性成分中藥的水分測定。甲苯法適用于含揮發(fā)性成分中藥的水分測定。減壓干燥法適用于含有揮發(fā)性成分貴重中藥的水分測定。氣相色譜法適用于中藥化學單體及其制劑的水分測定。（2）測定用的供試品，一般先破碎成直徑不超過3mm的顆?；蛩槠?。直徑和長度在3mm以下的花類、種子類和果實類中藥，可不破碎。減壓干燥法所用的供試品必須是過24目篩的粉末。（3）用化學純甲苯直接測定，必要時甲苯可先加少量水，充分振搖后放置，將水層分離棄去，經蒸餾后使用。（4）柴胡的含水量不得過8.0%。肉桂的含水量不得過15.0%。習題與作業(yè)1）習題1）水分測定的主要方法及適應對象。2）柴胡和肉桂水分含量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄并分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.4.2灰分測定內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，測定中藥的灰分，以控制其純度和質量。通過實驗熟悉中藥灰分測定的常用的方法和適應對象。原理總灰分是將將中藥粉碎加熱，高溫熾灼至灰化，則細胞組織及其內含物種的無機物成為灰分而殘留。酸不溶性灰分是指總灰分加入稀鹽酸后的不溶性灰分，即主要是不溶于稀鹽酸的砂石、泥土等硅酸鹽類化合物。各種中藥的應在一定范圍以內，所測灰分數值高于正常范圍時，說明有其他無機物污染和摻雜。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器分析天平，坩堝，馬福爐，表面皿，濾紙，漏斗，水浴鍋，燒杯等。2)材料生地黃藥材。（2）試劑10%硝酸銨溶液，稀鹽酸。操作步驟（1）基本方法1）總灰分測定取生地黃粉末5g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量（準確至0.01g），緩緩熾灼，注意避免燃燒，至完全炭化時，逐漸升高溫度至500～600℃，使完全灰化并至恒重。計算殘渣的百分含量。2）酸不溶性灰分測定取生地黃的總灰分，在坩堝中加入稀鹽酸約10mL，用表面皿覆蓋坩堝，置水浴上加熱10min，表面皿用熱水5mL沖洗，洗液并入坩堝中，用無灰濾紙濾過，坩堝內的殘渣用水洗于濾紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應為止。濾渣連同濾紙移置同一坩堝中，干燥，熾灼至恒重。計算殘渣的百分含量。要點及難點解答（1）在測定灰分前，應將供試品預先粉碎，使能通過24目篩，混合均勻后依法測定。（2）總灰分的測定，如果炭分不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸銨溶液2mL，使殘渣濕潤，然后置水浴上蒸干，殘渣再熾灼，至坩堝內容物完全灰化。（3）每個供試品做3個平行樣。（4）生地黃的總灰分不得過6.0%，酸不溶性灰分不得過2.0%。習題與作業(yè)1）習題1）中藥灰分測定的主要方法與基本步驟。2）生地黃灰分含量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.4.3浸出物的含量測定內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，測定中藥浸出物的含量，以控制其質量。通過實驗熟悉中藥浸出物測定的常用的方法和適應對象。原理中藥中的某些成分在水、不同濃度的醇中，在一定的條件下其浸出物的含量大致有一定的范圍。本法適用于有效成分尚不清楚或有效成分尚無精確定量方法的中藥，測定其浸出物的含量，可初步衡量其質量優(yōu)劣。浸出物的含量是考察中藥質量的指標之一。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器分析天平，錐形瓶，蒸發(fā)皿，水浴鍋，干燥器，干燥箱，冷凝管，吸管，燒杯，試管，濾紙，漏斗等。2)材料粉末：生地黃，秦艽。（2）試劑乙醇。操作步驟1）生地黃水溶性浸出物的含量測定（冷浸法）取生地黃粉末約4g，稱定重量（準確至0.01g），置250～300mL的錐形瓶中，精密加入水50～100mL，密塞，冷浸，前6h內時時振搖，再靜置18h，用干燥的濾器迅速濾過，精密吸取濾液20mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干后，在105℃干燥3h，移置干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定重量，計算百分含量。