細(xì)胞凋亡與免疫

關(guān)于細(xì)胞凋亡與免疫第1頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三2引言☆細(xì)胞凋亡是一種普遍存在的生物學(xué)過(guò)程，它與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化都是最重要的生命現(xiàn)象，正是由于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞調(diào)亡的相互聯(lián)系、相互制約的關(guān)系，才保證了生物體的正常發(fā)育?！钫５蛲鲞^(guò)程受阻或某種原因所致不正常的細(xì)胞凋亡，都會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)病癥。因此對(duì)細(xì)胞凋亡的研究有助于某些疾病的闡明與治療?！罴?xì)胞凋亡的研究是近年來(lái)生命科學(xué)中發(fā)展起來(lái)的熱點(diǎn)課題。早期基于形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)，近期則是基于分子生物學(xué)技術(shù)從基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究。第2頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三3主要內(nèi)容細(xì)胞凋亡概述（基本概念、意義、

生物學(xué)特征、調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞等）細(xì)胞凋亡與免疫生理細(xì)胞凋亡與免疫病理細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡研究相關(guān)展望第3頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三一細(xì)胞凋亡概述1.基本概念及生物學(xué)意義：

凋亡（apoptosis）一詞于1972年Kerr（英國(guó)阿伯丁大學(xué)病理學(xué)教授）引入，是一個(gè)希臘語(yǔ)合成詞,原意指花瓣或樹葉的自然脫落（Apo脫落＋ptosis飄零=Apoptosis）。

基本概念：細(xì)胞凋亡是一個(gè)“形態(tài)學(xué)”概念，是對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察的基礎(chǔ)上得出的特指一種由基因控制、形態(tài)學(xué)特征與壞死截然不同的自主性細(xì)胞死亡方式。第4頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三1972年，Kerr,Wylle和Curry在許多正常組織中觀察到一種與經(jīng)典的細(xì)胞壞死形態(tài)特征不同的現(xiàn)象：細(xì)胞收縮、細(xì)胞碎片、散在不完整細(xì)胞等，據(jù)此，他們首次提出apoptosis一詞。國(guó)內(nèi)常譯為細(xì)胞凋亡、細(xì)胞凋落、細(xì)胞凋謝、細(xì)胞衰亡等，多數(shù)學(xué)者傾向于“細(xì)胞凋亡”。強(qiáng)調(diào)這一過(guò)程是一種自然的生理學(xué)過(guò)程。第5頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三6

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。細(xì)胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地關(guān)系。大多數(shù)情況下程序性細(xì)胞死亡是以凋亡的方式進(jìn)行，但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式。第6頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三如煙草蛾節(jié)間肌肉細(xì)胞、哺乳動(dòng)物某些神經(jīng)元和紅細(xì)胞，它們的程序性死亡是以非凋亡的方式進(jìn)行。有時(shí)由外源性理化因子刺激誘發(fā)的細(xì)胞死亡，形態(tài)上似凋亡，但并不是由細(xì)胞內(nèi)原裝程序所引發(fā)，也不能稱為程序性細(xì)胞死亡（如放療后腫瘤組織壞死等）。

因此細(xì)胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡第7頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三8細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義：近年來(lái)對(duì)細(xì)胞凋亡的研究日漸重視，現(xiàn)代研究結(jié)果表明：細(xì)胞凋亡不僅是認(rèn)識(shí)細(xì)胞死亡過(guò)程的基礎(chǔ)，而且在胚胎發(fā)育、造血、免疫、乃至腫瘤形成中都有極為重要的作用。

1.確保正常的生長(zhǎng)發(fā)育(development)：清除無(wú)用、多余的細(xì)胞。2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(maintenanceofhomeostasis)：清除受損、突變或衰老的細(xì)胞。3.發(fā)揮積極的防御功能(defensereaction)：清除病毒感染細(xì)胞等對(duì)機(jī)體有害的細(xì)胞。第8頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三

Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis.

Tissueremodeling.第9頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三

Theresorptionofthetadpoletailatthetimeofitsmetamorphosisintoafrogoccursbyapoptosis.Eliminationoftransitoryorgansandtissues.

