CIK細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞株抗增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用

CIK細(xì)胞對乳腺癌細(xì)胞株抗增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用

【摘要】目的研究多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)對ZK751乳腺癌細(xì)胞株的抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，并探討其作用機(jī)制。方法應(yīng)用MTT法檢測CIK細(xì)胞對ZK751乳腺癌細(xì)胞株的抗增殖作用的影響及細(xì)胞毒活性；通過倒置顯微鏡、HE染色、透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果MTT比色法表明隨著CIK細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞效靶比增加及作用時間延長，抑制率明顯增強(qiáng)。CIK細(xì)胞作用于乳腺癌細(xì)胞24h后，形態(tài)學(xué)觀察乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。結(jié)論CIK細(xì)胞是一種新型高效具有較強(qiáng)殺傷體外乳腺癌細(xì)胞的免疫活性細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】CIK細(xì)胞ZK751乳腺癌細(xì)胞抗腫瘤細(xì)胞凋亡

0引言

從80年代Rosenberg等觀察到在患非免疫系統(tǒng)腫瘤的動物中給予重組白細(xì)胞介素2，動物的淋巴細(xì)胞可以調(diào)節(jié)腫瘤的消退和轉(zhuǎn)移以來，細(xì)胞免疫治療就迅速擴(kuò)展開來，人們先后研究了淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞，腫瘤浸潤淋巴(TIL)細(xì)胞，CD3單抗激活的殺傷(CD3AK)細(xì)胞，但是由于細(xì)胞來源困難、細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)低或者細(xì)胞毒力不高等原因，上述細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到極大限制。為此，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨髓移植研究中心1991年首先報道了具有高增殖能力和高細(xì)胞毒性的多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)細(xì)胞[1]。目前，國內(nèi)尚未見應(yīng)用CIK細(xì)胞體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察和機(jī)制探討。本課題通過光鏡、電鏡觀察了CIK細(xì)胞對ZK751乳腺癌細(xì)胞株作用的形態(tài)學(xué)變化。

1材料與方法

材料

藥品及試劑基因重組人IL2、鼠抗人CD3McAb、淋巴細(xì)胞分離液、基因重組人IFNγ、RPMIMedium1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT。

腫瘤細(xì)胞ZK751乳腺癌細(xì)胞株由西安醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供，由本科室體外傳代培養(yǎng)。

方法

效應(yīng)細(xì)胞制備取健康者的成分白細(xì)胞用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)Ficoll密度梯度離心法提取單個核細(xì)胞，此細(xì)胞被重懸并保存于IMDM培養(yǎng)液中。調(diào)至１×10６個/ml，第0d加入IFNγ2000u/ml，PHA100μg/ml放置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，第1d加CD3McAb5μg/ml,重組人IL21000u/ml,繼續(xù)培養(yǎng)。每3d半量換液，同時補(bǔ)加IL21000u/ml，PHA100μg/ml調(diào)細(xì)胞濃度至１×10６個/ml，第14d收獲細(xì)胞。

MTT法測量細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期乳腺癌細(xì)胞％臺盼藍(lán)染色及計數(shù)，調(diào)整濃度至1×105個/ml細(xì)胞懸液為靶細(xì)胞，取培養(yǎng)14d的CIK細(xì)胞調(diào)整濃度為１×10６個/ml為效應(yīng)細(xì)胞。按10∶1、20∶1、30∶1的效靶比混合加入96孔板，另設(shè)單獨效應(yīng)細(xì)胞組及單獨靶細(xì)胞組為陰性對照組、每組重復(fù)8孔，置于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h后取出，每孔加MTT20μl(5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h后小心棄去上清液，加入二甲基亞砜160μl,輕輕振蕩10min后用酶聯(lián)免疫檢測儀λ＝490nm測吸光度值，殺傷率計算公式為：抑制率＝[１－(實驗孔A值－效應(yīng)孔A值)/靶細(xì)胞孔A值]×100%

倒置顯微鏡觀察將CIK細(xì)胞和靶細(xì)胞以效靶比30∶1接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨時在倒置顯微鏡下觀察。設(shè)對照組為單純培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞。

HE染色觀察將CIK細(xì)胞和靶細(xì)胞以效靶比30∶1接種于已放置支持物小蓋片的12孔培養(yǎng)板內(nèi)。對照組：加等量生理鹽水。連續(xù)培養(yǎng)24h后取出小蓋片。將小蓋片用4％多聚甲醛固定30min后，水洗3min，蘇木素2min，水洗3min，％鹽酸酒精8s，水洗15min，90％乙醇5min，伊紅30s，脫水、透明及封固。

透射電鏡觀察將CIK細(xì)胞和靶細(xì)胞以效靶比30∶1混合的4、12及24h細(xì)胞離心，棄去上清液，剩下的細(xì)胞團(tuán)用%戊二醛固定、梯度丙酮脫水;Epon812混合樹脂包埋;超薄切片機(jī)切片;醋酸鈉和檸檬酸鉛染色;透射電鏡觀察、照相。

統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用軟件：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，MTT法檢測的抑制率之間的比較采用t檢驗。

2結(jié)果

MTT法檢測CIK細(xì)胞對ZK751乳腺癌細(xì)胞的抗增殖及細(xì)胞毒結(jié)果

隨著效靶比增加及作用時間延長，其細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。相同作用時間不同效靶比之間有顯著性差異，同一效靶比不同作用時間之間也有顯著性差異。當(dāng)效靶比為30∶1時，其抑制率為%±%，接近半數(shù)抑制濃度，有效作用時間為24h，見表1。

