熒光素酶報告實驗(共3篇)

1/1熒光素酶報告實驗(共3篇)熒光素酶報告實驗第1篇轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達起抑制或增強的調(diào)控作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒灳褪菣z測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。

熒光素酶（Luciferase）：是能夠催化底物氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱。

熒光素酶的種類很多，其中應(yīng)用較為廣泛的是螢火蟲熒光素酶（Fireflyluciferase，F(xiàn)LUC）和海腎熒光素酶（Renillaluciferase，RLUC）

在ATP、Mg2+、O2存在的條件下，蟲熒光素在蟲熒光素酶的催化下氧化發(fā)光，發(fā)光顏色為黃綠色。

Luciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素（luciferin）為底物來檢測螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase）活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin被氧化成oxyluciferin的反應(yīng)，在luciferin被氧化的過程中會發(fā)出生物熒光，然后可以通過儀器測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。

例如，我們想要研究某個轉(zhuǎn)錄因子是否能與某一靶啟動子片段有作用。

（1）在質(zhì)粒中，將靶啟動子（或其他要研究的基因調(diào)控元件）插入到熒光素酶報告基因前方，構(gòu)建成報告基因質(zhì)粒。

（2）將可以表達要檢測的轉(zhuǎn)錄因子的質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。

（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

同時，為了減少內(nèi)在的變化因素（如：培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等)對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因(Rinillaluciferase的質(zhì)粒(pRL-TK)作為對照質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試結(jié)果不受實驗條件變化的干擾。

在測量過程中，當(dāng)加入熒光素酶檢測試劑Ⅱ(LARII)時產(chǎn)生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶報告基因。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo?試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應(yīng)，同時進行第二次測量

熒光素酶報告基因的優(yōu)點

◆蛋白不需要翻譯后加工，所以一旦翻譯立即產(chǎn)生報告活性。

◆在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，因而非常靈敏。另外，在宿主細胞及檢測試劑中均檢測不到背景發(fā)光。

◆高效，檢測快速，每個樣品只需幾秒鐘。

熒光素酶報告實驗第2篇熒光素酶報告基因檢測是以熒光素（luciferin）為底物來檢測螢火蟲熒光素酶（FireflyLuciferase）活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光（bioluminescence），可通過熒光測定儀設(shè)備測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于miRNA靶基因驗證及啟動子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等方向研究。

利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調(diào)控元件的影響。

雙熒光素酶通常是指螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶。螢火蟲熒光素酶是從甲蟲（Photinuspyralis）中分離得到，分子量為61kDa；海腎熒光素酶（RenillaLuciferase）則是從海腎（Renillareniformis）中分離，分子量為36kDa。

熒光素酶報告實驗第3篇·Day1種細胞于24孔板

·Day2病毒感染（根據(jù)實驗加入一定量的miRNA-Ctrl/miRNA-OE）

·Day3Report質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（以24孔板一個孔為例，實驗時可配置成Mix逐孔加入以減少誤差）:

25ulopti-MEM+300ngplasmid+10ngpRL-CMV

25ulopti-MEM+lip20XX

6h后換液

（實驗分組可參考下圖，每個組可以設(shè)置3個重復(fù)孔）

·Day4雙報告基因檢測

（1）1XcoldPBS清洗一遍，加入80-100ullysisbuffer（buffer用量可以根據(jù)細胞量進行調(diào)整）；

（2）在搖床上冰上被動裂解30min；

（3）4℃，120XXrpm離心10min；

（4）吸取上清10ul于luciferase專用96孔板；

（5）依次加入50ulFir