第10頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三第11頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三細(xì)胞凋亡參與皮膚更新第12頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三第13頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三142.細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)變化生物化學(xué)變化

胞內(nèi)Ca++濃度增高

DNA片段化大分子的合成(凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)及RNA合成）

tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達(dá)到較高的水平。一種依賴鈣離子的酶，當(dāng)?shù)蛲銎鹗紩r(shí)，Ca++濃度上升，從而使tTG活化。其作用是保持凋亡小體的完整性，防止有害物質(zhì)的逸出。第14頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三15MorphologicalChanges(細(xì)胞生物學(xué)詳講)第一階段：胞體縮小與周圍細(xì)胞失去聯(lián)系，細(xì)胞器變致密，核體積縮小，核仁消失，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)表面下，形成新月形致密小塊。第二階段：染色體斷裂，核膜與細(xì)胞膜均內(nèi)陷，包裹胞內(nèi)成分(胞漿、細(xì)胞器、碎裂的染色質(zhì)及核膜)形成“泡”樣結(jié)構(gòu)，此為“凋亡小體”。最后，整個(gè)細(xì)胞均裂解成這種“小體”。第三階段：凋亡小體被鄰近的巨噬、上皮細(xì)胞等識(shí)別、吞噬、消化。上述三個(gè)階段維持時(shí)間很短，通常在幾分鐘、十幾分鐘內(nèi)即可完成。第15頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三16細(xì)胞凋亡時(shí)的形態(tài)學(xué)變化第16頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍

單個(gè)細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減少、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無(wú)明顯變化腫漲破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無(wú)后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式17第17頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三18第18頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三19第19頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三20DNA'ladderDNAfragmentationchromatinDNAcorehistonenucleosome180bpendonucleolytic第20頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三213.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和抑制因素物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等；化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子（TNF）等。

DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑等。

第21頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三224.免疫相關(guān)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)接受凋亡信號(hào)凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)第22頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三23免疫相關(guān)的凋亡信號(hào)途徑死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑線粒體途徑顆粒酶B途徑(CTL特有)第23頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三24死亡受體通路、線粒體通路第24頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三25其中膜受體和線粒體途徑均通過(guò)激活含半胱氨酸的天冬氨酸酶（Caspase）剪切胞內(nèi)底物（Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過(guò)程），導(dǎo)致凋亡特有的生化和形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞凋亡涉及的共同通路第25頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三26Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽鍵，因此又稱之為Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的詞頭)細(xì)胞凋亡涉及的共同通路第26頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三27第27頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三28Caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類ICE亞類Caspase蛋白酶：ICE是單核細(xì)胞來(lái)源的參與成熟的一種蛋白酶，參與凋亡但不起主要作用；

Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11

Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡啟動(dòng)亞類Caspase蛋白酶（上游Caspase）：

Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶（下游Caspase）：

Caspase3，Caspase6，Caspase7第28頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三29

Caspase家族的特點(diǎn)：以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和異源活化,活化后形成四聚體的蛋白水解酶，發(fā)揮生物學(xué)作用C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn)

第29頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三30Caspase活化機(jī)制：

Caspase的活化是有順序的多步水解的過(guò)程，雖然分子各異，但是它們活化的過(guò)程相似。首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體,第30頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三31第31頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三32凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)：包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，然后，這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬。破壞細(xì)胞抗凋亡因素破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase的效應(yīng)機(jī)制第32頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三33破壞細(xì)胞抗凋亡因素正?；罴?xì)胞內(nèi)核酸酶處于無(wú)活性狀態(tài)。這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起（如抑制物被破壞，核酸酶即可激活，引起DNA片段化）?，F(xiàn)知caspase可以剪切裂解這種抑制物而激活核酸酶，因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activateddeoxyribonuleaseCAD），而把它的抑制物稱為ICAD。有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性，因而ICAD對(duì)CAD的活化與抑制是必需的。

第33頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三34破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)：如裂解核纖層

核纖層（Lamin）是由核纖層蛋白通過(guò)聚合作用而連成頭尾相接的多聚體，由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)（chromatin）得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解，從而使核纖層蛋白崩解，導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。第34頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三35影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能Caspase可作用于多種與DNA、RNA功能有關(guān)的蛋白：如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。由于DNA的作用，這些蛋白功能被抑制，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。第35頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三364.1

死亡受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(1).參與死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：（死亡結(jié)構(gòu)域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

TNF+TNFRI（死亡結(jié)構(gòu)域）+TRADD細(xì)胞凋亡FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白

