一株產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌菌株的篩選和選育

一株產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌菌株的篩選和選育陳斌(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2009級(jí)生物工程(制藥))摘要：從南京地區(qū)的土壤中篩選到一株產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌菌株C-1。形態(tài)及生理生化特征測(cè)定結(jié)果表明，C-1菌株與芽孢桿菌屬(Bacillaceae)中的枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCohn)種的特征基本一致。測(cè)定了該菌株的16SrDNA序列并根據(jù)16SrDNA構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹；在系統(tǒng)發(fā)育樹中，C-1菌株與枯草芽孢桿菌形成一個(gè)類群，序列同源性為99%。因此將C-1菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。關(guān)鍵詞：淀粉酶，產(chǎn)酶，細(xì)菌，枯草芽孢桿菌提前提前24h平板菌種接液體試管活化，并接種一支斜面試管保藏。提前3h按0.5%接種量分別轉(zhuǎn)接如下五種液體芽孢桿菌是人類發(fā)現(xiàn)最早的細(xì)菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是現(xiàn)在大家熟悉的“枯草芽孢桿菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，現(xiàn)作為芽孢桿菌屬(Bacillaceae)的模式菌株［1］。從生物學(xué)特性來講，枯草芽孢桿菌具有典型的芽孢桿菌特征，其細(xì)胞呈直桿狀，大小(0.8-1.2)pmx(1.5-4.0)pm，單個(gè)，革蘭氏染色陽性，著色均勻，可產(chǎn)莢膜，運(yùn)動(dòng)(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于細(xì)胞寬，呈橢圓至圓柱狀；菌落粗糙，不透明，擴(kuò)張，污白色或微帶黃色；能液化明膠，胨化牛奶，還原硝酸鹽，水解淀粉，為典型好氧菌［2］。1997年，KunstF.等人首先完成了枯草芽孢桿菌的完整基因組序列測(cè)定，并將結(jié)果發(fā)表在《Nature》雜志上［3］。工業(yè)酶的生產(chǎn)是工業(yè)微生物發(fā)酵的重要組成部分。據(jù)來自BBC的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，2004年全球酶的交易額達(dá)到20.0億美元(15.3億歐元)，其中食品酶占29%，飼料酶占15%，一般的工業(yè)酶占56%。枯草芽孢桿菌是當(dāng)今工業(yè)酶生產(chǎn)應(yīng)用最廣泛的菌種之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的酶占整個(gè)酶市場的50%。由于其產(chǎn)酶量高、種類多、安全性好和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛用作生產(chǎn)菌種，其發(fā)酵生產(chǎn)的酶已在食品、飼料、洗滌、紡織、皮革、造紙和醫(yī)藥等領(lǐng)域均發(fā)揮著十分重要的作用?？莶菅挎邨U菌生境多樣，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，這決定了其自身含有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應(yīng)用潛力。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、a2淀粉酶、纖維素酶、。2葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶［4］?？莶菅挎邨U菌生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶是工業(yè)酶中應(yīng)用最為廣泛的酶，僅二者就占到了整個(gè)工業(yè)酶市場的50%［5］。其中，淀粉酶的生產(chǎn)和應(yīng)用處于整個(gè)酶制劑的首位，其最早是在20世紀(jì)初，由德國的Boiden和Effront先后從枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液中分離出的；蛋白酶主要用于制革、絲綢工業(yè)及制造加酶洗滌劑等方面。

1材料和方法材料菌種來源：篩選的土壤來自南京師范大學(xué)仙林校區(qū)北苑37棟門前綠化帶。培養(yǎng)基：篩選培養(yǎng)基A：每升含牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH4.0。篩選培養(yǎng)也：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7.2。篩選培養(yǎng)基。淀粉3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4-7H2O1.5g，pH7.2。篩選培養(yǎng)基D：葡萄糖3g，蛋白胨10g，K2HPO41.5g，MgSO4?7H2O1.5g，pH7.2。篩選培養(yǎng)基E：硝酸鈉10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4?7H2O1.5g，pH7.2。篩選培養(yǎng)基F：蛋白胨10g，葡萄糖3g，K2HPO41.5g，MgSO4?7H2O1.5g，pH7.2。儀器：Smart3000型分光光度計(jì)購自Bio_Rad公司，3K30高速冷凍離心、機(jī)購自$igma公司，HD_930型全溫?fù)u床購自博萊特儀器廠，LC_MSD_Trap_SL_01100液質(zhì)聯(lián)用儀購自Agilent公司，PTC_100型PCR儀購自MJResearch公司。