第二章.基因工程主要技術(shù)原理CR技術(shù)

第三節(jié)PCR技術(shù)原理PCR（polymerasechainreaction）是指那些模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的方式在體外選擇性的擴(kuò)增DNA某個(gè)特殊區(qū)域的技術(shù)

是80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和基因工程及其它與DNA鑒定相關(guān)的其它領(lǐng)域，如疾病檢測(cè)、臨床應(yīng)用、商品檢疫、法醫(yī)鑒定、新藥品的開發(fā)等。返回目錄返回第二章2.3.1核酸體外擴(kuò)增最早的設(shè)想由Khorana及其同事于1971年提出：“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆tRNA基因”。但由于當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物，且當(dāng)時(shí)(1970年)Smith等發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設(shè)想被人們遺忘。2.3.2聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人才發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR),其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。開始是使用大腸桿菌

DNA聚合酶Klenow片段，由于該酶不耐熱，因此，每次加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加Klenow酶。在操作多份標(biāo)本時(shí)，這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR反應(yīng)更易于自動(dòng)化，繼而PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，使該技術(shù)的自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。PCR具有劃時(shí)代意義，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)于1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)金2.3.3PCR原理基本原理：即DNA合成的基本原理基本要素：teplate/primer/DNApoly

Template:ssDNAordsDNA

Primers:oligo-nucleotides等

Substrates:dNTP

DNApolymerase:Taqpolymerase

使用的是來自高溫微生物的DNApolymerase5’amplicon3’3’5’94℃37℃72℃Cycle12分子Cycle24分子Cycle38分子2.3.4PCR反應(yīng)過程①變性。將模板DNA置于95℃的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈DNA；②退火。將反應(yīng)體系的溫度降低至55℃左右，使得一對(duì)引物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)；③延伸。將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72℃，然后以目的基因?yàn)槟０?，合成新的DNA鏈。如此反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列。denaturedsDNAssDNA92-96℃

annealing37-72℃50-58℃

extension72℃94℃94℃2min4℃+72℃2min72℃2min65℃1min變性退火延伸這三個(gè)熱反應(yīng)過程的重復(fù)稱為一個(gè)循環(huán)一般需使用一對(duì)引物新合成的鏈又可作為模板2.3.5PCR反應(yīng)體系緩沖液buffer（1×）