表1用MTT法測定CIK細(xì)胞對ZK751乳腺癌細(xì)胞株的抑制率

Note:ComparedwiththeformeratthesametimeΔ;Comparedwiththeformeratthesametime*;ComparedwiththeformeratthesameE/T▲(n=6)

形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下觀察到CIK逐漸聚集到乳腺癌細(xì)胞周圍，呈典型的玫瑰花環(huán)狀改變，乳腺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物，乳腺癌細(xì)胞逐漸模糊、消失。效靶細(xì)胞共育24h時乳腺癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，48h乳腺癌細(xì)胞明顯漂浮，并且在培養(yǎng)液中出現(xiàn)碎片。對照組乳腺癌細(xì)胞仍貼壁生長，狀況良好。單獨CIK細(xì)胞未見趨動現(xiàn)象，均勻鋪滿視野，見圖1、2。

在透射電鏡下，體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞與ZK751乳腺癌細(xì)胞亦易于鑒別：前者細(xì)胞與外周血淋巴細(xì)胞相似。而乳腺癌細(xì)胞則核大而形狀不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)很少，核仁大而致密，癌細(xì)胞表面有許多大小、形狀不一的突起，胞漿內(nèi)含有豐富的游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。在效靶細(xì)胞共育4h后，效靶細(xì)胞直接接觸或呈犬牙狀交錯，可見到靶細(xì)胞核內(nèi)已開始濃縮的異染色質(zhì)，核仁分解為許多嗜鋨酸的細(xì)小顆粒，分布于核中央，核膜已經(jīng)模糊不清，胞漿內(nèi)線粒體外膜開始破壞，但細(xì)胞膜完整的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，見圖3。效靶細(xì)胞共育12h后，變性死亡的癌細(xì)胞逐漸增多，癌細(xì)胞死亡的方式以凋亡為主，可見大小不等的凋亡細(xì)胞和凋亡小體及散在的有質(zhì)膜包繞的細(xì)胞碎片。有的癌細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞，核高度濃縮，胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多空泡。效靶細(xì)胞共育24h后，絕大多數(shù)靶細(xì)胞死亡，可見細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞器溶解形成碎片，見圖4。

圖1CIK細(xì)胞聚集到腫瘤細(xì)胞周圍呈典型的玫瑰花環(huán)狀(HE×400倍）

圖2腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)顆粒狀物，細(xì)胞膜模糊、消失

圖3效靶細(xì)胞共育4h后，效靶細(xì)胞直接接觸或呈犬牙狀交錯，可見細(xì)胞膜完整的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

圖4效靶細(xì)胞共育24h后，絕大多數(shù)靶細(xì)胞死亡，可見細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞膜不完整的凋亡小體

3討論

CIK細(xì)胞是將人外周血單個核細(xì)胞在體外多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段作用時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，是一類非主要組織相容性復(fù)合物和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞，以CD3＋CD56＋T細(xì)胞為主。

利用細(xì)胞培養(yǎng)的篩選體系可以在體外對人體癌細(xì)胞進(jìn)行抗癌效力檢測，從而加快篩選速度。本實驗通過MTT法觀察CIK細(xì)胞以不同濃度，不同效靶比作用于ZK751乳腺癌細(xì)胞不同作用時間后所測的抑制率。結(jié)果表明:隨著效靶比增加及作用時間延長，其細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。相同作用時間不同效靶比之間有顯著性差異，同一效靶比不同作用時間之間也有顯著性差異。說明CIK細(xì)胞對ZK751乳腺癌細(xì)胞株均有抗增殖作用。倒置顯微鏡、光鏡和透射電鏡從細(xì)胞和亞細(xì)胞水平均觀察到CIK細(xì)胞具有較強(qiáng)的攻擊、殺傷ZK751乳腺癌細(xì)胞的功能。CIK細(xì)胞包圍靶細(xì)胞使靶細(xì)胞發(fā)生兩種變化。一種為細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為靶細(xì)胞體積縮小，胞漿減少，核固縮。另一種表現(xiàn)為靶細(xì)胞腫脹，胞膜破裂內(nèi)容物流出而壞死。目前關(guān)于CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷原理尚不清楚。實驗證明CIK細(xì)胞活化后產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子如IFNr、TNFa、IL2等。不僅對腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性間接殺傷腫瘤細(xì)胞。Mehta等認(rèn)為CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷有兩條途徑：第一，CIK細(xì)胞被淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原－１有關(guān)識別結(jié)構(gòu)激活導(dǎo)致胞漿毒性顆粒依賴性的溶細(xì)胞作用，這條途徑與胞漿內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度無關(guān)；第二，CIK細(xì)胞表面的CD3樣受體被結(jié)合而激活CIK細(xì)胞產(chǎn)生胞漿毒性顆粒介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用，這條途徑與胞漿內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度有關(guān)；而且這兩種途徑最后都通過刺激CIK細(xì)胞釋放顆粒酶、穿孔素而裂解靶細(xì)胞，提示細(xì)胞裂解可能是殺傷靶細(xì)胞的主要機(jī)制。

在與靶細(xì)胞結(jié)合的部分CIK細(xì)胞內(nèi)有一種特殊的微管泡狀結(jié)構(gòu)，表面光滑，這種特殊結(jié)構(gòu)可能與CIK細(xì)胞的殺傷功能有關(guān)。還有的CIK細(xì)胞內(nèi)溶酶體含量增多，這與CIK細(xì)胞殺傷活性有關(guān)，具有溶解活性的殺傷細(xì)胞是富含溶酶體的細(xì)胞。

本實驗結(jié)果顯示出CIK細(xì)胞抗腫瘤作用的巨大潛力，為CIK細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療提供了實驗依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

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