菌種篩選稱取土壤2甘，放入18mL帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中，振蕩5min，靜置5-10min。取上述10-1稀釋度的土壤懸液1ml加入滅菌離心管中，在80°C水浴鍋中水浴10min，在1.5ml滅菌離心管中依次稀釋至10-2、10-3、10-4稀釋度。取上述10-2、10-3、10-4稀釋度的菌懸液分別涂布平板。30C培養(yǎng)24h。用記號(hào)筆標(biāo)記單菌落，挑取單菌落劃線至另一平板上并做好標(biāo)記(確保兩塊平板上的菌落一一對(duì)應(yīng))，在原平板上菌落周圍滴加路哥氏碘液，測(cè)量菌落大小(C)和水解圈大小(H)。挑取1個(gè)產(chǎn)淀粉酶的菌落，進(jìn)行進(jìn)一步劃線分離純化。30C培養(yǎng)7天。不同條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。1牛肉膏+蛋白胨，PH72牛肉膏+蛋白胨，pH73牛肉膏+檸檬酸鈉pH74牛肉膏+硝酸鈉pH75牛肉膏+蛋白胨，pH430°C培養(yǎng)室溫(20C)培養(yǎng)30C培養(yǎng)30C培養(yǎng)30C培養(yǎng)制備淀粉培養(yǎng)基平板一塊，用小濾紙片分別蘸取各瓶培養(yǎng)物少許，將濾紙片貼在淀粉培養(yǎng)基表面，并分別在底板上做上標(biāo)記。將平板置于30C培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h。然后將碘液鋪在平板上，觀察并測(cè)量水解圈的大小。將培養(yǎng)18h后液體搖瓶培養(yǎng)物分別取出3mL于比色杯中，在Smart3000型分光光度計(jì)30°C培養(yǎng)室溫(20C)培養(yǎng)30C培養(yǎng)30C培養(yǎng)30C培養(yǎng)1.4誘變育種挑取斜面試管中一環(huán)菌株，接種至含10ml淀粉培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，于25C，150r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)。取出培養(yǎng)約16h的搖瓶，取0.5ml菌懸液于離心、管中(3管)，5000r/min離心5min，棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，加入1.5ml無菌生理鹽水制成菌懸液。開啟紫外燈預(yù)熱10-20min。取制備好的菌懸液3皿1移入6cm的無菌培養(yǎng)皿中，將上述平皿置于紫外燈下的脫色搖床上，打開皿蓋，距離紫外燈管30cm，照射3min，蓋上皿蓋。在超凈臺(tái)內(nèi)，將照射后的菌懸液用無菌水按10倍稀釋法依次稀釋成10-1-10-5(在dorf管中進(jìn)行)。取10-3、10-4兩個(gè)稀釋度的菌懸液各0.1ml涂布均勻。以同樣的操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌懸液稀釋涂布平板作為對(duì)照。平板于37C倒置培養(yǎng)48h(用黑布包好平板)。將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。在平板菌類計(jì)數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5-6個(gè)左右的平板內(nèi)加入碘液，分別測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算比值(H/C值)，與對(duì)照平板進(jìn)行比較。形態(tài)特征的觀察用革蘭氏法染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、大小、是否具有芽孢以及芽孢在細(xì)胞內(nèi)的位置、莢膜和鞭毛(鞭毛著生的位置)等。生理生化特征的測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定均按常規(guī)方法進(jìn)行［6］。16SrDNA的擴(kuò)增和序列分析直接挑取平板上經(jīng)過活化的菌落做PCR(菌落PCR，colonyPCR)。反應(yīng)體系：在一個(gè)PCR管中用微量移液槍依次加入列物質(zhì)：Taqbuffer(10x) 2.5plTOC\o"1-5"\h\zMgCl2(25mM) 1pldNTP(2.5mM) 2.5plPrimerForward(50mM) 1plPrimerReverse(50mM) 1plddH2O 16.E用滅菌牙簽挑取單菌落于PCR管中，使菌體懸浮于反應(yīng)體系中。rTaq(2U/pl) 0.5plPCR反應(yīng)條件：95C預(yù)變性15min后，95C變性1min，55C退火1min，72C延伸1min，共25個(gè)循環(huán)，72C延伸10min。配制0.7%瓊脂糖溶液20mL，用1xTAE電泳緩沖液做溶劑，加熱溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待膠凝固；PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出PCR管，吸取5pl與1pl6x樣品Buffer混合后全部點(diǎn)入浸于TAE電泳緩沖液中的瓊脂糖凝膠的樣品孔中；100V電泳20min;將凝膠置于樣品染料溴化乙錠中染色；10min，然后將凝膠置于紫外燈下進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA條帶(約1.5Kb)，則認(rèn)為是PCR陽性，這時(shí)將與此電泳樣品對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管放置冰箱短期保存。獲得的PCR陽性樣品由專人送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。