50mMKCl引物退火10mMTris.HCl1.5mMMgCl2(0.5-2.5)dN植TP終濃若度0.袖2m酬M(即飽瞞和濃欄度)棉（pH噴7.春0）4種dN闖TP應(yīng)平辭衡，掘提高班忠實(shí)識(shí)性使用含時(shí)應(yīng)艘考慮Mg2+，引物釣，產(chǎn)肝量之余間的扶關(guān)系如序滋列分菜析和癢制備盛探針堆時(shí)，鐵用2涼0-擊40μm引物各1μm照，即1pm他ol饞/μ侵lOD塞26罷0ds盡DN耍A50喉μg都/m倚l(wèi)（學(xué)mo泄le擋cu停la酸r真cl狼on合in弟g）Ss選DN婦A40餡μg瘦/m錦lol擠ig格o33熱μg煩/m及l(fā)引物長(zhǎng)度稻至少宅16bp，通常蝴20越-3庭0bpTm煤=8球1.稼5-目16眼.6胳lo影g[冠J+烤]+藥0.陵04抹1(四G+掃C)把%-股(6拴00駕/N續(xù))N：鏈長(zhǎng)J：?jiǎn)蝺r(jià)昨離子貧濃度若N=對(duì)20餐G側(cè)+C鴨%=路55墊%符[帳J+師]=允60捉mm尺ol腦/L，則附：Tm侄=8鄉(xiāng)豐1.濁5-巨20引.3賢+2紗2.填6-諷30板=5扇3.卡8簡(jiǎn)單凱計(jì)算Tm壤=（紹G+材C）崗×4任+（腹A+伙T）夕×2（用屢于較嶼短引叔物）還可聞從in夜te攏rn雁et計(jì)算避免竟二級(jí)靜結(jié)構(gòu)兵的形榆成二聚棵體跡二級(jí)捆結(jié)構(gòu)G/諷C和A/誕T分布淘盡管現(xiàn)均勻裙，一土般G+條C%析4既5-辨55斥%Ol苦ig叢odT拼/o皺li淡godC除外其它拍，如妥5’葡末端古，限挽制酶楚位點(diǎn)好的長(zhǎng)澇度隨機(jī)冶引物奮6nt10羨-1蔑2n挺t模勢(shì)板μg笨or掩ng鈔10佳2-奪10多51鄉(xiāng)豐μg人類攏單拷效貝基流因組DN健A錦3×薪10克5t照ar所ge衰ts10篩ng合te亭as御tD乓NA外3如×1笑051飛ng目E勿.c灘ol遣i噴DN鬧A撈3熟×1伍051珍ng柏1鞏kb恰D廚NA畢9叉×1則061%慕M這13躺p吐la打qu看e哭1啊06名稱主要用途簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增法擴(kuò)增未知基因片段巢居PCR提高PCR敏感性、特異性，分析突變復(fù)合PCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變或病原反向PCR擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變單一特異引物PCR擴(kuò)增未知基因組DNA單側(cè)引物PCR通過已知序列擴(kuò)增未知cDNA錨定PCR分析具備不同末端的序列增效PCR減少引物二聚體，提高PCR特異性固著PCR有利于產(chǎn)物的分離2.笨3.代6溪PC踩R的相兼關(guān)技擔(dān)術(shù)連接介導(dǎo)PCRDNA甲基化分析、突變和克隆等RACE-PCR擴(kuò)增cDNA末端定量PCR定量mRNA或染色體基因原位PCR研究表達(dá)基因的細(xì)胞比例等臆斷PCR鑒定細(xì)菌或遺傳作用通用引物PCR擴(kuò)增相關(guān)基因或檢測(cè)相關(guān)病原信使擴(kuò)增表型分型(mapping)同時(shí)分析少量細(xì)胞的mRNA膜結(jié)合PCR去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留表達(dá)盒PCR產(chǎn)生合成或突變蛋白質(zhì)的DNA片段逆轉(zhuǎn)妖錄PC毅R非(r券et雪ro粉tr啊an而sc擇ri票pt哥io塑n嘩PC對(duì)R,修R叨T帆PC俘R)指的移是以RN緩A為模窗板，驚經(jīng)逆固轉(zhuǎn)錄染獲得片與RN甜A互補(bǔ)思的DN絞A鏈即cD共NA淚，然后手以cD徐NA鏈為屯模板娛進(jìn)行露的PC捉R反應(yīng)呢。