PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)課標(biāo)領(lǐng)航1．嘗試PCR(DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的基本操作。2．理解PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程。3．討論P(yáng)CR的應(yīng)用。【重點(diǎn)】

PCR的原理和反應(yīng)過(guò)程?！倦y點(diǎn)】

PCR技術(shù)的操作過(guò)程。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)情境導(dǎo)引PCR診斷技術(shù)又叫多聚酶,鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，它采用分子技術(shù),模擬核酸在體內(nèi)的復(fù)制，從而判,定疾病病原體的種類，所以從本,質(zhì)上來(lái)說(shuō)，這是一種分子診斷方法。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

核心要點(diǎn)突破知能過(guò)關(guān)演練課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段基礎(chǔ)自主梳理PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基礎(chǔ)自主梳理一、PCR擴(kuò)增的原理及條件1．概念：PCR即_______________，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_____為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。2．原理(1)DNA的熱變性：在80～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA_________結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為_(kāi)____。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA雙螺旋變性PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(2)子鏈的合成：①需要______；②合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。3．條件(1)______模板。(2)分別與模板DNA兩條鏈相結(jié)合的兩種引物。(3)A、T、G、C四種______________。(4)耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要穩(wěn)定的_____和能嚴(yán)格控制_____的溫控設(shè)備.引物DNA脫氧核苷酸pH溫度PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)思考感悟

1．什么是引物？若要克隆DNA，應(yīng)加入幾種特定的引物？【提示】所謂引物是指兩段與待擴(kuò)增的DNA序列互補(bǔ)的一小段DNA或RNA片段。DNA是由兩條反向平行排列的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈構(gòu)成的。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)二、PCR反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為_(kāi)___、復(fù)性和延伸三步。1．變性：當(dāng)溫度上升到______以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。2．復(fù)性：溫度下降到_______左右，兩種引物通過(guò)________________與兩條單鏈DNA結(jié)合。3．延伸：溫度上升到_____左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在_______________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。變性90℃50℃堿基互補(bǔ)配對(duì)72℃DNA聚合酶PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)思考感悟

2．PCR循環(huán)過(guò)程中，變性溫度設(shè)置95℃，時(shí)間設(shè)置30s的原因是什么？【提示】變性溫度過(guò)低，解鏈不完全導(dǎo)致DNA不能擴(kuò)增。變性溫度過(guò)高影響酶的活性；在此溫度條件下如果處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將會(huì)導(dǎo)致酶的鈍化。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)三、實(shí)驗(yàn)操作1．實(shí)驗(yàn)用具(1)PCR儀：該儀器能自動(dòng)調(diào)控_____，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒(méi)有PCR儀，可用3個(gè)___________代替，操作時(shí)按程序在3個(gè)水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。(2)微量離心管：總?cè)莘e為0.5mL，實(shí)際上是進(jìn)行離心的場(chǎng)所。(3)微量移液器：用于吸取轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭每吸取一種試劑后都要更換。溫度恒溫水浴鍋PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2．操作步驟準(zhǔn)備→____→混合→_____→反應(yīng)。

四、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行__________。2．所用的_________和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃儲(chǔ)存。五、DNA含量的測(cè)定1．原理：利用DNA在260nm的紫外線波段的______曲線來(lái)測(cè)定相應(yīng)含量。2．計(jì)算公式：DNA含量(μg)＝50×(260nm的讀數(shù))×_____________。移液離心高壓滅菌緩沖液吸收稀釋倍數(shù)PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)核心要點(diǎn)突破要點(diǎn)一PCR原理1．PCR擴(kuò)增方向：為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，即DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2．PCR原理——DNA的熱變性原理

通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)控制溫度的儀器。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3．生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的區(qū)別體內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開(kāi)加熱至90℃以上時(shí)，雙鏈全部解開(kāi)，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開(kāi)始，都是連續(xù)合成，控制溫度72℃特點(diǎn)邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增TaqDNA聚合酶不需要需要循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次相同點(diǎn)生物體內(nèi)的DNA復(fù)制和PCR體外DNA擴(kuò)增都需要模板、四種脫氧核苷酸，且都需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (2011年聊城高二檢測(cè))下列關(guān)于DNA復(fù)制和PCR的描述中，正確的是(

)A．DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從5′端延伸DNA鏈B．DNA復(fù)制不需要引物C．引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合D．PCR擴(kuò)增的對(duì)象是氨基酸序列【嘗試解答】

__C__例1PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)【解析】由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，故DNA復(fù)制需要引物，而且它與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。PCR擴(kuò)增的對(duì)象是DNA，而不是氨基酸?！咎揭?guī)尋律】