2）秦艽醇溶性浸出物的含量測定取秦艽粉末約4g，稱定重量（準確至0.01g），置100～250mL的錐形燒瓶中，精密加入乙醇100mL，塞緊，稱定重量（準確至0.01g），靜置1h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，保持微沸1h。放冷后，取下燒瓶，塞緊，稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過。精密吸取濾液25mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，在105℃干燥3h，移置干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定重量，計算百分含量。要點及難點解答（1）在進行浸出物含量測定時，凡供浸出物測定用的供試品，均要預先破碎，使能通過24目篩，取樣時要混合均勻。（2）秦艽的醇溶性浸出物不得少于24.0%，生地黃的水溶性浸出物不得少于65.0%。（3）每個供試品應做3個平行樣。（4）浸出物干燥后易于吸潮，難以干燥置恒重，故規(guī)定為105℃干燥3h后1次稱量。習題與作業(yè)1）習題1）中藥浸出物含量測定的基本方法。2）生地黃、秦艽浸出物含量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.4.4揮發(fā)油的含量測定內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，測定中藥揮發(fā)油的含量，以控制其質量。通過實驗熟悉中藥揮發(fā)油含量測定的常用的方法和適應對象。原理利用中藥中所含揮發(fā)油成分能與水蒸氣同時蒸餾出來的性質，在特制的揮發(fā)油測定器中測定其含量。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器揮發(fā)油測定器，分析天平，燒杯，電熱套，冷凝管，圓底燒瓶，粉碎機等。2)材料小茴香藥材。（2）試劑二甲苯。操作步驟儀器裝置安裝（2）取小茴香粉末約50g，稱定重量（準確至0.01g），置燒瓶中，加水300～500mL與玻璃珠數粒，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸約5h，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩緩放出，至沿油層上端達0度線上面5mm處為止。放置1h以上，再啟開下端活塞使油層下降至其上端恰與0度線平齊。讀取揮發(fā)油的量，并計算百分含量。要點及難點解答（1）用于揮發(fā)油含量測定的供試品，一般必須粉碎使能通過24~50目篩。（2）本實驗方法適用于相對密度在1.0以下的揮發(fā)油測定。（3）相對密度在1.0以上的揮發(fā)油測定方法供試品取樣量同上法。取水約30mL與玻璃珠數粒，置燒瓶中，連接揮發(fā)油測定器。自測定器上端添加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再用移液管加入二甲苯1mL，然后連接回流冷凝管。將燒瓶內容物加熱至沸騰，并繼續(xù)蒸餾，其速度以保持冷凝管的中部呈冷卻狀態(tài)為度。30min后，停止加熱，放置15min以上，讀取二甲苯容積。然后按照上法進行測定。自油層量中減去二甲苯量，即為揮發(fā)油量，再改算成供試品中含有揮發(fā)油的百分含量。（4）供試品的取樣量應相當于揮發(fā)油0.5~1.0mL。（5）小茴香揮發(fā)油的含量不得低于1.5%(mL/g)。習題與作業(yè)（1）習題1）中藥中揮發(fā)油含量測定的基本步驟和方法。2）小茴香揮發(fā)油含量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.5中藥中有害物質的檢測2.5.1農藥殘留量的檢測內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，測定中藥有機氯農藥殘留量，以控制其質量和保證用藥的安全性。