錨定PC便R關(guān)(a丟nc億ho叮re們d鹿PC帶R)適合虧于擴(kuò)沙增那歐些只交知道頓一端府序列科的目戒的DN頸A。例如燃，對(duì)唉于一轟端序稱列已幸知、晚一端申序列賭未知備的DN噴A片段惱，可泥以通粒過DN鴉A末端此轉(zhuǎn)移老酶給振未知扎序列躲的那貨一端衡加上來一段宮多聚dG的尾重巴，伯然后的分別曾用多答聚dC和已箱知的耽序列丙作為慈引物趁進(jìn)行PC忘R擴(kuò)增疫。反向PC巧R閃(i叼nv沿er剩se繞P冷CR買,i膚nP用CR園)適用痛于擴(kuò)瓜增已知漂序列跑的兩鹿端的未古知序搖列。杰其具真體方衫法是念選擇班一個(gè)澆在已知地序列饑中沒誓有，冊(cè)而在撇其兩等側(cè)都亭存在的限圖制性蛛內(nèi)切嗓酶位頑點(diǎn)，突用相戒應(yīng)的擦限制憐性內(nèi)索切酶違酶解加后，礦將酶切的片姥段在負(fù)連接曠酶的測(cè)作用使下環(huán)化，使美得已抹知序理列位傾于環(huán)揪狀分爛子上販。根脾據(jù)已柿知序蟲列的瞇兩端濟(jì)序列取設(shè)計(jì)游兩個(gè)周引物煎，以雪環(huán)狀卻分子方為模桌板擴(kuò)耽增出傘已知扣序列遭兩側(cè)虧的未恨知序情列。2.令3.模7其它砌體外技核酸右擴(kuò)增胃技術(shù)技術(shù)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)檢測(cè)HIV連接酶鏈反應(yīng)(LCR檢測(cè)點(diǎn)突變自主序列復(fù)制(3SR)系統(tǒng)研究RNA，臨床應(yīng)用、法醫(yī)學(xué)等鏈替代擴(kuò)增(SDA)檢測(cè)、鑒定基因Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)增加探針檢測(cè)敏感性循環(huán)探針反應(yīng)增加探針檢測(cè)敏感性2.法3.仇8館PC億R技術(shù)叔的應(yīng)鄰用研究堵：基因去克隆遮；DN啦A測(cè)序暴；分閣析突況變；產(chǎn)基因飼重組襪與融嫁合；喚鑒定賤與調(diào)梁控蛋杏白質(zhì)宇結(jié)拌合DN題A序列這；轉(zhuǎn)卷座子不插入襖位點(diǎn)狐的繪鵝圖；吃檢測(cè)應(yīng)基因百的修課飾；烘合成診基因講的構(gòu)嗚建；蔽構(gòu)建對(duì)克隆灘或霧表達(dá)駕載體逆；檢棵測(cè)某獨(dú)基因要的內(nèi)攀切酶動(dòng)多態(tài)托性診斷雹：細(xì)菌懶(螺趕旋體誘、支炸原體色、衣嚇原體蠅、分誰支桿婚菌、需立克脫次氏魄體、撒白喉針桿菌辰、致咐病桌大腸纏桿菌愉、痢怖疾桿史菌、保嗜水沫氣單洲胞菌撞和艱妹難梭嫂菌等毫)；為病毒樸(HT依LV謎、H毫IV召、H堪BV欠、走HP旱VS付、E點(diǎn)V、峰CM鉤V、貧EB李V、草HS頭V，麻疹術(shù)病毒碰、輪潤(rùn)狀病筐毒、綢細(xì)小藏病毒B1娘9)犯；寄生腦蟲(移瘧疾清等民)；寬人遺妙傳病躍(Le弱sh狀-N童yh宵an綜合炎癥、拼地貧昆、血錄友病澆、BM喉D、寇DM事D、囊性近纖維敵化等啞)免疫倉學(xué)：HL材A分裂襪；T細(xì)胞棍受體鳴或抗淚體多榆樣化著的定稍性；友自身舉免疫閉病基鋼因作煤圖；下淋巴利因子揚(yáng)定量人類鍛基因貸組工次程：用散喪布重愚復(fù)序娘列產(chǎn)娛生DN珠A標(biāo)志沃；遺駝傳圖肥譜的奏構(gòu)建稱(檢仆測(cè)DN耕A、多態(tài)凍性或巖精子屑繪圖演)；局物理健圖譜佩的構(gòu)冠建；損測(cè)序況，表漿達(dá)圖福譜法醫(yī)咳：犯罪勉現(xiàn)場(chǎng)競(jìng)標(biāo)本池分析批；HL哥A-技DQ腫瘤裙：胰癌畜、結(jié)飲腸癌六、肺睜癌、經(jīng)甲狀開腺癌嘩、黑膨色素除瘤、街血液武惡性晃腫瘤組織膏和群提體生環(huán)物學(xué)伐：遺傳在聚類話研究侍；動(dòng)餡物保綱護(hù)研刪究；辱生態(tài)師學(xué)；待環(huán)境橡科學(xué)牌；實(shí)脊驗(yàn)遺箱傳學(xué)