熒光定量分析方法

熒光定量分析方法第一頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第二節(jié)熒光定量分析方法一熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系：由于熒光物質(zhì)是在吸收光能而被激發(fā)之后才發(fā)射熒光的，因此溶液的熒光強(qiáng)度與該溶液中熒光物質(zhì)吸收光能的程度以及熒光效率有關(guān)。溶液中熒光物質(zhì)被入射光(I0)激發(fā)后，可以在溶液的各個(gè)方向觀(guān)察熒光強(qiáng)度(F)。但由于激發(fā)光的一部分被透過(guò)，因此，在激發(fā)光的方向觀(guān)察熒光是不適宜的。一般是在與激發(fā)光源垂直的方向觀(guān)測(cè)。設(shè)溶液中熒光物質(zhì)濃度為C，液層厚度為L(zhǎng)。熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度，即：F∝(I0-I)第二頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三為常數(shù)，其值取決于熒光效率根據(jù)Beer定律（2）將(2)待人(1)，得即（3）（1）第四頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三根據(jù)，在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系；但當(dāng)ECl>0.05時(shí)，(3)式括號(hào)中第二項(xiàng)以后的數(shù)值就不能忽略，此時(shí)熒光強(qiáng)度與溶液濃度之間不呈線(xiàn)性關(guān)系。為熒光定量分析法的依據(jù)。若濃度C很小，ECl之值也很小，當(dāng)ECl≤0.05時(shí)，上式第二項(xiàng)以后的各項(xiàng)可以忽略。所以（4）第五頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三熒光分析法的靈敏度比紫外分光光度法高，是因?yàn)椋簾晒夥治龇ㄖ信c濃度相關(guān)的參數(shù)是熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度，測(cè)量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上檢測(cè)所發(fā)射光(熒光)的強(qiáng)度信號(hào)，測(cè)定的靈敏度取決于檢測(cè)器的靈敏度，可以通過(guò)增大檢測(cè)信號(hào)的放大倍數(shù)來(lái)提高靈敏度，使極微弱的熒光也能被檢測(cè)到，可以測(cè)定很稀的溶液；而在分光光度法中與濃度相關(guān)的參數(shù)是吸光度(A=lgI0/I)，是一個(gè)比值，如果增大檢測(cè)器的放大倍數(shù)，檢測(cè)到的入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度同時(shí)增大，比值仍然不變，對(duì)提高檢測(cè)靈敏度不起作用，所以，熒光分析法的靈敏度比紫外分光光度法高，一般要高2~3數(shù)量級(jí)。第六頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三二、定量分析方法1依據(jù)：熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系，在低濃度時(shí)二者成線(xiàn)性關(guān)系：F=KC2熒光定量分析方法：校正曲線(xiàn)法：配制空白溶液以及一系列濃度梯度的待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，試樣經(jīng)過(guò)相同的處理之后分別測(cè)定熒光強(qiáng)度：F0、Fs、Fx，然后作（Fs-F0）—C曲線(xiàn)，根據(jù)（Fx–F0)，從工作曲線(xiàn)上求得待測(cè)物的濃度（或含量）。

(2)比例法：如果熒光物質(zhì)溶液的工作曲線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn)，就可選擇其線(xiàn)性范圍，用直接比較法進(jìn)行測(cè)定：

Fs-F0

=KCs，F(xiàn)x-F0=KCx

第七頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三例題：1g谷物的制品試樣，用酸處理，分離出核黃素(VB2)及少量無(wú)關(guān)雜質(zhì)，加入少量KMnO4，將核黃素氧化，過(guò)量的KMnO4用H2O2除去。將此溶液移入50ml容量瓶中，稀釋至刻度。吸取25ml放入樣品池中以測(cè)量熒光強(qiáng)度（核黃素中常含有熒光的雜質(zhì)叫光化黃）。事先將熒光計(jì)用硫酸奎寧調(diào)整至刻度100處。測(cè)定得到氧化液的讀數(shù)為6.0格。加入少量的連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)，使氧化態(tài)核黃素（無(wú)熒光）重新轉(zhuǎn)化為核黃素，這時(shí)熒光計(jì)讀數(shù)為55格。在另一樣品池中重新加入24ml被氧化的核黃素溶液，以及1ml核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5μg/ml，這一溶液的讀數(shù)為92格，計(jì)算每克樣品中含核黃素的μg數(shù)？(課本P2307題)