(1)引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。包括引物Ⅰ和引物Ⅱ兩種。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20～30個(gè)核苷酸。(2)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的原理和過(guò)程容易發(fā)生混淆，特別應(yīng)注意區(qū)分PCR反應(yīng)需要可變的溫度，而體內(nèi)DNA復(fù)制需要穩(wěn)定的溫度。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)跟蹤訓(xùn)練(2011年海淀區(qū)高二檢測(cè))關(guān)于DNA片段PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的描述中不正確的是(

)A．加入的TaqDNA聚合酶耐高溫B．不同大小DNA在電場(chǎng)中遷移速率不同C．此過(guò)程需要DNA連接酶D．?dāng)U增區(qū)域由兩種引物來(lái)決定PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)解析：選C。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是在較高溫度下進(jìn)行的，故需要耐高溫的TaqDNA聚合酶，但不需要DNA連接酶，A項(xiàng)正確，C項(xiàng)錯(cuò)誤。因?yàn)椴煌笮〉腄NA帶有不同數(shù)量的電荷，所以在電場(chǎng)中遷移速率不同，B項(xiàng)正確。PCR擴(kuò)增需要兩種引物，分別與DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)，則D項(xiàng)正確。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)要點(diǎn)二PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程1．反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL注：①總體積50μL，②模板DNA的用量在1pg～1mg之間PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2.實(shí)驗(yàn)用具(1)PCR儀：PCR自動(dòng)化程度較高，參照下表設(shè)計(jì)程序即可。循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min－－30次94℃，30s

55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)若無(wú)PCR儀，可用恒溫水浴鍋代替，三個(gè)恒溫水浴鍋的溫度分別為94℃、55℃和72℃，然后按照上表要求，在三個(gè)水浴鍋中來(lái)回轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)的微量離心管。(2)微量離心管：一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL。(3)微量移液器：用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3．實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上?用微量移液器按照配方在微量試管中依次加入各組分?蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁?將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10min?將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (2011年長(zhǎng)春高二檢測(cè))多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是在實(shí)驗(yàn)室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術(shù)，反應(yīng)系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核苷酸等。反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過(guò)程如圖所示。例2PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(1)某個(gè)DNA樣品有1000個(gè)脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基A∶G∶T∶C＝1∶2∶3∶4，則經(jīng)過(guò)PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生________個(gè)DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少是________個(gè)。(2)分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個(gè)新DNA之間存在差異，這些差異是_____________________________________________________________________________________________________________________________________。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(3)由于DNA分子上的“遺傳因子”基本都是符合孟德?tīng)柕倪z傳規(guī)律的，因此人類可以利用PCR技術(shù)合成的DNA進(jìn)行親子鑒定，其原理是：首先獲取被測(cè)試者的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取其中一樣本DNA用限制性核酸內(nèi)切酶切成特定的小片段，放進(jìn)凝膠內(nèi)，用電泳推動(dòng)DNA小片段分離，再使用特別的“探針”去尋找基因。相同的基因會(huì)凝聚在一起，然后利用特別的染料在X光下，便會(huì)顯示由DNA探針凝聚于一起的黑色條碼。每個(gè)人的條碼一半與其母親的條碼吻合，另一半與其父親的條碼吻合。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)①限制性核酸內(nèi)切酶能將DNA樣品切成特定的小片段，這主要體現(xiàn)了酶的________。A．專一性 B．高效性C．多樣性

D．作用條件溫和②2002年6月，我國(guó)第一張18位點(diǎn)的“基因身份證明”在湖北武漢誕生。人的“基因身份證明”是否終身有效？________，理由是___________________________________________________________________________________。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(4)請(qǐng)指出PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄過(guò)程的三個(gè)不同之處：①________________________________________________________________________；②________________________________________________________________________；③________________________________________________________________________。PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)【嘗試解答】

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6200(2)堿基(脫氧核苷酸)的數(shù)目、比例和排列順序不同(3)①A②是因?yàn)橥粋€(gè)體的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織的DNA是相同的，所以它有高度的個(gè)體特異性和穩(wěn)定性(4)①PCR技術(shù)以DNA的兩條單鏈為模板合成子代DNA，轉(zhuǎn)錄以DNA的一條單鏈為模板合成RNA②PCR技術(shù)的原料為脫氧核苷酸，轉(zhuǎn)錄的原料是核糖核苷酸③二者反應(yīng)時(shí)的催化酶不同(或其他合理答案)PCR擴(kuò)增DNA導(dǎo)致的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)【解析】本題考查了PC