巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控的真核表達載體的構(gòu)建及靶向性研究

巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控的真核表達載體的構(gòu)建及靶向性研究【摘要】目的:構(gòu)建巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控的靶向巨噬細胞的真核表達載體。方法:PCR方法合成巨噬細胞特異性啟動子,并將其插入帶有綠色熒光蛋白基因的真核表達載體pEGFPN1中,替代CMV啟動子。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將其與紅色熒光蛋白真核表達載體共轉(zhuǎn)染巨噬細胞和非巨噬細胞,通過熒光顯微鏡觀察GFP和RFP在不同細胞中的表達水平來鑒定啟動子的靶向性。結(jié)果:成功構(gòu)建了巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控的真核表達載體,并且能在巨噬細胞中高效特異性地表達報告基因。結(jié)論:構(gòu)建的靶向巨噬細胞的真核表達載體能提高目的基因的表達特異性,為提高基因治療胞內(nèi)菌感染的靶向性及降低毒副作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】巨噬細胞細胞特異性動子真核表達載體胞內(nèi)菌感染基因治療

胞內(nèi)菌感染的治療一直是臨床上棘手的問題之一。常見的胞內(nèi)感染細菌主要有結(jié)核桿菌、傷寒沙門氏菌等。這些胞內(nèi)感染菌突破人體第一道防線后,在體內(nèi)首先遇到巨噬細胞的吞噬和殺滅。然而在很多情況下巨噬細胞雖能吞噬這些細菌,卻并不能徹底殺死它們,反而變成了胞內(nèi)菌的庇護所[1]。另外,由于大多數(shù)抗菌藥在細胞內(nèi)的濃度低,導致胞內(nèi)菌不能被有效殺滅,而且胞內(nèi)菌感染的治療療程長,容易導致毒副反應的發(fā)生和耐藥性的出現(xiàn),更使其治療困難。因此,針對胞內(nèi)菌感染的治療,新型抗菌藥物和治療方法的開發(fā)及應用顯得尤其重要。我們前期成功構(gòu)建了抗菌肽基因的真核表達載體,并在小鼠巨噬細中成功表達了抗菌肽,發(fā)揮了殺滅胞內(nèi)菌的作用(待發(fā)表)。但是由于抗菌肽具有一定的毒副作用,會對機體正常細胞產(chǎn)生損傷作用。為了減少抗菌肽對機體正常細胞的毒副作用,增強目的基因表達的特異性和基因治療的靶向性,本研究中我們構(gòu)建了巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控的靶向巨噬細胞的真核表達載體,并利用綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白作為報告基因研究了該啟動子在不同種類細胞中表達的特異性。

1材料和方法

材料

真核表達質(zhì)粒pEGFPN1和pERFPN1為Clontech公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5α由本室保存。高保真聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶、

DNAmarker等購自大連TaKaRa公司。限制性內(nèi)切酶VspI和KpnI購自上海生工生物有限公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取和RNA提取試劑盒購自上海華舜公司。Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。小鼠巨噬細胞株、人結(jié)腸癌細胞株Lovo、人肝癌細胞株HepG2、人乳腺癌細胞株ZR7530、非洲綠猴腎細胞株COS7均由本室保存。

方法

引物的設(shè)計與合成及巨噬細胞特異性啟動子的拼接合成根據(jù)GenBank和參考文獻報道的巨噬細胞特異性啟動子序列設(shè)計拼接引物,序列為P1:5′GGCGCATTAATAAGCGACTTCCTCTTTCCAGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3

′,P2:5′ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTCAAGGCAACCACAGAGTTTGG3′,P3:5′

ACGAGCTCCTACTTCTCCTTTTCTGCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTG3′,P4:5′CTTCTCCTTTT

CTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCAAGGCAACCACAGAGTTTG3′,P5:5′CTTTTCTGCAGAAAAGGAGAAGTAGGAGCTGGAAAGAGGAAGTCGCTTTACCCTCCC3′

,P6:5′GAGGAAGTCGCTTTTGTCGCGGTCGGGACAGGGGGCAGGGAGGGTAAAGCGACTTCC3′,P7:5′

GCGACAAAAGCGACTTCCTCTTTCCAGTGCATTTAAGGCGCAGCCTGGAAGTGCCAGG3′,P8:5′GGGGTACCGCTAGCGACTGGGTGGCCTCCAGTGCTCCCTGGCACTTCCAGGCTGCG3′。其中劃線處分別為為VspI和KpnI的酶切位點,引物由上海生工生物有限公司合成。以P1和P8為引物,P2～P7為模版通過PCR

