抗大鼠腎小球基底膜腎炎模型建立方法的改進(jìn)

抗大鼠腎小球基底膜腎炎模型建立方法的改進(jìn)【摘要】目的探討快速建立抗大鼠腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane，GBM)腎炎動(dòng)物模型的方法。方法30只正常SD大鼠隨機(jī)分為三組，腎炎模型A、B組和正常對(duì)照組。腎炎模型A、B組大鼠一次性尾靜脈注射兔抗GBM血清；正常對(duì)照組，尾靜脈注射等量正常兔血清。腎炎模型A組大鼠尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清前一周，通過(guò)足墊皮內(nèi)注射正常兔血清進(jìn)行預(yù)免疫。上述三組大鼠于尾靜脈注射兔血清后第2、7、14和21天，檢測(cè)24h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮含量；第21天處死大鼠取腎組織觀察腎小球和腎小管的病理變化。結(jié)果腎炎模型A、B組，尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，24h尿蛋白，血肌酐和血尿素氮含量均明顯升高(P＜)，A組升高程度均較B組明顯(P＜)。光鏡檢測(cè)A組新月體形成率較B組明顯升高，腎小管內(nèi)蛋白管型較B組多，部分腎小球不完全纖維化，B組腎小球未見(jiàn)纖維化。對(duì)照組上述指標(biāo)均無(wú)明顯變化。結(jié)論大鼠注射兔抗GBM血清之前，進(jìn)行正常兔血清預(yù)免疫，可以更快誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抗GBM腎炎。

【關(guān)鍵詞】抗GBM腎炎模型方法大鼠

【Abstract】ObjectiveToapproachthefastmethodtoestablishratmodelsofanti-GBM30normalratswererandomlydividedintonephritisgroupA,nephritisgroupBandcontrolgroup.Theratsinnephritisgroupswereinjectedofrabbitanti-ratGBMserum.TheratsinnephritisgroupAwerepreimmunizedsubcutaneofnormalrabbitserum7daysbeforetheinjectionofrabbitanti-ratGBMserum.Allratswereobservedfor24hurinaryprotein,serumcreatine,serumureaonthe2ndday,the7thday,the14thdayandthe21stday.Allratswerekilledonthe21stdayandthekidneyspecimenswerecollectedforhistologicanalysis.ResultsThe24hurinaryprotein,serumcreatineandserumureawereobviouslyincreasedintheratsinjectedwithrabbitanti-GBMserum(P＜),especiallyinnephritisgroupA(P＜).ThereweremorecrescentsandproteincastsinnephritisgroupAthangroupBandpartoftheglomerulewaspartialfibrousdegenerationinnephritisgroupA.TherewasnofibrosisobservedinnephritisgroupAandnomarkedchangesatalltheabovetimepointsincontrolgroup.ConclusionsTheratscanbefastinducedtotheanti-GBMnephritisbypreimmunizingwithnormalrabbitserumbeforeinjectingtherabbitanti-ratGBMserum.

【Keywords】Anti-GBMnephritis;model;method;rat

新月體性腎炎是人類(lèi)腎小球腎炎中常見(jiàn)病、多發(fā)病。臨床上多數(shù)患者起病急、病情兇險(xiǎn)、病程迅速、預(yù)后較差。該病是一種自身免疫性疾病，其病理特征為大部分腎小球內(nèi)形成新月體，早期為細(xì)胞型新月體，隨著炎癥發(fā)展，細(xì)胞型新月體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維性新月體，最終可導(dǎo)致整個(gè)腎小球纖維化，腎功能喪失。

大鼠抗GBM腎炎是利用異種抗大鼠GBM抗體直接誘導(dǎo)發(fā)生的具有典型的人類(lèi)新月體性腎炎病理變化的動(dòng)物模型。單純注射抗GBM血清誘導(dǎo)的大鼠抗GBM腎炎，病程發(fā)展較慢，形成典型的新月體性腎炎需時(shí)較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在原來(lái)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上有所改變，先對(duì)大鼠足底注射正常兔血清進(jìn)行預(yù)免疫，1周后再注射兔抗大鼠GBM血清，建立大鼠抗GBM腎炎模型，探討一種快速建立典型的新月體性腎炎動(dòng)物模型的方法，以期為進(jìn)一步研究人類(lèi)新月體性腎炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

動(dòng)物正常健康SD大鼠，190～210g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

主要試劑兔抗大鼠GBM血清，本實(shí)驗(yàn)室制備，膠原酶、完全福氏佐劑購(gòu)自上海華美生物工程有限公司。

大鼠抗GBM腎炎模型的復(fù)制及動(dòng)物分組處理正常SD大鼠30只，雌雄不限，180～220g，實(shí)驗(yàn)前在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)4天，以適應(yīng)環(huán)境。在此期間單籠收集大鼠24h尿，測(cè)24h尿蛋白含量，心臟穿刺采血收集血清測(cè)血肌酐和尿素氮含量，30只大鼠的上述指標(biāo)均無(wú)異常。大鼠隨機(jī)分為三組，腎炎模型A組、腎炎模型B組及正常對(duì)照組，每組10只。腎炎模型A、B組大鼠一次性尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清；正常對(duì)照組大鼠尾靜脈注射等量正常兔血清，劑量均為1ml/100g。腎炎模型A組大鼠尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清前1周，足墊皮內(nèi)注射兔正常血清進(jìn)行預(yù)免疫，正常兔血清與完全福氏佐劑等量混合，總體積為。

