熒光顯微鏡的基本原理

關(guān)于熒光顯微鏡的基本原理第1頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三光學(xué)顯微鏡的基本參數(shù)主要技術(shù)參數(shù)數(shù)值孔徑NA第2頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三第3頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)：

某些物質(zhì)經(jīng)一定波長的光（如紫外光）照射后，物質(zhì)中的分子被激活，吸收能量后躍遷至激發(fā)態(tài)；當(dāng)其從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)，所吸收的能量除部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，其余較大部分則以光能形式輻射出來，由于能量沒能全以光的形式輻射出來，故所輻射出的光的波長比激發(fā)光的要長，這種波長長于激發(fā)光的可見光部就是熒光(fluorescence)。所謂熒光就是某些物質(zhì)在一定波長光（如紫外光）的照射下、在極短時(shí)間內(nèi)所發(fā)出的比照射光波長更長的可見光。第4頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三第5頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三第6頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)Themaximumexcitationandemission

wavelengthsofseveralcommonlyusedfluorescentprobesareshowninrelationtothecorrespondingcolorsofthespectrum.第7頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三熒光顯微鏡的組成1、光源：一般采用高壓汞燈2、濾色系統(tǒng)：由激發(fā)濾板和壓制濾板組成a、激發(fā)濾板：提供一定范圍的激發(fā)光b、壓制濾板：完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)濾長范圍的熒光3、反光鏡：一般采用平面反光鏡4、聚光鏡：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物鏡和目鏡第9頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三Theopticalsystemofafluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroicmirror(beam-splitting2)第10頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三熒光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。2、溴化乙錠（EB）:染色DNA和RNA。3、熒光素雙醋酸酯(FDA)：FAD本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。4、熒光染料Ho33342和羅丹明123:Ho33342能與細(xì)胞中DNA進(jìn)行特異的結(jié)合，羅丹明123能與線粒體進(jìn)行特異的結(jié)合。第12頁，講稿共14頁，2023年5月2日，星期三熒光組化實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題1、每種熒光染料，均有自己的最適pH值，此時(shí)熒光最強(qiáng)。當(dāng)pH改變時(shí)，不僅熒光強(qiáng)度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時(shí)要在一定的pH值的緩沖液中進(jìn)行。2、一放熒光染色在20。C以下時(shí)熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。3、在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強(qiáng)而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長波長光進(jìn)行觀察，需照相時(shí)再適當(dāng)增強(qiáng)激發(fā)光。4、一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標(biāo)本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強(qiáng)度可隨熒光素的濃度增加而增強(qiáng)，但超過限度，熒光強(qiáng)