FasL+Fas（死亡結(jié)構(gòu)域）+FADD細(xì)胞凋亡RIP：受體相互作用蛋白CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白第36頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三37(2).死亡受體通路受體多聚化和構(gòu)像改變死亡受體/配體/FADD/Caspase8或10+FADDFASL+FAS凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物（DISC）胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個(gè)復(fù)合物上細(xì)胞有足夠caspase8細(xì)胞caspase8濃度不夠死亡受體活化，細(xì)胞凋亡切割BidtBid從胞質(zhì)到線粒體CtyC釋放線粒體途徑第37頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三38FasL//Fas第38頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三39(3).死亡受體途徑的調(diào)控機(jī)制FLIP

[FADD-like-IL-1β-converting-enzyme(FLICE)inhibitoryprotein]

近年發(fā)現(xiàn)的含DED的凋亡抑制蛋白廣泛存在于真核生物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和病毒中包括：病毒基因編碼的FLIP(v-FLIP)

細(xì)胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPL

功能：抑制Caspase8結(jié)合到DISC上，從而抑制起始Caspase激活。第39頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三404.2線粒體途徑(1).基本環(huán)節(jié)：釋放caspase活化因子細(xì)胞色素C：細(xì)胞色素C+Apaf-1+caspase9凋亡體AIF（凋亡誘導(dǎo)因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子第40頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三41(2).線粒體通路第41頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三42(3).線粒體通路的調(diào)控機(jī)制Bcl-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2）

因該家族成員可通過(guò)改變外膜通透性而調(diào)控線粒體活化，故該途徑也稱為Bcl-2介導(dǎo)的線粒體途徑。

Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員，所有Bcl-2家族成員均含有1個(gè)或多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域。

第42頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三43根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為兩類：抗凋亡/促增殖成員：包括Bcl-2、Bcl-xl等。

機(jī)制：可阻止線粒體外膜通透化，從而阻止細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡。促凋亡成員：包括Bid、Bim、Bad等“BH3only”蛋白質(zhì)和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白質(zhì)機(jī)制：影響APAF1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能第43頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三44第44頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三45第45頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三46IAP（inhibitorofapoptosis，細(xì)胞凋亡抑制因子）

IAP超家族的成員較多，共同的特征是含有一個(gè)或多個(gè)７０個(gè)氨基酸的重復(fù)序列（BIR），類似于zinc指狀的結(jié)構(gòu)。

BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對(duì)caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導(dǎo)caspase-３和-７的泛素化降解作用。第46頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三47第47頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三48(3)Smac/Dablo

在細(xì)胞凋亡過(guò)程中它可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個(gè)新的N基端,這個(gè)N基端的前面4個(gè)氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合。

Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合。Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對(duì)胱解酶9的抑制，促進(jìn)凋亡。第48頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三49(4)AIF(apoptosis-inducingfactor)EndoG

兩者均由線粒體釋放，可以非Caspase依賴方式介導(dǎo)染色質(zhì)的濃集和DNA片段化，促進(jìn)凋亡。第49頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三50

顆粒酶B途徑凋亡顆粒酶B屬絲氨酸蛋白酶可作用于底物的天冬氨酸殘基位點(diǎn)是CTL殺傷靶細(xì)胞的主要效應(yīng)分子。機(jī)制:(1)顆粒酶B直接剪切并激活Caspase-3,后者作用于胞內(nèi)底物介導(dǎo)凋亡

(2)顆粒酶B剪切Bid而產(chǎn)生tBid,后者與Bax轉(zhuǎn)位于線粒體，介導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。第50頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三51細(xì)胞凋亡發(fā)生于在淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育成熟及增殖和行使免疫學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程中；細(xì)胞凋亡在免疫系統(tǒng)成熟、受體多樣性選擇以及免疫自穩(wěn)等方面均有重要作用；研究免疫系統(tǒng)凋亡機(jī)制將為探討包括腫瘤、自身免疫病、艾滋病等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理進(jìn)而發(fā)展有效的防治方案提供依據(jù)。二細(xì)胞凋亡與免疫生理第51頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三52二細(xì)胞凋亡與免疫生理1.細(xì)胞凋亡與T細(xì)胞（1）凋亡與T細(xì)胞在胸腺的分化發(fā)育：第52頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三53（2）凋亡與成熟T細(xì)胞：活化T細(xì)胞表面高表達(dá)fas及fasL。AICD1.細(xì)胞凋亡與T細(xì)胞第53頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三542.細(xì)胞凋亡與B細(xì)胞（1）凋亡與骨髓中B細(xì)胞發(fā)育：（2）凋亡與成熟B細(xì)胞第54頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三553.細(xì)胞凋亡與淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用：有胞毒作用的淋巴細(xì)胞主要有CTL、NK、LAK細(xì)胞等。它們產(chǎn)生效應(yīng)的機(jī)制相似：Ca+內(nèi)流→釋放穿孔素→6-16nm孔→靶細(xì)胞死亡