主要觀察指標(biāo)

生化指標(biāo)于尾靜脈注射兔血清后第2、7、14天和第21天，收集24h尿，采用改良Lowry法測(cè)24h尿蛋白含量；心臟采血收集血清，采用苦味酸法測(cè)血肌酐含量，二乙酰一肟法測(cè)血尿素氮含量。

病理學(xué)檢查于尾靜脈注射兔血清后第21天，處死大鼠取腎組織進(jìn)行光鏡及電鏡檢查。腎組織切片經(jīng)H-E染色，光鏡觀察腎小球體積大小、腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)及腎小管內(nèi)蛋白管型等情況，腎小球尿囊腔內(nèi)可見(jiàn)三層細(xì)胞為形成新月體，計(jì)數(shù)50個(gè)腎小球，統(tǒng)計(jì)新月體形成率。電鏡觀察腎小球基底膜變化、腎小球內(nèi)電子致密物沉積、足突融合等情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

2結(jié)果

24h尿蛋白含量的變化腎炎模型A、B組大鼠，尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，各時(shí)間點(diǎn)24h尿蛋白含量均較正常對(duì)照組明顯升高(P＜)，A組第2、7天和14天尿蛋白含量較B組明顯升高(P＜)，A組于第21天尿蛋白含量有下降趨勢(shì)。注射正常兔血清后，正常對(duì)照組大鼠24h尿蛋白含量無(wú)明顯改變，見(jiàn)表1。表1大鼠注射兔血清后各時(shí)間點(diǎn)24h尿蛋白含量注:與正常對(duì)照組相比**;A組與B組相比ΔΔ

血肌酐含量的變化尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，腎炎模型A組大鼠第7、14天和21天血肌酐含量較正常對(duì)照組明顯升高(P＜)，腎炎模型B組大鼠第14天和第21天血肌酐含量較正常對(duì)照組明顯升高(P＜)。腎炎模型A組大鼠第14天和第21天血肌酐含量較B組明顯升高(P＜)。N組大鼠血肌酐含量無(wú)明顯改變，見(jiàn)表2。表2大鼠注射兔血清后各時(shí)間點(diǎn)血肌酐含量注:與正常對(duì)照組相比*;與正常對(duì)照組相比**;A組與B組相比Δ;A組與B組相比ΔΔ

血尿素氮含量的變化尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后，腎炎模型A組大鼠第7、14天和21天血尿素氮含量較N組明顯升高(P＜)，腎炎模型B組大鼠第21天血尿素氮含量較N組明顯升高(P＜)。腎炎模型A組大鼠第14天和第21天血尿素氮含量較B組明顯升高(P＜)。N組大鼠血尿素氮含量無(wú)明顯改變，見(jiàn)表3。表3大鼠注射兔血清后各時(shí)間點(diǎn)血尿素氮含量注:與正常對(duì)照組相比*;與正常對(duì)照組相比**;A組與B組相比Δ;A組與B組相比ΔΔ

病理檢查尾靜脈注射兔抗大鼠GBM血清后第21天，腎炎模型A組大鼠新月體形成率為45%，部分腎小球尿囊腔完全閉塞，少數(shù)腎小球不完全纖維化，腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量蛋白管型(見(jiàn)圖1、2)。腎炎模型B組大鼠新月體形成率為13%，腎小管內(nèi)蛋白管型較A組少，腎小球未見(jiàn)纖維化(見(jiàn)圖3)。電鏡觀察腎炎模型A組腎小球基底膜明顯增厚，內(nèi)皮下大量電子致密物沉積，足突大片融合(見(jiàn)圖5)。腎炎模型B組腎小球基底膜增厚不明顯，內(nèi)皮下可見(jiàn)少量電子致密物沉積，足突局部融合(見(jiàn)圖6)。對(duì)照組大鼠腎組織無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖4、7)。

3討論

人類(lèi)新月體性腎炎是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其病理特征為大部分腎小球伴有新月體形成，早期的新月體主要由浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和增生的腎小球囊上皮細(xì)胞組成，隨著炎癥的發(fā)展，細(xì)胞型新月體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維型新月體，最終導(dǎo)致整個(gè)腎小球纖維化，腎功能喪失。