通過實驗熟悉中藥有機氯農藥殘留量測定的基本方法和步驟。原理用氣相色譜法將中藥殘留的有機氯農藥六六六（α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC）、滴滴涕（PP’-DDE，PP’-DDD，OP’-DDT，PP’-DDT）和五氯硝基苯（PCNB）9個組分進行分離，根據各組分的量(重量或在載氣中的濃度)與檢測的響應值(通常表現為峰面積)成正比的關系，采用外標法計算含量。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器氣相色譜儀，容量瓶（5mL,10mL,1000mL），錐形瓶，刻度濃縮瓶，分析天平，量筒，超聲提取器，離心機，旋轉蒸發(fā)器，微量進樣器，試管，燒杯等，粉碎機等。2)材料甘草藥材。對照品：α-BHC，β-BHC，γ-BHC，δ-BHC，PP’-DDE，PP’-DDD，OP’-DDT，PP’-DDT，PCNB。（2）試劑石油醚（60~90℃），丙酮，氯仿，二氯甲烷，無水硫酸鈉，硫酸等。操作步驟（1）對照品貯備液的制備（5）測定1）要點及難點解答（1）有機氯農藥殘留量的測定亦可用高效液相色譜法測定，如DDT可在18min內獲得分離。（2）有機氯農藥不溶于水，在有機溶劑中溶解度大，故處理樣品時常用苯、丙酮、氯仿、乙醚等提取。純化時選用柱色譜或溶液萃取以除去干擾雜質，根據需要選擇適當的洗脫液或萃取液。對于含油脂較多的樣品可在酸性或中性條件下采用水蒸氣蒸餾法，蒸餾液用苯或氯仿萃取，再純化，得供試品溶液。（3）供試品若為中藥，取樣量應相當于藥材的2g。習題與作業(yè)1）習題1）有機氯農藥殘留量檢測的基本步驟和方法。2）甘草中農藥殘留量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.5.2重金屬的檢查內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，對部分中藥中重金屬的含量進行檢測，以控制其質量和保證用藥的安全性。通過實驗熟悉中藥常見重金屬檢查的方法和限量要求。原理重金屬系指在實驗條件下能與硫代乙酰胺（或硫化鈉）作用顯色的金屬雜質。常見的重金屬離子Ag+、Pb2+、Bi3+、Cu2+、Sb3+、As3+、Sn2+、Ni2+、Cb2+、Zn2+、Hg2+等，在微酸性溶液中均能生成不溶性硫化物；而Hg2+、Pb2+、Bi3+、Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Cb2+、Zn2+等離子，在堿性溶液中均能生成不溶性硫化物。在一定量已知濃度的鉛鹽[Pb（NO3）2或Pb（Ac）2]溶液中，加入硫代乙酰胺（或硫化鈉）試液，將所得含PbS的有色膠體溶液和定量供試樣品溶液同法處理后所得的膠體溶液相比較，由二者色澤的深淺即可判斷供試樣品中重金屬的含量是否符合規(guī)定的標準。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器容量瓶（100mL，1000mL），納氏比色管，吸管，燒杯，分析天平，錐形瓶，量筒等。2)材料冰片（合成龍腦）藥材，微孔濾膜（孔徑3μm）。（2）試劑硝酸鉛，硝酸，醋酸鹽緩沖液（pH3.5），稀焦糖溶液，硫代乙酰胺試液，鹽酸，抗壞血酸等。操作步驟（1）標準鉛溶液的制備（2）供試品溶液的制備取冰片2g，加乙醇23mL溶解后，加稀醋酸2mL，備用。（3）測定方法要點及難點解答（1）中藥中重金屬的檢查可按現版藥典中的規(guī)定執(zhí)行。（2）冰片中重金屬的含量不得過百萬分之五。（3）供試品也可以選用阿膠、石膏、芒硝。（4）在測定中，習題與作業(yè)1）習題1）中藥中常見的重金屬及其檢測原理。2）冰片（合成龍腦）重金屬含量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.5.3砷鹽的檢查內容提要本實驗采用2000年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定的基本方法，對中藥中的砷鹽進行檢測，以控制其質量和保證用藥的安全性。通過實驗熟悉中藥砷鹽檢測的方法和限量要求。