靶細(xì)胞凋亡↑顆粒酶（絲氨酸酶）→激活caspase←TNF相關(guān)蛋白↑

Tc高表達(dá)FasL第55頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三三細(xì)胞凋亡與免疫病理細(xì)胞凋亡不足及細(xì)胞凋亡過(guò)度都會(huì)造成疾病20040481proliferationapoptosishomeostasis

time第56頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三57與凋亡不足有關(guān)的疾病與凋亡過(guò)度有關(guān)的疾病1腫瘤1AIDS濾泡型淋巴瘤2神經(jīng)變性疾病激素依賴性腫瘤（乳瘤）巴金森氏病2自身免疫病色素性視網(wǎng)膜炎系統(tǒng)性紅斑狼瘡3再生障礙性貧血免疫介導(dǎo)的腎小球腎炎4缺血性損傷3病毒感染心肌梗死，中風(fēng)皰疹病毒，腺病毒5酒精中毒性肝病57凋亡不足與過(guò)度并存：動(dòng)脈粥樣硬化（內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過(guò)度，血管平滑肌細(xì)胞凋亡不足）第57頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三58針對(duì)疾病種類的不同，可以通過(guò)抑制或者增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的措施治療有關(guān)的疾?。?誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡治療因凋亡受抑而致的疾病放療和化療能激活腫瘤自殺程序，導(dǎo)致瘤細(xì)胞凋亡。改變細(xì)胞凋亡狀態(tài)用于疾病治療的許多措施尚屬試用階段。一個(gè)十分誘人的設(shè)想是基因治療——通過(guò)載體導(dǎo)入凋亡相關(guān)基因干預(yù)細(xì)胞的凋亡調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。2抑制細(xì)胞凋亡治療因凋亡過(guò)量而致的疾病

神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，可以延緩神經(jīng)元凋亡。第58頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三59四細(xì)胞凋亡研究方法形態(tài)學(xué)方法生物化學(xué)方法免疫學(xué)方法組織化學(xué)方法分子生物學(xué)方法第59頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三60第60頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三611.形態(tài)學(xué)方法1）

光學(xué)顯微鏡觀察

樣品涂片或組織切片經(jīng)常規(guī)處理、HE染色后,即可放在油鏡下觀察。該方法簡(jiǎn)便,缺點(diǎn)是只有在發(fā)現(xiàn)了具有特征性的凋亡小體時(shí)才能確定為熒光結(jié)果陽(yáng)性,因而不易檢出早期的凋亡細(xì)胞,而且某些類型的細(xì)胞壞死(如凝固性壞死)與細(xì)胞凋亡形態(tài)相似,兩者不易區(qū)分。因此,該方法只能作為細(xì)胞凋亡初步推測(cè)的手段。第61頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三62第62頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三631.形態(tài)學(xué)方法2）熒光顯微鏡觀察：熒光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙錠(EB)等染色,在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核改變和凋亡小體的形成。這種方法適用于對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞懸液的檢測(cè),組織脫蠟切片經(jīng)RNA酶作用后也可用此法染色觀察。熒光顯微鏡檢查法方便易行,現(xiàn)已成為細(xì)胞凋亡檢查的常用手段。第63頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三64

Onthisslidetheeasiestandhistoricallyfirstwayofidentifyingapoptoticcellsisshown.InthisassaythebluefluorescentdyeDAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindoledihydrochloride)hasbeenused,whichspecificallystainsDNA.