大鼠抗GBM腎炎通過(guò)注射異種抗大鼠GBM抗體誘導(dǎo)產(chǎn)生，其病變?nèi)缂?xì)胞增生、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、纖維蛋白的滲出及新月體的形成、GBM不規(guī)則增厚和斷裂等病理變化均與人類(lèi)新月體性腎炎相似。該模型具有重復(fù)性好和制作容易等特點(diǎn)，在研究新月體性腎炎的發(fā)病機(jī)制及探討疾病的防治措施等方面，一直被廣泛采用。但是單純注射抗GBM血清誘導(dǎo)的大鼠抗GBM腎炎，病程發(fā)展較慢，形成病變典型的新月體性腎炎需時(shí)較長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中，腎炎模型A組大鼠在注射兔抗大鼠GBM抗體之前，先通過(guò)足底皮內(nèi)注射正常兔血清進(jìn)行預(yù)免疫，腎炎模型B組大鼠僅注射兔抗大鼠GBM抗體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎炎模型A組24h尿蛋白含量、血肌酐及血尿素氮含量升高均較B組出現(xiàn)早，且升高程度較B組明顯，腎炎模型A組24h尿蛋白含量在第21天有下降趨勢(shì)，其原因可能是隨著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并活化及纖維蛋白等炎性因子的參與，促使腎小球纖維化進(jìn)行性加重，尿囊腔壓力增大，在一定程度上阻止了蛋白的外漏，另一方面大量蛋白管型使腎小管堵塞，大量蛋白淤積于腎小球內(nèi)，加劇腎小球纖維化，腎功能急劇下降。病理結(jié)果顯示腎炎A組大鼠新月體形成率較B組明顯高，而且病理變化更典型。這些結(jié)果說(shuō)明腎炎A組較B組腎炎癥狀出現(xiàn)早，病程發(fā)展快，這和臨床上新月體性腎炎的急性進(jìn)行性特征更為一致。

大鼠抗GBM腎炎有兩個(gè)免疫時(shí)相，即異體免疫時(shí)相和自體免疫時(shí)相［1］。異體免疫時(shí)相是指兔抗大鼠GBM抗體注射到大鼠體內(nèi)后，兔抗GBM抗體迅速固定于大鼠GBM上，通過(guò)激活補(bǔ)體及其他一系列途徑［2～5］，損傷大鼠的GBM，此時(shí)相持續(xù)7～10天。自體免疫時(shí)相包括兩個(gè)方面：一方面是指大鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗兔免疫球蛋白的抗體，并與沉積在GBM上的兔免疫球蛋白結(jié)合，導(dǎo)致沉積的IC繼續(xù)擴(kuò)大，加重腎組織的病理?yè)p害［6］；另一方面因大鼠腎組織損傷而導(dǎo)致自身隱蔽抗原的釋放，如GBM等，從而誘導(dǎo)自身免疫細(xì)胞損傷GBM［7～8］，大鼠GBM損傷，導(dǎo)致蛋白尿，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，新月體形成等。在腎臟病理?yè)p傷中，自體免疫發(fā)揮主要作用。

通過(guò)皮內(nèi)注射正常兔血清，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，大鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生針對(duì)兔免疫球蛋白的抗體及致敏淋巴細(xì)胞。當(dāng)兔抗大鼠GBM血清注射到大鼠體內(nèi)時(shí)，兔抗大鼠GBM抗體與GBM結(jié)合后，大鼠體內(nèi)的針對(duì)兔免疫球蛋白的抗體及反應(yīng)性T細(xì)胞可以在很短時(shí)間內(nèi)與結(jié)合在大鼠GBM上的兔抗GBM抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，同時(shí)引起GBM的損傷,此損傷更快速且更嚴(yán)重。在腎炎模型B組中自體免疫時(shí)相發(fā)生在異體免疫時(shí)相之后，只有在大鼠產(chǎn)生抗兔血清的抗體后，或是自身GBM受損暴露后才會(huì)發(fā)生自體免疫應(yīng)答。腎炎模型A組通過(guò)預(yù)免疫，提前使大鼠體內(nèi)生成兔免疫球蛋白的抗體及致敏淋巴細(xì)胞，自體免疫時(shí)相較腎炎模型B組發(fā)生較早，相應(yīng)引起的免疫損傷也較嚴(yán)重，因此腎炎癥狀出現(xiàn)更早，能在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生典型新月體性腎炎病理改變。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)預(yù)免疫，在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生典型的新月體性腎炎動(dòng)物模型，以期為進(jìn)一步研究人類(lèi)新月體性腎炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

1湯仁仙，簡(jiǎn)潔，王迎偉,等.大鼠抗GBM腎炎模型的建立及不同病期的生化指標(biāo)和腎組織病理學(xué)觀察.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003,23(1):9-13.

2LeHirofhumorallymediatedanti-glomerularbasementmembrane(GBM)glomerulonephritisinmice.JNephrolDialTransplant，2004,19(7):1875-80.

3PavelKovalenko,HidehikoFujinaka,YutataYoshida,etal.Fcreceptor-mediatedaccumulationofmacrophagesincrescenticglomerulonephritisinducedbyanti-glomerularbasementmembraneantibodyadministrationinWKYrats.JInternationalimminology,2004,16(5):625-634.

4IsomeM,FujinakaH,AdhikaryLP,etal.Importantroleformacrophagrsininductionofcrescenticanti-GBMglomerulonphritisinWKYrats.JNephrolDialTransplant,2004,19(12):2997-3004.

5HelmutHopfer,RuthMaron,UlrikeButzmann,etal.Theimportanceofcell-mediatedimmunityinthecourseandseve