原理儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器砷鹽測定裝置（古蔡氏法使用得裝置），容量瓶（100mL，1000mL），水浴鍋，吸管，燒杯，分析天平，錐形瓶，量筒等。2)材料石膏藥材，醋酸鉛棉花。（2）試劑和試紙鹽酸，三氧化二砷，稀硫酸，20%氫氧化鈉，溴化汞試紙，碘化鉀試液，酸性氯化亞錫試液，鋅粒等。操作步驟（1）標準砷溶液的制備（2）供試品溶液的制備取石膏粉末1g，加鹽酸5mL，加水至23mL，加熱使溶解，放冷，備用。（3）測定儀器安裝要點及難點解答（1）供試品也可以選用芒硝、阿膠、注射用雙黃連。（2）醋酸鉛脫脂棉花（3）所用儀器和試液（4）習題與作業(yè)1）習題1）砷鹽的檢測原理和基本方法。2）石膏中砷鹽含量的限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.6大黃中蒽醌成分的含量測定—高效液相色譜法內容提要本實驗采用高效液相色譜法測定大黃中大黃素和大黃酚的含量，以控制其質量。通過實驗掌握高效液相色譜法用于中藥中蒽醌類成分含量測定的色譜條件和基本方法。原理高效液相色譜法將中藥中的被測組分進行分離，根據組分的量與檢測的響應值(通常表現為峰面積)成正比的關系，采用外標法計算含量。其定量分析的過程一般分為4個步驟：色譜分離過程、峰面積測量、計算、實驗數據的統(tǒng)計分析。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器高效液相色譜儀，微量進樣器，圓底燒瓶，冷凝管，超聲提取器，分液漏斗，分析天平，容量瓶（25mL，50mL，1000mL），水浴鍋，濾紙，漏斗，吸管，燒杯，分析天平，錐形瓶，粉碎機，樣品篩，量筒，試管等。2)材料大黃藥材。對照品：大黃素，大黃酚。（2）試劑甲醇，2.5mol/L硫酸溶液，氯仿，無水硫酸鈉，0.1%磷酸溶液等。操作步驟（1）對照品溶液的制備精密稱取大黃素、大黃酚對照品各5mg，分別置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取大黃素溶液1mL、大黃酚溶液2mL，分別置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻(大黃素每1mL中含4μg、大黃酚每1mL中含8μg)。（2）供試品溶液的制備取大黃粉末(過65目篩)約0.1g，精密稱定，置50mL錐形瓶中，精密加甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5mL，置50mL圓底燒瓶中，揮去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10mL，超聲處理5min，再加氯仿10mL，加熱回流1h，冷卻，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗滌容器，并入分液漏斗中，分取氯仿層，酸液用氯仿萃取2次，每次約8mL，合并氯仿液，以無水硫酸鈉脫水，氯仿液移置100mL錐形瓶中，揮去氯仿，殘渣精密加甲醇10mL，稱定重量，置水浴中微熱溶解殘渣，放冷后，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。（3）測定方法1）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠。流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）。檢測波長：254nm。理論板數：按大黃素峰計算應不低于1500。2）分別精密吸取上述2種對照品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀測定。（4）計算測定供試品的水分后計算。要點及難點解答（1）大黃按干燥品計算，含大黃素(C15H10O5)和大黃酚(C15H10O4)的總量不得少于0.50%。（2）大黃的水分測定用烘干法。測定方法參見實驗2.4.1水分測定。