第八頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三解：25ml氧化液：熒光讀數(shù)6.0格，相當(dāng)于空白背景；25ml測(cè)定液：熒光讀數(shù)55格，實(shí)際核黃素的熒光讀數(shù)為55-6.0=49格；24ml氧化液+1ml標(biāo)準(zhǔn)核黃素：熒光讀數(shù)92格；標(biāo)準(zhǔn)核黃素0.5μg/ml：熒光讀數(shù)92-6=86格；樣品溶液的濃度為：1g谷物配成50ml溶液，取25ml測(cè)定，故谷物中核黃素為：第九頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三第三節(jié)熒光分光光度計(jì)和熒光分析新技術(shù)一熒光分光光度計(jì)(fluorospectrophotometer):1主要部件：主要由四個(gè)部分組成即激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角2儀器的校正：靈敏度的校正：波長(zhǎng)校正：激發(fā)光譜和熒光光譜的校正：第十頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三二熒光分析新技術(shù)簡(jiǎn)介1激光熒光分析法2時(shí)間分辨熒光分析3同步熒光分析4膠束增敏熒光分析第十一頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三小結(jié)1.熒光(fluorescence)：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。2.磷光(phosphorescence)：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，經(jīng)過(guò)體系間跨越再通過(guò)振動(dòng)弛豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后再返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。3.分子熒光的產(chǎn)生：處于基態(tài)的分子，吸收紫外-可見(jiàn)光后，電子由基態(tài)→激發(fā)單重態(tài)，激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它通過(guò)輻射躍遷和無(wú)輻射躍遷等去活化過(guò)程釋放能量而迅速返回至基態(tài)。無(wú)論處于哪一個(gè)激發(fā)單重態(tài)，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫均可返回至第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)，所發(fā)射的光稱(chēng)為熒光。第十二頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三4.分子處于激發(fā)態(tài)后，去活化過(guò)程主要有以下六種方式：振動(dòng)弛豫(vibrationalrelexation)：內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換(internalconversion)：熒光發(fā)射：外部能量轉(zhuǎn)換(externalconversion)：體系間跨越(intersystemconversion)：磷光發(fā)射：第十三頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫熒光和磷光產(chǎn)生示意圖第十四頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三5.熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜：可用來(lái)鑒別熒光物質(zhì)，并作為選擇適當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)的依據(jù)。第十五頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三6.溶液熒光光譜的特征：（1）斯托克斯位移：熒光波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng)；（2）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)；（3）熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系。7.熒光壽命和熒光效率：是描述熒光物質(zhì)的重要發(fā)光參數(shù)。8.發(fā)射熒光的物質(zhì)應(yīng)具備的條件：（1）物質(zhì)必須有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收；（2）物質(zhì)必須具有一定的熒光效率。第十六頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三9.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系：（1）長(zhǎng)共軛分子具有π→π*躍遷的具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度；（2）剛性平面結(jié)構(gòu)分子具有較強(qiáng)的熒光效率；（3）共軛體系上的取代基對(duì)熒光光譜和熒光強(qiáng)度有很大影響。10.影響熒光強(qiáng)度的外部因素：（1）溫度；（2）溶劑；（3）pH；（4）熒光熄滅劑；（5）散射光：尤其是拉曼光第十七頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三11.熒光的定量分析方法：當(dāng)ECl≤0.05時(shí)12.比例定量法：或第十八頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三注意：1.熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大熒光波長(zhǎng)是鑒定物質(zhì)的依據(jù)，也是定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件；2.當(dāng)熒光物質(zhì)的激發(fā)光