使用NCBI網(wǎng)站對(duì)待測(cè)菌的16SrDNA序列與數(shù)據(jù)庫中各種菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)。登陸美國國立生物技術(shù)信息中心、網(wǎng)站，使用BLAST在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB；基因庫中進(jìn)行同源性搜索。從Genebank中選擇近與待測(cè)菌目的基因序列同源性最高的已知分類的菌株的16SrRNA基因序列，初步確定待測(cè)菌的分類位置。用Clustal軟件將已知分類菌株的16SrRNA序列與待測(cè)菌的16SrRNA序列進(jìn)行多序列比較。2結(jié)果篩選結(jié)果和影響條件篩選結(jié)果:在自然界的土壤中存在能產(chǎn)生淀粉酶的芽孢桿菌，通過土樣稀釋、加熱土樣懸液、殺死非芽孢細(xì)菌、平板分離可獲得疑似芽胞桿菌的單菌落，將單菌落點(diǎn)接含有淀粉的平板，具有產(chǎn)淀粉酶能力的芽孢桿菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周圍也會(huì)出現(xiàn)水解圈，但肉眼不易分辨，用碘液染色法染色后顯現(xiàn)出透明圈，未水解的淀粉呈藍(lán)色，水解圈無色。由此可將產(chǎn)淀粉酶能力的菌株分離。透明圈與菌落直徑比值的大小在一定程度上反映了菌株產(chǎn)生淀粉酶的能力：H/C的值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉的能力也就越強(qiáng)。數(shù)據(jù)：H/C1.20影響條件：不同條件對(duì)淀粉酶活性的影響測(cè)定圖1 圖2不同條件對(duì)菌體生長量影響的測(cè)定搖瓶號(hào)12345H/C1.371.00—OD6000.400.002.1.3誘變效果:圖3 圖4數(shù)據(jù)：H/C1.402.2 菌株鑒定2.2.1形態(tài)與培養(yǎng)特征：C-1菌株(圖5)的細(xì)胞呈直桿狀，大小(0.8T.2)門mx(1.5-4.0)門m,單個(gè)，革蘭氏染色陽性，著色均勻，可產(chǎn)莢膜，運(yùn)動(dòng)(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于細(xì)胞寬，呈橢圓至圓柱狀；菌落(圖4)粗糙，不透明，擴(kuò)張，污白色或微帶黃色。圖5 圖62.2.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：測(cè)得C-1菌株16SrDNA序列有1421個(gè)堿基，將此序列在GenBank中BLAST顯示與芽孢桿菌屬有較高的同源性，圖5為它與芽孢桿菌屬構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。94I Bacillus_thuringiensis_D162811口口 I Staphylococcus_aureus_NR036828100 Bacillus_licheniformis_AF276309?6 .Baci11us_pumiIus_EU327994761Bacillus_pumilus_GU726869—C-1—Baci11us_pumiIus_HQ236083Bacillus_pumilus_HQ331108■——Bacillus_pumilus_FJ763642100IBacillus_pumiIus_AB360809枯草芽孢桿菌酶的主要應(yīng)用領(lǐng)域是食品工業(yè)，全世界食品工業(yè)用酶約占總量的60%,而我國則高達(dá)85%以上。這些酶在動(dòng)物蛋白水解行業(yè)中的骨素加工、植物蛋白水解中的大豆蛋白和大豆肽生產(chǎn)、乳制品和嬰兒食品生產(chǎn)等工業(yè)過程中都已得到廣泛的應(yīng)用，如在面包生產(chǎn)中a2淀粉酶、蛋白酶能有效提高面團(tuán)工藝性能和面包質(zhì)量(體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、風(fēng)味等)，并延長面包保鮮期；在啤酒生產(chǎn)中，采用淀粉酶的新型輔料液化工藝以及復(fù)合酶制劑的應(yīng)用對(duì)提高我國啤酒的產(chǎn)量和質(zhì)量有重要意義；在玉米深加工領(lǐng)域，采用耐高溫淀粉酶和糖化酶的“淀粉噴射液化”技術(shù)以及“雙酶法”糖化技術(shù)全面帶動(dòng)了我國淀粉糖、味精和檸檬酸等生產(chǎn)工藝的改革；蛋白酶還可用于魚蝦等海產(chǎn)品下腳料的加工，用于生產(chǎn)調(diào)味劑添加于食品中，不但提高了食品營養(yǎng)價(jià)值，增進(jìn)經(jīng)濟(jì)效益，而且還變廢為寶，降低了環(huán)境污染[7]。近年來，蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等在果酒、果汁、調(diào)味品、烘焙、肉制品和中藥有效成分提取以及多肽保健品生產(chǎn)中的應(yīng)用也都取得了較大的進(jìn)展[8]。。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、科研水平的提高，枯草芽孢桿菌與人們的日常生活將更為密切，它也必將作為一種十分重要的工業(yè)微生物菌種越來越引起人們的普遍關(guān)注和青睞。參考文獻(xiàn)劉志恒.現(xiàn)代微生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2002:92-99.⑵東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社,2001.KUNSTF,OGASAWARAN,MOSZERL,etal.ThecompletegenomesequenceoftheGram2positivebacteriumBacillussubtilis[J] .Nature,1997,390:249-256.袁小平，王靜，姚惠源.枯草芽胞桿菌內(nèi)切木聚糖酶的純化與性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004,30(8):55-59.MARCUSS,AJAYS,OW