（3）所用的儀器為高效液相色譜儀，鑒定藥典收載的品種，色譜柱的填充劑和流動相的組分應按各該品種項下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠，用于正相色譜；化學鍵合固定相，根據鍵合的基因不同可用于反相或正相色譜，其中最常用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對色譜；離子交換填充劑，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升，除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫光吸收檢測器。習題與作業(yè)1）習題1）用高效液相色譜法測定中藥中蒽醌類成分的基本步驟和方法。2）大黃中主要化學成分及其含量限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.7紫草中羥基萘醌總色素的含量測定—可見分光光度法內容提要本實驗采用可見分光光度法測定紫草中羥基萘醌總色素的含量，以控制其質量。通過實驗掌握可見分光光度法用于中藥色素類成分含量測定的基本方法。原理可見分光光度法是通過比較中藥溶液顏色對光的吸收度，以鑒定其某種成分或組分含量的方法。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器可見-紫外分光光度計，分析天平，容量瓶（25mL，100mL），吸管（5mL），燒杯，量筒，試管，粉碎機，樣品篩，干燥箱等。2)材料紫草藥材。（2）試劑乙醇。操作步驟（1）供試品溶液的制備取紫草適量，于50℃干燥3h，粉碎，過50目篩。精密稱取約0.5g，置100mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，4h內時時振搖，濾過，棄去初濾液，精密吸取濾液5mL于25mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。（2）吸收度的測定用分光光度計在516nm波長處測定吸收度，記錄結果。（3）計算按左旋紫草素（C16H16O5）的吸收系數（E）為242計算含量。計算公式：A=ECL要點及難點解答（1）由于紫草生長年限、枯朽程度、皮部厚薄等多種原因，差異較大，故供試品取樣適量以50g左右為宜。（2）羥基萘醌色素類成分在乙醇中加熱回流易被破壞，所以采用室溫條件下浸出，浸出4h可達平衡。（3）紫草含羥基萘醌總色素以左旋紫草素（C16H16O5）計算，不得少于0.80%。

（4）紫草的有效成分為2位帶有側鏈的那昆色素類，其母核為紫草素，在植物體內通常以酯的形式存在。左旋紫草素及其酯類均能溶于乙醇呈穩(wěn)定的紅色。左旋紫草素乙醇溶液最大吸收波長在516nm，而紫草藥材的乙醇溶液最大吸收波長均值為520nm，與左旋紫草素略有偏移；左旋紫草素濃度在5~30μg/mL時與吸收度成現性關系。（5）實驗使用的乙醇，在沒有標明濃度的情況下，均為95%的乙醇。（6）吸收度測定時，要做重復實驗。（7）使用本法進行鑒定時，一般應取對照品同時操作，除另有規(guī)定外，本法所用的空白溶液系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入相應的同體積的同種試劑，并用同樣方法處理。）習題與作業(yè)（1）習題1）用可見分光光度法測定中藥中色素類成分的基本步驟和方法。2）紫草中主要化學成分及其含量限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.8大青葉中靛玉紅的含量測定—薄層掃描法內容提要本實驗采用薄層掃描法測定大青葉中靛玉紅的含量，以控制其質量。通過實驗掌握薄層掃描法用于中藥中生物堿類成分含量測定的基本方法。原理薄層掃描法系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中有吸收紫外光或可見光的斑點、或經激發(fā)后能發(fā)射出熒光的色譜斑點進行掃描，即用反射法或透射法測定光束的強度，將其積分數據與濃度作圖或用對照品比較，從而計算供試品中被測組分的含量。也可用數據處理機直接計算含量。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器薄層掃描儀，索氏提取器，水浴鍋，分析天平，硅膠G薄層板，微量進樣器，容量瓶（250mL），吸管，燒杯，量筒，試管，粉碎機，樣品篩等。2)材料大青葉藥材。對照品：靛玉紅。膠布。