第三章動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

本章主要內(nèi)容第一節(jié)動植物細胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶本文檔共40頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\9點58分概述動植物細胞培養(yǎng)定義：是通過特定技術(shù)獲得優(yōu)良的動物和植物細胞，然后在人工控制條件的反應(yīng)器中進行細胞培養(yǎng)，以獲得所需產(chǎn)物的技術(shù)過程。本文檔共40頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\9點58分概述獲取方法培養(yǎng)方式培養(yǎng)目的動物細胞離心分離、雜交瘤技術(shù)、胰蛋白酶消化懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)獲得功能蛋白質(zhì)植物細胞機械搗碎、酶解、誘導(dǎo)愈傷組織、分離原生質(zhì)體固體培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)獲得次生代謝產(chǎn)物本文檔共40頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\9點58分第一節(jié)動植物細胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)動植物細胞更復(fù)雜，調(diào)節(jié)層次更多。細胞水平個體水平（激素、神經(jīng)水平）下面著重從細胞水平討論。本文檔共40頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\9點58分第一節(jié)動植物細胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)一、細胞分化改變酶的生物合成原因：基因表達具有時空性如：胰蛋白酶主要在胰細胞中合成木瓜蛋白酶主要在果皮細胞中合成端粒酶在胚胎細胞、生殖細胞、干細胞、分化程度低的癌細胞中具活性。本文檔共40頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\9點58分第一節(jié)動植物細胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)2、基因擴增加速酶的生物合成即通過增加基因的數(shù)量來調(diào)節(jié)基因表達的一種方式。如：對藥物的抗性。3、增強子促進酶的生物合成增強子能促進同源或異源啟動基因的轉(zhuǎn)錄活性。4、抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成半抗原誘導(dǎo)法酶蛋白誘導(dǎo)法本文檔共40頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶近年來通過植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的研究已經(jīng)取得可喜進展本文檔共40頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\9點58分含酶制品——嫩肉粉本文檔共40頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細胞的特性大生長及代謝率低營養(yǎng)要求簡單需光對剪切力敏感生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物本文檔共40頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶二、植物細胞培養(yǎng)的特點提高產(chǎn)率縮短周期易于管理，減輕勞動強度提高產(chǎn)品質(zhì)量其他：需光照等本文檔共40頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶外植體的選擇和處理→愈傷組織的誘導(dǎo)→細胞的獲取→細胞培養(yǎng)→分離純化→產(chǎn)物外植體的選擇與處理：選擇外植體、切取片段、消毒處理。植物愈傷組織直接分離法機械搗碎發(fā)：動作輕柔酶分解法：纖維素酶、果膠酶等過濾、離心分離愈傷組織誘導(dǎo)法能迅速增殖、無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細胞團外植體半固體培養(yǎng)基滅菌、冷卻生長素、分裂素插入培養(yǎng)25℃愈傷組織1-3周分散、接種原生質(zhì)體再生去除細胞壁后得到的微球體三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細胞培養(yǎng)的工藝流程植物細胞的獲?。罕疚臋n共40頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細胞培養(yǎng)的工藝流程外植體→細胞的獲取→細胞培養(yǎng)→分離純化→產(chǎn)物1、外植體的選擇與處理2、植物細胞的獲取3、細胞懸浮培養(yǎng)4、分離純化本文檔共40頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基1、植物細胞培養(yǎng)基的特點與微生物培養(yǎng)基的主要不同點如下：（1）植物細胞的生長和代謝需要大量的無機鹽（2）植物細胞需要多種維生素和植物生長激素（3）植物細胞要求的氮源一般為無機氮源（4）植物細胞一般以蔗糖為碳源本文檔共40頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基2、幾種常用的植物細胞培養(yǎng)基

1）MS培養(yǎng)基硝酸鹽濃度高，廣泛用于培養(yǎng)植物細胞、組織及原生質(zhì)體。2）B5培養(yǎng)基銨的濃度較低，適于雙子葉植物特別是木本植物的組織、細胞培養(yǎng)。3）White培養(yǎng)基無機鹽濃度低，適用于生根培養(yǎng)。4）KM-8P培養(yǎng)基主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)。本文檔共40頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3、植物細胞培養(yǎng)基的配制為取用方便及減小誤差，先配成母液保存?zhèn)溆谩＃?）大量元素母液：即含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的無機鹽混合液。一般配成10倍濃度的母液。需單獨溶解，按順序攪拌混合。避免生成沉淀。（2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的無機鹽混合液。一般配制成100倍濃度的母液。本文檔共40頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3、植物細胞培養(yǎng)基的配制（3）鐵鹽母液：單獨配制，一般采用敖和鐵，通常配制成100倍濃度母液。（4）維生素母液：是各種維生素和氨基酸的混合液，一般配成100倍濃度母液。（5）植物激素母液：各種植物激素單獨配制成母液。一般濃度為100mg/L.（注：一般難溶于水，需先用有機溶劑或酸、堿溶解，再用水定容。）本文檔共40頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（三）溫度的控制：一般室溫（25℃左右）溫度高，有利細胞生長；溫度低，有利于次級代謝產(chǎn)物積累。（四）pH的控制：一般微酸性（Ph5.0~6.0）（五）溶解氧的控制:通風(fēng)攪拌供給（不能太劇烈）。本文檔共40頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（六）光照的控制：對強度及時間有要求。（七）前體的添加：前提指處于目的代謝途徑上游的物質(zhì)。（八）刺激劑的應(yīng)用：微生物細胞壁碎片、果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶。本文檔共40頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\9點58分第二節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶四、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程1、大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)2、大蒜細胞懸浮培養(yǎng)3、超氧化物歧化酶的分離純化本文檔共40頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\9點58分