第64頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三65

1.形態(tài)學(xué)方法3）透射電子顯微鏡觀察：凋亡細(xì)胞在電子顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體增多,細(xì)胞膜微絨毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小體。超微結(jié)構(gòu)觀察是診斷細(xì)胞凋亡最可靠的方法。但該法只能定性,不能定量,而且觀察到凋亡小體的幾率也不高,在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí),凋亡小體可能很快被巨噬細(xì)胞吞噬清除,而不易觀察到;此外,用電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡,樣品制備步驟繁瑣、耗時(shí)、昂貴。第65頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三66第66頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三671.形態(tài)學(xué)方法4）共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)：共聚焦激光掃描顯微鏡是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型儀器,是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理,使紫外光和可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針,從而得到清晰的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。該方法能用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析,而且還能對(duì)凋亡細(xì)胞內(nèi)的大分子進(jìn)行定位。第67頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三682.生物化學(xué)方法：（1）典型的細(xì)胞凋亡顯示出DNA梯形電泳圖譜：細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180～200bp長(zhǎng)的DNA片段或整數(shù)倍的寡核苷酸片段。凋亡細(xì)胞經(jīng)處理后,采用常規(guī)方法分離提純DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色,在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜,而壞死細(xì)胞電泳后呈模糊的涂片狀第68頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三69細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

（自趙允、翟中和）第69頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三70第70頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三712.生物化學(xué)方法：（2）原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)：

凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活，核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)(缺口)，暴露出大量3’末端，如用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)將標(biāo)記的-dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記，則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞。第71頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三72

2.生物化學(xué)方法：

由DNA片段末端標(biāo)記技術(shù)發(fā)展而成的TUNEL法[terminadeoxynucleotibyltransferase(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabelling,TUNEL]及試劑盒化,使細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)在諸多領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用。第72頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三73TUNEL法原理

1.細(xì)胞凋亡其斷裂DNA斷端3′-OH暴露(壞死細(xì)胞DNA斷裂是無(wú)規(guī)則的,其中也有少數(shù)可出現(xiàn)3′-OH的暴露,但數(shù)量極微弱,不易檢測(cè)出來(lái));

2.在末端DNA轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下,在無(wú)需模板的情況下,可進(jìn)行3′端的DNA合成;

3.如果在反應(yīng)體系中加入標(biāo)記的DNA,則在3′端出現(xiàn)一段帶有標(biāo)記物的寡核苷酸,通過(guò)熒光顯示或其他顯色反應(yīng),可以原位地較特異地顯示發(fā)生凋亡的細(xì)胞。第73頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三74TUNEL法優(yōu)點(diǎn):①特異性:該法用生化方法特異地標(biāo)記凋亡細(xì)胞,可以將凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和活細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。凋亡細(xì)胞顯示增強(qiáng)的熒光,而壞死細(xì)胞和活細(xì)胞均不著染熒光。②敏感性:TUNEL法可用于只有極少細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。③可定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡。第74頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三75TUNEL法優(yōu)點(diǎn):④適用于形態(tài)研究:用TUNEL法標(biāo)記細(xì)胞可動(dòng)態(tài)觀察凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。⑤適用性較廣:可用于石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離細(xì)胞的凋亡情況檢測(cè)。⑥TUNEL法檢測(cè)快速,其反應(yīng)過(guò)程僅需3h。第75頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三76第76頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三77第77頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三78缺點(diǎn):①只能標(biāo)記中期及晚期的凋亡細(xì)胞。②不能檢測(cè)只發(fā)生DNA大片段(300000bp)斷裂的凋亡細(xì)胞。③不能檢測(cè)DNA斷裂末端的準(zhǔn)確數(shù)量,因?yàn)槊總€(gè)末端結(jié)合的標(biāo)記分子的數(shù)量可因反應(yīng)動(dòng)力學(xué)而不同。④若樣品處理不當(dāng),易形成假陽(yáng)性,影響結(jié)果判斷。第78頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三793.免疫學(xué)方法(ELISA法)

利用“夾心酶標(biāo)免疫測(cè)定法”的原理,核小體DNA由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解，用抗組蛋白（或抗DNA）-過(guò)氧化物酶（或生物素化的抗體）結(jié)合到核小體，通過(guò)酶標(biāo)儀分析,可定量反映細(xì)胞凋亡水平。第79頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三80核小體酶底物第80頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三81ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是:靈敏度高,操作快捷,無(wú)放射性同位素污染,可定量測(cè)定細(xì)胞凋亡,無(wú)需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞,所用抗體不具有種屬特異性,酶標(biāo)記的抗DNA抗體可與單鏈和雙鏈的DNA起反應(yīng)。夾心法可以測(cè)定核小體單體和寡聚核小體，因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動(dòng)物組織細(xì)胞的凋亡檢測(cè)。第81頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三824.組織化學(xué)方法：細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白分析:如p53蛋白、c-myc、Fas、Bcl-2家族蛋白等。測(cè)定方法主要有流式細(xì)胞儀檢測(cè)法、蛋白印跡法及免疫組織化學(xué)染色法等。第82頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三835.分子生物學(xué)方法：

