第四章-腸道菌群的

第四章腸道菌群的檢驗(JIǎNYàN)大腸菌群EnumerationofColiforms糞大腸菌群EnumerationofFaecalColiforms大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)EnumerationofEscherichiacoli第一頁，共五十二頁。精選ppt一大群居住在人和動物腸道中生物學性狀近似的革蘭陰性(yīnxìng)桿菌屬于(shǔyú)腸桿菌科多數(shù)(duōshù)是腸道的正常菌群，至少有30個菌屬，120個以上的菌種少數(shù)為致病菌，是胃腸傳染病的最重要病原菌腸道桿菌(ENTERICBACILLI)第二頁，共五十二頁。精選ppt乳糖發(fā)酵(fājiào)試驗共同(gòngtóng)特性1、相似的形態(tài)(xíngtài)染色2、簡單的培養(yǎng)條件3、活潑的生化反應重要試驗初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖多數(shù)發(fā)酵乳糖第三頁，共五十二頁。精選ppt5、抵抗力不強6、易變異(biànyì)溶源性轉(zhuǎn)換(zhuǎnhuàn)生化(shēnɡhuà)反應性變異通過引起耐藥性變異毒力性變異轉(zhuǎn)導接合4、抗原構(gòu)造復雜

第四頁，共五十二頁。精選ppt腸道桿菌(GǎNJūN)生物特征1．形態(tài)與結(jié)構(gòu)：中小等大小兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌，無芽胞，多數(shù)有鞭毛，大多有菌毛，少數(shù)有莢膜或包膜。2．培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧菌，在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，為中等大小的光滑型菌落。有些菌在血瓊平板上出現(xiàn)β型溶血，在液體培養(yǎng)中呈均勻混濁生長。3．生化反應(fǎnyìng)：發(fā)酵葡萄糖，氧化酶陰性。生化反應活潑，一般說來，生化反應的強弱與其致病作用成反比。第五頁，共五十二頁。精選ppt腸道桿菌(GǎNJūN)流行病學抵抗力：不強，加熱60℃經(jīng)30分鐘即死亡。不耐干燥,膽鹽、煌綠等對大腸桿菌等非致病菌有選擇性作用(zuòyòng)，可制備腸道桿菌選擇性培養(yǎng)基以分離腸道致病菌。對一般化學消毒劑如漂白粉,酚,甲醛均敏感,對低溫有耐受力.臨床意義:腸桿菌科細菌可致化膿性疾病,肺炎,腦膜炎,敗血癥以及傷口,泌尿道和腸道的感染,本科細菌占臨床分離細菌總數(shù)的50%和臨床分離的革蘭氏陰性菌總數(shù)的80%,將近50%的敗血癥,70%以上的泌尿道感染是由腸桿科細菌引起.傳播方式：污染的飲水及食物、經(jīng)消化道傳播。第六頁，共五十二頁。精選ppt腸桿菌科中與衛(wèi)生醫(yī)學有關(YǒUGUāN)的細菌

第七頁，共五十二頁。精選ppt第八頁，共五十二頁。精選ppt大腸菌群為革蘭氏陰性菌第九頁，共五十二頁。精選ppt一、大腸菌群檢驗(JIǎNYàN)第一法大腸菌群MPN法第二法大腸菌群平板計數(shù)(jìshù)快速法大腸菌群PetrifilmTM測試紙片法第十頁，共五十二頁。精選pptMPN最大或然數(shù)（mostprobablenumber，MPN）計數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，適用于測定在一個混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類群其特點是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾，并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該類群微生物的存在和豐度。本法特別適合于測定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化(xiāohuà)、纖維素分解、固氮、硫化和反硫化細菌等。）的數(shù)量和檢測污水、牛奶及其他食品中特殊微生物類群（如大腸菌群）的數(shù)量，缺點是只適于進行特殊生理類群的測定，結(jié)果也較粗放。第十一頁，共五十二頁。精選pptMPN法的原理(YUáNLǐ)第十二頁，共五十二頁。精選pptMPN法的局限性——相同(XIāNɡTóNɡ)MPN值，但含義不同MPN值為90時，有四種不同(bùtónɡ)情況的陽性管數(shù)。陽性管數(shù)為“0-0-0”“0-1-2”對應的最大概率（Pmax）極小，此時的MPN值90MPN/100ml(g）無意義，所以在《FDA細菌學手冊》中，已刪除了這兩種情況。第十三頁，共五十二頁。精選pptMPN法的局限性——相同(XIāNɡTóNɡ)MPN值，但含義不同