第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶由于動物細胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達產(chǎn)物的優(yōu)點，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價值的生物制品，需要借助于動物細胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進了動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。本文檔共40頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\9點58分第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶早在1907年，美國的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細胞中生長病毒的報告，開拓了以動物病毒為研究對象的新領(lǐng)域。作為大規(guī)模細胞培養(yǎng)，Copsik等人成功的進行了有關(guān)倉鼠腎細胞的懸浮培養(yǎng)。本文檔共40頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\9點58分第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認識到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細胞內(nèi)表達，它們需要經(jīng)過真核細胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性。使得動物細胞一躍成為一種重要的宿主細胞，用以生產(chǎn)多種生物制品等。這些采用大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義。本文檔共40頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\9點58分動物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不同點a.動物細胞無細胞壁，機械強度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；b.生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素；c.大多數(shù)動物細胞需附著在固體或半固體的表面生長；d.對營養(yǎng)要求嚴格；e.大規(guī)模培養(yǎng)時，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗。本文檔共40頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\9點58分

第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細胞生長十分緩慢，并易為大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體對動物細胞培養(yǎng)的威脅最大，因為其感染力強且不易檢出。因此，大規(guī)模細胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個設(shè)備精良的細胞庫。在細胞庫中的冷凍細胞不受污染。本文檔共40頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\9點58分

第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補充血清。原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細胞培養(yǎng)的主要問題。因為血清來源困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來困難等。本文檔共40頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\9點58分第三節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)下列功能蛋白質(zhì)：疫苗激素多肽生長因子酶單克隆抗體非抗體免疫調(diào)節(jié)劑狂犬病疫苗——培養(yǎng)VERO（非洲綠猴腎細胞）生產(chǎn)重組人白細胞干擾素本文檔共40頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\9點58分一、動物細胞的特性（1）沒有細胞壁，細胞適應(yīng)能力差，十分脆弱。（2）體積比微生物大，比植物細胞稍小。（3）相互粘連以集群形式存在。（4）營養(yǎng)要求復(fù)雜，培養(yǎng)基一般要添加血清。本文檔共40頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\9點58分二、動物細胞培養(yǎng)的特點（1）主要用于功能蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)（2）生長較慢，15-100h（3）需要添加抗生素以防染菌（4）無細胞壁，體積較大，對剪切力敏感，要求嚴格控制培養(yǎng)條件如通風(fēng)、攪拌、pH、滲透壓等（5）大部分動物細胞有錨地依賴性，需要貼壁培養(yǎng)（6）培養(yǎng)基成分復(fù)雜，分離純化復(fù)雜，成本較高，多用于高價值藥物的生產(chǎn)（7）原代細胞培養(yǎng)50代之后即會退化死亡，需要重新分離細胞本文檔共40頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\9點58分三、動物細胞培養(yǎng)方式1、懸浮培養(yǎng)：血液細胞等對剪切力敏感2、貼壁培養(yǎng)：上皮、成纖維細胞等。滾瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)3、固定化細胞培養(yǎng)吸附法包埋法培養(yǎng)瓶CGIII-12懸浮、貼壁培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)瓶機本文檔共40頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\9點58分細胞培養(yǎng)微載體系統(tǒng)本文檔共40頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\9點58分四、動物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制工藝流程：制備細胞懸液→接種→培養(yǎng)→收集培養(yǎng)液→分離純化目的物本文檔共40頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\9點58分培養(yǎng)動物細胞的步驟1.無菌取出目的細胞所在的組織用培養(yǎng)液漂洗干凈；2.用無菌刀割掉多余部分并切成小組織塊；3.小組織塊置于解離液中離散細胞；4.低速離心洗滌細胞后，將目的細胞吸移到培養(yǎng)瓶中。本文檔共40頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\9點58分動物細胞培養(yǎng)本文檔共40頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\9點58分小鼠組織塊，用胰蛋白酶處理后變成單個細胞，24h后（貼壁生長）的成纖維細胞本文檔共40頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\9點58分（一）動物細胞培養(yǎng)基的組成成分氨基酸：必需氨基酸谷氨酰胺作碳源及能源維生素血清提供或補充B族維生素、Vc等無機鹽調(diào)節(jié)滲透壓、提供必需元素等葡萄糖作碳源及能源激素維持正常的分裂與代謝（血清提供或添加）生長因子血清提供或添加本文檔共40頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\9點58分（二）動物細胞培養(yǎng)基的配制自制：配制母液并過濾除菌備用無血清培養(yǎng)基特定營養(yǎng)成分的添加購買：商品化培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)用小牛血清無血清動物細胞培養(yǎng)基Wako(和光純藥)細胞培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基SericinGIT本文檔共40頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\9點58分（三）溫度的控制溫度影響生長與代謝36.5℃+0.25℃溫度影響pH（通過影響CO2的溶解度影響pH）本文檔共40頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\9點58分（四）pH的控制一般控制在pH7.0~7.6微堿性范圍，通常pH7.4下生長最好。調(diào)節(jié)方法：通常用CO2與NaHCO3維持pH穩(wěn)定：緩沖系統(tǒng)CO2與NaHCO3系統(tǒng)、檸檬酸與檸檬酸鹽系統(tǒng)等pH監(jiān)測：酚紅指示劑pH7.6藍紅色pH7.4紅色橙色pH7.0黃色pH6.5本文檔共40頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\9