PCR是檢測(cè)凋亡特異性基因的常用方法。

PCR被用來(lái)擴(kuò)增凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的DNA片段,當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)的DNA梯形條帶不明顯時(shí),用PCR擴(kuò)增后再電泳可見(jiàn)明顯的梯形圖譜；

RT-PCR被用來(lái)檢測(cè)Bcl-2和caspase表達(dá)；熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平更快更準(zhǔn)確。此外,將PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合,能顯著提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。第83頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三846.流式細(xì)胞分析術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)第84頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三85

亞“G1”峰檢測(cè)法:處于增殖周期中的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)相(G0／Gl、S、G2／M)，其DNA含量分布在2n—4n之間。發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在酒精固定后用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過(guò)胞膜而丟失，僅剩下大片段DNA，這些失去部分DNA含量的細(xì)胞，在DNA染色后，形成一個(gè)DNA含量<2n(即<G1期細(xì)胞)的分布區(qū)，稱為“亞G1峰”。6.流式細(xì)胞分析術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)第85頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三86第86頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三877.細(xì)胞凋亡的其它檢測(cè):PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測(cè):

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V(Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白)能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、R-PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)：

CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通過(guò)熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測(cè)凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來(lái)檢測(cè)凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。第87頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三88細(xì)胞色素C的定位檢測(cè)：通過(guò)Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。線粒體膜電位變化的檢測(cè)：端粒酶檢測(cè)：mRNA水平的檢測(cè)：蛋白印跡法:檢測(cè)細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白分析:如caspase、Fas家族蛋白等.7.細(xì)胞凋亡的其它檢測(cè):第88頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三89

細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)存在的問(wèn)題

（1）細(xì)胞凋亡的判斷標(biāo)準(zhǔn):目前,檢測(cè)細(xì)胞凋亡的許多方法的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)不一。形態(tài)學(xué)檢查是其他各種檢測(cè)方法的基礎(chǔ),任何方法的檢查結(jié)果必須結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查來(lái)判斷。梯帶狀圖像并不必然與細(xì)胞凋亡相關(guān);TUNEL法在壞死細(xì)胞群中也可出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。第89頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三90（2）細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果分析:

在一個(gè)檢測(cè)體系中檢出了發(fā)生凋亡的細(xì)胞,生理性還是病理性，需進(jìn)行致病因素的相關(guān)性分析.

細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)存在的問(wèn)題

第90頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三91

細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)存在的問(wèn)題

（3）細(xì)胞凋亡的定量分析：定量分析包括2個(gè)方面,一是群體細(xì)胞凋亡的定量,二是細(xì)胞凋亡程度的定量。目前,流式細(xì)胞儀常用作群體細(xì)胞凋亡的定量分析,但在檢測(cè)中的漏檢率和錯(cuò)檢率都很高。TUNEL法雖可進(jìn)行群體定量,但工作量大,同時(shí)易出現(xiàn)壞死細(xì)胞的假陽(yáng)性。第91頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三92展望第92頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三93☆現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展動(dòng)態(tài)

細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)(包括分子遺傳學(xué)與生物化學(xué))相互滲透與交融是總的發(fā)展趨勢(shì)。

（細(xì)胞凋亡研究所處的地位）第93頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三94生命科學(xué)的研究從宏觀上可以分為

三個(gè)層次：

核心層次（包括分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)學(xué)科）

個(gè)體生物學(xué)層次（對(duì)多個(gè)物種及種群的結(jié)構(gòu)及功能研究）生物圈層次。無(wú)論是對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，還是對(duì)細(xì)胞重大生命活動(dòng)規(guī)律的探索，都需要用分子生物學(xué)的新概念與新方法，在分子水平上進(jìn)行研究，換句話說(shuō)，細(xì)胞分子生物學(xué)或分子細(xì)胞生物學(xué)將是今后相當(dāng)一段時(shí)間的主流。第94頁(yè)，講稿共102頁(yè)，2023年5月2日，星期三952007年《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)