陽性管數(shù)為“0-3-0”對應的最大概率（Pmax）為0.00417%，而國標中并沒有列出相應的95%置信區(qū)間，是考慮到該置信區(qū)間過廣，已沒有很大的指導意義。陽性管數(shù)為“2-0-0”的最大概率（Pmax)為31.91613%，表明實際(shíjì)的菌落數(shù)在10~360cfu/100ml(g）之間。所以，測定MPN值時，要考慮陽性管數(shù)。相同的MPN值，代表的實際菌落數(shù)范圍卻有很大的差別。假如你的產(chǎn)品標準為100MPN/100g，實測值為90MPN/100g（陽性管數(shù)“0-3-0”），那么很難判定你的產(chǎn)品是否合格。第十四頁，共五十二頁。精選pptMPN值的準確度隨PMAX的減小而減小

不同MPN值對應的Pmax值不同，且隨著Pmax值的減小，MPN值的準確度也明顯下降，所以在《FDA細菌學手冊》中已刪除(shānchú)了極低Pmax值（<0.004%）的情況，因為這些Pmax值對應的MPN值沒有實際的指導意義。第十五頁，共五十二頁。精選pptMPN法檢測(JIǎNCè)的隱性成本

產(chǎn)品的大腸菌群標準為30MPN/100g，而某個樣品的檢測結(jié)果為90MPN/100g，那么你可能(kěnéng)會認為你的產(chǎn)品不合格。但是，讓我們看一下90MPN/100g的置信區(qū)間，為10~360cfu/100g，也就是說有部分結(jié)果為90MPN/100g的產(chǎn)品，且實際菌落數(shù)在10~30cfu/100g之間，會被當作不合格產(chǎn)品處理。30MPN/100g的置信區(qū)間為<5~90cfu/100g（陽性管數(shù)0-0-1）或<5~130cfu/100g（陽性管數(shù)0-1-0）。也就是說部分實際菌落數(shù)為30~130cfu/100g的產(chǎn)品，會被當作合格產(chǎn)品，從而微生物風險增加。第十六頁，共五十二頁。精選ppt大腸菌群大腸菌群系指一群在36℃能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此(yǐcǐ)作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)(MPN)表示。

第十七頁，共五十二頁。精選ppt第一(DìYī)法

大腸菌群計數(shù)MPN法第十八頁，共五十二頁。精選ppt抑菌劑的選擇(XUǎNZé)大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基(wánjī)硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產(chǎn)生一些抑制作用。

第十九頁，共五十二頁。精選ppt檢樣稀釋(XīSHì)以無菌操作將檢樣25ml(或25g)放于含有225ml滅菌生理鹽水或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1：10的均勻稀釋液。調(diào)pH為6.5～7.5。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀輕液1m1．注入含有9ml滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻．作1：10的稀釋液。另取1m1滅菌吸管，按上項操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1m1滅菌吸管：根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)z樣污染情況(qíngkuàng)的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。

第二十頁，共五十二頁。精選ppt初發(fā)酵(FāJIàO)試驗在乳糖發(fā)酵過程中，觀察產(chǎn)氣和產(chǎn)酸兩個現(xiàn)象。將待檢樣品接種于LST發(fā)酵管內(nèi)(ɡuǎnnèi)，接種量在1ml以上者，用雙料LST發(fā)酵管；1m1及1m1以下者，用單料LST發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小時，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，進行分離和鑒定。第二十一頁，共五十二頁。精選ppt第二十二頁，共五十二頁。精選pptLST結(jié)果(JIēGUǒ)判斷大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以(kěyǐ)使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以(kěyǐ)產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以(kěyǐ)用手輕輕打動試管。第二十三頁，共五十二頁。精選ppt復發(fā)酵(FāJIàO)第二十四頁，共五十二頁。精選ppt大腸菌群最大可能(KěNéNG)數(shù)檢索表第二十五頁，共五十二頁。精選ppt其它(QíTā)全部為0，報告為＜最低檢出線如樣品中大腸菌群較少，可加大接種(jiēzhòng)量，采取雙料發(fā)酵管第二十六頁，共五十二頁。精選ppt大腸菌群計數(shù)(JìSHù)第二法——直接計數(shù)法CFU通過(tōngguò)數(shù)據(jù)直接求數(shù)學期望第二十七頁，共五十二頁。精選ppt傾注(QīNGZHù)培養(yǎng)根據(jù)標準(biāozhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。將涼至46℃結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA平板）注入平皿約15～20mL，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將1mL稀釋液（不含樣品）作空白對照。待瓊脂凝固后，倒入3～4mLVRBA培養(yǎng)基鋪面，培養(yǎng)基凝固后翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。第二十八頁，共五十二頁。精選ppt平板(PíNGBǎN)菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15～150之間的平板，分別計數(shù)典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍(zhōuwéi)有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑約為0.5mm。第二十九頁，共五十二頁。精選ppt