（2）試劑氯仿，苯，丙酮。操作步驟1）供試品溶液的制備取大青葉粗粉1g，精密稱定，置索氏提取器中,加氯仿100mL，加熱回流6h，提取液濃縮至適量，轉移置250mL量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻。2）對照品溶液的制備以靛玉紅為對照品，用氯仿制成1mL含0.07mg的溶液。3）薄層色譜吸取供試品溶液10μL或15μL，對照品溶液4μL與8μL，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，以苯-氯仿-丙酮(5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。4）測定方法在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，用薄層掃描法進行掃描。掃描波長：λS540nm，λR700nm。5）計算測量供試品和對照品的吸收度積分值，計算（測定供試品的水分后計算）。要點及難點解答（1）薄層掃描的檢測方法有吸收法(可見或紫外)和熒光法，測定方法有反射法和透射法，掃描方式有雙波長和單波長、鋸齒和線性掃描。各種供試品應選擇適當的色譜條件展開后才能得到最佳的效果。一般對有吸收的供試品，采用雙波長、鋸齒掃描、反射法；對能產生熒光的供試品，采用熒光法。（2）本方法用于中成藥復方制劑中化學成分的含量測定，可用相應的原中藥按需要組合作陰、陽對照，然后比較其薄層掃描圖譜或積分數據加以鑒別。（3）大青葉按干燥品計算，含靛玉紅（C16H10N2O2）不得少于0.080%。（4）大青葉的水分測定用烘干法。測定方法參見實驗2.4.1水分測定。習題與作業(yè)（1）習題1）用薄層掃描法測定中藥中生物堿類成分的基本步驟和方法。2）大青葉中主要化學成分及其含量限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.9淫羊藿中總黃酮的含量測定—紫外分光光度法內容提要本實驗采用紫外分光光度法測定淫羊藿中總黃酮的含量，以控制其質量。通過實驗掌握紫外分光光度法用于中藥中黃酮類成分含量測定的基本方法。原理應用紫外分光光度法進行定量分析的原理，乃以Lambert-Beer定律為基礎，即物質在一定波長處的吸收度與該物質的濃度之間呈線性關系。因此，只要選擇一確定的波長測定溶液的吸收度，便可根據公式A=ECL計算被測物質的濃度。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器紫外分光光度計，容量瓶（5mL，50mL），錐形瓶，超聲波提取器，分析天平，量筒，吸管，漏斗，濾紙，稱量紙，燒杯。2)材料淫羊藿葉藥材。對照品：淫羊藿苷。（2）試劑甲醇，稀乙醇。操作步驟（1）供試品溶液的制備取淫羊藿葉片粉末（過40目篩）約0.2g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20mL，密塞，稱定重量，超聲處理1h，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液0.5mL，置50mL量瓶中，加甲醇至刻度。（2）對照品溶液的制備取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1mL含10μg的溶液。（3）測定方法分別取供試品溶液和對照品溶液，以試劑為空白，用分光光度計在270nm波長處測定吸收度。（4）計算用比較法以干燥品計算（測定供試品的水分后計算）。要點及難點解答（1）紫外分光光度法不僅可對中藥中單一組分進行定量分析，同時也可測定其混合物中某組分的含量。主要方法有標準曲線法和比較法。（2）淫羊藿的水分測定用烘干法。測定方法參見實驗2.4.1水分測定。（3）淫羊藿葉按干燥品計算，含總黃酮以淫羊藿苷（C33H40O15）計算，不得少于5.0%。習題與作業(yè)（1）習題1）用紫外分光光度法測定中藥中黃酮類成分的基本步驟和方法。2）淫羊藿中主要化學成分及其含量限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.10斑蝥中斑蝥素的含量測定—氣相色譜法內容提要本實驗采用氣相色譜法測定斑蝥中斑蝥素的含量，以控制其質量。