方法拼接合成巨噬細胞特異性啟動子序列,反應條件如下:98℃10s,68℃30s,共30個循環(huán);72℃5min。擴增產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠

電泳檢測。

巨噬細胞啟動子的克隆及測序鑒定

PCR產(chǎn)物電泳后經(jīng)膠回收試劑盒純化,與真核表達載體pEGFPN1用VspI和KpnI進行雙酶切,酶切

片段回收后16℃連接過夜,連接產(chǎn)物用氯化鈣方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,菌落PCR方法篩選陽性菌落,提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,并送測序。測序正確的載體命名為pSPGFP。

細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞株、人結(jié)腸癌細胞株Lovo、人肝癌細胞株HepG2、人乳腺癌細胞株ZR7530、非洲綠猴腎細胞株COS7用含有100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,在37℃50mL/LCO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1d鋪24孔板,次日將質(zhì)粒pSPGFP和pERFPN1按摩爾比1∶1混合,按轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明進行轉(zhuǎn)染。48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的表達。

2結(jié)果

結(jié)巨噬細胞啟動子的拼接合成

通過拼接PCR方法合成了巨噬細胞特異性的啟動子序列,片段大小為350bp左右,與理論預測大小相符。

巨噬細胞特異性真核表達載體的構(gòu)建和酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后插入真核表達載體pEGFPN1,替代CMV啟動子得到重組表達載體。

對重組載體進行VspI和KpnI雙酶切鑒定,得到1條約350bp的DNA片段,與理論預測值一致。經(jīng)測序鑒定序列正確,命名為pSPGFP。

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞中GFP的表達

重組質(zhì)粒pSPGFP與內(nèi)參對照質(zhì)粒pERFPN1按等摩爾比共轉(zhuǎn)染各種細胞株。作為內(nèi)參的報告基因RFP在各細胞株中均為高表達。GFP則僅在小鼠巨噬細胞中高表達,表達強度與RFP相近;而在其他非巨噬細胞中,GFP幾乎沒有表達。這說明我們構(gòu)建的巨噬細胞特異性載體能夠靶向巨噬細胞高效表達報告基因GFP。

3討論

采用基因治療的方法來治療胞內(nèi)菌感染,尤其是難治性胞內(nèi)菌感染,是一種新型有效的治療策略。但是,由于基因治療的載體往往缺乏靶向性,當載體進入機體后表達的目的基因往往會對正常組織細胞產(chǎn)生毒副作用,造成機體損傷。所以,基因治療的靶向性是決定基因治療成功與否的關(guān)鍵點之一,也是目前基因治療的研究熱點。

巨噬細胞靶向性的基因表達的主要機制就是用巨噬細胞特異性的啟動子來啟動目的基因的表達,使目的基因的表達僅限于巨噬細胞,從而減輕其對正常組織細胞的損傷?，F(xiàn)已廣泛應用于動脈粥樣硬化等[3,5,6]疾病的治療研究。

在本實驗中,我們合成了巨噬細胞特異性的啟動子序列,并以之替代pEGFPN1載體的CMV啟動子,成功構(gòu)建了巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控的真核表達載體pSPGFP。通過轉(zhuǎn)染巨噬細胞和多種非巨噬細胞,觀察GFP表達效率來驗證該啟動子的巨噬細胞靶向性。為了平衡各實驗組間的細胞數(shù)、細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率等因素的差異對GFP表達的影響,本實驗中我們利用表達紅色熒光蛋白的pERFPN1載體作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)參照,與重組載體共轉(zhuǎn)染靶細胞,通過比較GFP和RFP的表達差異來判斷啟動子的表達特異性。此方法比單獨使用GFP[7,8]更準確。而與利用海腎螢光素酶等作為內(nèi)參照的雙螢光素酶報告系統(tǒng)相比,該方法更簡變、更直觀而且無需特殊的檢測儀器。實驗結(jié)果表明,以巨噬細胞特異性啟動子啟動的GFP可以在巨噬細胞中高效表達,在非巨噬細胞中則幾乎沒有表達;而以CMV啟動子啟動的RFP在巨噬細胞和非巨噬細胞中均有表達。這說明我們構(gòu)建的巨噬細胞特異性真核表達載體可以在巨噬細胞中特異性的表達目的基因,為靶向巨噬細胞的基因治療提供了新的思路和實驗基礎(chǔ)。

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