從VRBA平板上挑取10個不同(bùtónɡ)類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36

℃±1

℃培養(yǎng)24

h～48

h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。

證實(ZHèNGSHí)試驗第三十頁，共五十二頁。精選ppt大腸菌群平板(PíNGBǎN)計數(shù)的報告

經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1

mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中(qízhōng)10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105

CFU/g（mL）。第三十一頁，共五十二頁。精選ppt第三十二頁，共五十二頁。精選ppt其他方法

大腸(DàCHáNG)菌群PETRIFILMTM測試紙片法第三十三頁，共五十二頁。精選ppt第三十四頁，共五十二頁。精選ppt第三十五頁，共五十二頁。精選ppt第三十六頁，共五十二頁。精選ppt第三十七頁，共五十二頁。精選ppt二、糞大腸菌群(FAECALCOLIFORM)定義：一群能在44.5℃,24-48h內(nèi)發(fā)酵乳糖,產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢(yábāo)桿菌檢測意義：糞大腸菌群的來源是人和溫血動物糞便，作為糞便污染的指標評價食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。比大腸菌群更加直接。第三十八頁，共五十二頁。精選ppt糞大腸菌群(FAECALCOLIFORM)的測定(CèDìNG)

GB4789.39-2013第三十九頁，共五十二頁。精選ppt三、大腸桿菌(DàCHáNɡɡǎNJūN)（E.coli）細菌域(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌(gǎnjūn)目(Enterobacteriales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌屬(Escherichia)、大腸桿菌種(E.coli)。它是一種普通的原核生物，是人類和大多數(shù)溫血動物腸道中的正常茵群。但也有某些血清型的大腸桿菌可引起不同癥狀的腹瀉，根據(jù)不同的生物學特性將致病性大腸桿菌分為5類：致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。

第四十頁，共五十二頁。精選ppt大腸桿菌(DàCHáNɡɡǎNJūN)（Escherichiacoli，E.coli）定義：廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標來評價(píngjià)食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。IMViC生化試驗：細菌的生化反應吲哚（I）、甲基紅（M）、VP（V）、枸櫞酸鹽利用（C）四種試驗常用于鑒定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗。用于鑒別形態(tài)、革蘭染色反應和培養(yǎng)特性相同或相似的細菌。第四十一頁，共五十二頁。精選ppt大腸桿菌(DàCHáNɡɡǎNJūN)

G-短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。兼性厭氧菌。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道，與人終身(zhōngshēn)相伴，其代謝活動能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。但若進入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在腸道中大量繁殖，幾占糞便干重的1/3。第四十二頁，共五十二頁。精選ppt大腸桿菌(DàCHáNɡɡǎNJūN)測定——EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色(lǜsè)的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲存及培養(yǎng)細菌時都應在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌無色糞鏈球菌無色第四十三頁，共五十二頁。精選ppt大腸桿菌(DàCHáNɡɡǎNJūN)的MPN計數(shù)法

（GB4789.38-2012）第四十四頁，共五十二頁。精選ppt大腸桿菌(DàCHáNɡɡǎNJūN)在EMB平板第四十五頁，共五十二頁。精選ppt大腸(DàCHáNG)埃希氏菌與非大腸(DàCHáNG)埃希氏菌的生化鑒別第四十六頁，共五十二頁。精選ppt大腸埃希氏菌平板計數(shù)法檢驗(JIǎNYàN)程序（第二法）第四十七頁，共五十二頁。精選ppt傾注(QīNGZHù)平板選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋(xīshì)度的樣品勻液，每個稀釋(xīshì)度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。將10mL～15mL冷至45℃±