通過實驗掌握氣相色譜法用于中藥中易揮發(fā)性成分含量測定的基本方法。原理用氣相色譜法將中藥中被測組分進行分離，根據各組分的量(重量或在載氣中的濃度)與檢測的響應值(通常表現為峰面積)成正比的關系，采用外標法計算含量。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器氣相色譜儀，容量瓶（50mL），錐形瓶，濾紙，漏斗，量筒，試管，燒杯等。2)材料斑蝥藥材。對照品：斑蝥素。（2）試劑氯仿。操作步驟（1）對照品溶液的制備取斑蝥素適量，精密稱定，加氯仿制成1mL含1mg的溶液，即得（必要時可稀釋）。（2）供試品溶液的制備取斑蝥粗粉約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氯仿30mL，振搖15min，放置6h，濾過，濾液置50mL量瓶中，用氯仿洗滌殘渣與濾紙，洗液濾入同一量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻。（3）測定方法1）色譜條件固定液：甲基硅膠（SE-30）。涂布濃度：3.5%。柱溫：（175±10）℃。理論板數：按斑蝥素峰計算不低于2600。2）測定分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各2L，注入氣相色譜儀測定。（4）計算百分含量。要點及難點解答（1）用氣相色譜法測定斑蝥中的斑蝥素，提取操作簡便，斑蝥體內的脂肪和色素成分均不出峰，斑蝥素的峰與溶劑峰達到分離，而且峰形對稱，故可用峰面積法和峰高法計算含量。斑蝥素的保留時間約為3min，一般在5min后可繼續(xù)進樣。（2）氣相色譜法主要用于含揮分性成分的中藥鑒定。（3）斑蝥由于品種、產地和采收時間等原因，斑蝥素的含量差異較大，小斑蝥的平均含量較大斑蝥為高。斑蝥含斑蝥素（C10H12O4）不得少0.35%。（4）氣相色譜的分析方法分為峰面積測量法和計算法2大類。峰面積測量法主要包括峰高乘半峰寬法、峰高乘基線寬度法、峰高乘保留時間法、剪紙稱重法、積分儀測量法。計算法主要包括外標法、面積歸一化法、內標法和追加法。習題與作業(yè)（1）習題1）用氣相色譜法測定中藥中易揮發(fā)性成分的基本步驟和方法。2）斑蝥中主要化學成分及其含量限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.11朱砂中硫化汞的含量測定內容提要本實驗采用容量法測定朱砂中硫化汞的含量，以控制其質量。通過實驗掌握容量法用于礦物類中藥中物及成分含量測定的基本方法。原理在供試品中加硫酸-硝酸鉀溶液，分解硫化汞并生成硫酸汞、硫酸鉀和亞硝酸，加適量的高錳酸鉀除去亞硝酸后，再用硫酸亞鐵除去多余的高錳酸鉀。以Fe3＋離子為指示劑，用0.1mol/L硫氰酸銨滴定液滴定至淺紅色，根據消耗的0.1mol/L硫氰酸銨滴定液的量，計算朱砂中硫化汞的含量。即：在一定的條件下，Hg2＋與CNS－形成一種穩(wěn)定的化合物Hg2＋＋2CNS－→Hg(CNS)2，用Fe3＋作為指示劑，生成血紅色的Fe(CNS)2＋。Fe3＋＋3CNS－→Fe(CNS)3Fe(CNS)2＋＋CNS－血紅色儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器錐形瓶，分析天平，電爐子，滴定管，燒杯，吸管等。2)材料朱砂。（2）試劑硫酸鐵銨指示液，2%硫酸亞鐵溶液，1%高錳酸鉀溶液，硫酸，硝酸鉀，0.1mol/L硫氰酸銨滴定液。操作步驟（1）供試品溶液的制備取朱砂粉末約0.3g，精密稱定，置錐形瓶中，加硫酸10mL與硝酸鉀1.5g加熱使溶解，放冷。（2）測定方法取供試品溶液，加水50mL，加1%高錳酸鉀溶液至顯粉紅色，再滴加2%的硫酸亞鐵溶液至紅色消失后，加硫酸鐵銨指示液2mL，用0.1mol/L硫氰酸銨滴定液滴定。（3）計算按1mL0.1mol/L硫氰酸銨液等于11.63mg的硫化汞計算。要點及難點解答（1）本品含硫化汞（HgS）不得少于96.0%。（2）朱砂用水飛法研成細粉。（3）供試品中加硫酸-硝酸鉀溶液，反應過程如下：HgS＋4H2SO4＋8KNO3→HgSO4＋4K2SO4＋4NO2＋4H2O由于有亞硝酸的存在（2NO2＋2H2O→HNO3＋HNO2）,可將Hg2＋還原成Hg＋而使結果偏低故采用高錳酸鉀除去[2NO2－＋MnO4－＋4H＋→Mn(NO3)2＋2H2O]，過量的高錳酸鉀影響滴定，故用硫酸亞鐵除去（MnO4－＋Fe2＋＋8H＋→Mn2＋＋Fe3＋＋4H2O）。