實(shí)驗(yàn)三的酶切

實(shí)驗(yàn)三的酶切第一頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。第二頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二限制性內(nèi)切酶酶分子識(shí)別位點(diǎn)切割位點(diǎn)限制作用是否需用ATPⅠ類三亞基雙功能酶二分非對(duì)稱至少在識(shí)別位點(diǎn)外1000bpYesⅡ類內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)

在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)無特異性NoⅢ類二亞基雙功能酶5-7

bp非對(duì)稱在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類第三頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二Ⅱ類限制性內(nèi)切酶

Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'

第四頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：玉米基因組DNA實(shí)驗(yàn)試劑：BamHI酶及其酶切緩沖液：購(gòu)買成品。SalI酶及其酶切緩沖液：購(gòu)買成品。瓊脂糖(Agarose)：進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。

第五頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)儀器恒溫水浴鍋第六頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，37℃水浴保溫2-3h電泳檢測(cè)EP管編號(hào)實(shí)驗(yàn)步驟反應(yīng)體系20μL酶液

DNA15μLBamHⅠ1μLSalⅠ1μL10×BufferT3μL第七頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)

限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μgDNA加1單位酶,消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。第八頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二電泳檢測(cè)示例第九頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μgDNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反應(yīng)。許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。市場(chǎng)銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影響。

第十頁(yè)，共十一頁(yè)，編輯于2023年，星期二思考題