（4）由于Hg(CNS)2的離解度遠小于Hg(CNS)3的離解度，所以溶液中全部的Hg2＋生成Hg(CNS)2后，過量的CNS－即與Fe3＋作用生成血紅色的Fe(CNS)2＋以示終點。(5)供試品分解后的溶液用水稀釋的目的是由于滴定時，大量的Hg(CNS)2析出，對Hg2＋的吸附作用很顯著，同時析出沉淀、溶液揮發(fā)，終點不清晰，測定結果偏低。稀釋后可避免上述缺點。習題與作業(yè)（1）習題1）用容量法測定礦物藥無機成分的基本步驟和方法。2）朱砂中主要化學成分及其含量限定指標。（2）作業(yè)簡述實驗步驟，記錄和分析實驗結果，根據實驗結果確定供試品是否符合藥用標準。2.12未知粉末中藥的顯微鑒定內容提要本實驗采用顯微鑒定的原理與技術，觀察和描述未知粉末性中藥的顯微特征，以鑒定其品種。通過實驗掌握未知粉末性中藥顯微鑒定的原理與基本技術。原理顯微鑒定法就是利用顯微鏡、顯微技術及顯微化學方法等對中藥進行分析鑒定。在鑒定過程中，以采用顯微鏡觀察動、植物的組織構造、細胞形狀、內含物的特征以及礦物的光學特性等為主要內容，通過對顯微特征的觀察、描述和特征的分析以達到鑒定中藥品種或質量的目的。儀器、材料與試劑(1)儀器與材料1)儀器光學顯微鏡，目鏡測微尺，蓋玻片，載玻片，鑷子，解剖針等。2)材料單純未知藥材粉末；混合粉末（2~4種中藥）；粉末性中成藥粉末。（2）試劑水合氯醛溶液，間苯三酚溶液，鹽酸，乙醇，稀碘液，蘇丹Ⅲ試液，釕紅試液，稀甘油試液等。操作步驟（1）取樣按照規(guī)定的方法進行。（2）預試主要注意粉末的顏色、質地、氣、味，或水試、火試等特征。預示某種、某類或含有某種化學成分的藥材可能存在，為顯微鑒定做好準備工作。（3）粉末制片分別用水、水合氯醛溶液制片，或用間苯三酚和濃鹽酸、碘試液、蘇丹Ⅲ試液、釕紅試液等顯微化學試劑制片。（3）顯微特征觀察和描述在顯微鏡下觀察上述的顯微標本片，并對觀察到的顯微特征進行描述、記錄。（4）顯微特征的羅列將觀察到的顯微特征歸納整理，選定鑒定點，繪制主要的顯微特征圖。（5）分析鑒定結果結合預試和顯微特征觀察的結果，做出初步結論。（6）復核根據初步結論，重新制作粉末標本片進行核對，或做一些理化定性的實驗等，或與標準藥材相比較以確證結論的準確性，必要時也可以核對文獻。（7）結論寫出供試品粉末包括哪些藥材及其主要鑒別特征，并填寫鑒定報告。要點及難點解答（1）顯微特征的描述和鑒定點的選定是未知粉末顯微鑒定的關鍵。（2）進行顯微特征的描述和觀察時，要觀察一定量的供試品。（3）供試品由授課教師任選。（4）特殊性粉末的制片方法習題與作業(yè)（1）習題未知粉末中藥顯微鑒定的基本步驟和方法。（2）作業(yè)記錄和分析實驗結果并繪圖，寫出鑒定報告。2.13中藥質量標準的制訂2.13.1中藥材的質量標準的制訂內容提要本實驗根據文獻提供的有關資料，按照下列中藥材（含飲片）的質量標準規(guī)定的內容，模擬制定1種中藥材（含飲片）的質量標準通過實驗熟悉中藥材質量標準的基本內容。原理 中藥質量標準是對中藥質量及其檢驗方法所作的技術規(guī)定，用于指導中藥生產、經營、使用、檢驗和監(jiān)督管理，以保證藥品的安全性、有效性、穩(wěn)定性和可控性。中藥質量標準的制定是中藥研究中重要的組成部分，進行中藥的新藥研究，必須依據國家《新藥審批辦法》的要求制定臨床研究和生產使用的質量標準。中藥質量標準的制定必須具備3個條件，即：處方組成固定、原料來源和制備工藝穩(wěn)定。儀器、材料與試劑略。操作步驟選擇1種《中華人民共和國藥典》沒有收載的中藥材，根據文獻提供的有關資料，按照下列中藥材（含飲片）的質量標準規(guī)定的內容，制定其質量標準并附質量標準起草說明。（1）名稱包括中文名稱、漢語拼音、藥材拉丁名，按中藥命名原則要求制定。（2）來源來源包括原植（動、礦）物的科名、中文名、學名、藥用部位、采收季節(jié)和產地加工等，礦物藥包括礦物的類、族、礦石名或巖石名、主要成分及產地加工。中藥材均應固定其產地。1）基原需經有關單位鑒定，確定原植（動）物的科名、中文名及學名；礦物的中文名及拉丁名。2）藥用部位指植（動、礦）物經產地加工后可藥用的某一部分或全部。3）采收季節(jié)與產地加工是指能保證中藥材質量的最佳采收季節(jié)和