小麥成熟胚培養(yǎng)及耐鹽突變體的篩選

小麥成熟胚培養(yǎng)及耐鹽突變體的篩選葉校成［淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2009級(jí)生物工程］摘要：［目的］利用小麥成熟胚培養(yǎng)技術(shù)獲得愈傷組織以實(shí)現(xiàn)其耐鹽突變體的篩選，并且提高小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率。［方法］以煤生0308為材料，用正交試驗(yàn)的方法研究6-BA、KT、2,4-D3種營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)小麥愈傷的影響。［結(jié)果］表明2,4-D的濃度對(duì)愈傷的影響最大，6-BA對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響最小，KT的影響介于二者之間。由正交分析結(jié)果可以得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：MS+2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.8%。關(guān)鍵詞：小麥愈傷組織成熟胚正交法耐鹽突變體StudyonCultureofMatureEmbryofromWheatandScreeningofSalt-tolerant

MutantsYeXiaoCheng[BiologicalEngineeringLevel2009ofHuaiBeiNormalUniversityLifeScience

College]Abstract：[objective]Theuseofwheatembryoculturetechnologyformaturecallustoachievetheirsaltresistancemutantsselection,andimprovingwheatmatureembryocallusinductionrate.[method]Tocoalborn0308formaterial,usingtheorthogonalexperimentmethod,thestudyof6-BA、KT,2,4-D3kindofnutrientstotheinfluenceofwheatinjury.[result]Theresultshowsthattheconcentrationof2,4-dontheinjurythemostinfluence,6-tominimalimpactontheBA,theinfluenceofKTbetweentwocomposes.Byorthogonalanalysisresultscanbeconcludedthattheoptimalmediumformula:MS+2,4-d0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+sugar3%+0.8%AGAR.Keywords:wheat callusmatureembryoorthogonalmethodtosaltmutant.、仁?前言小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，小麥成熟胚具有取材方便、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于小麥組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究，可望取代幼胚成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的方便受體。中國鹽堿地分布面積廣，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量，因此小麥耐鹽突變體的篩選隊(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分重要。近年來，小麥組織培養(yǎng)一直受到廣泛關(guān)注，以小麥幼胚，幼穗，葉片，根等外植體進(jìn)行培養(yǎng)都成功獲得了再生植株。為了提高小麥成熟胚的出愈率和植株再生率，人們做了不少研究，而小麥成熟胚具有良好再生能力，種子保存期長，易獲得，可用于較長時(shí)間的研究。所以本次試驗(yàn)以小麥的成熟胚為外植體源，3種激素九種不同激素配比的培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)研究。1、材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1植物材料小麥煤生03081.1.2試驗(yàn)器具超凈工作臺(tái)、鑷子、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶、記號(hào)筆、打火機(jī)1.2試驗(yàn)方法1.2.1材料的預(yù)處理將小麥種子浸泡在水中1天，試驗(yàn)操作前，將種子放在燒杯中用流水沖洗30min以上。1.2.2試驗(yàn)操作將盛有泡好的種子的燒杯轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，向燒杯中加入75%乙醇，浸泡40S后，倒出乙醇；再向燒杯加入0.1%的升汞，浸泡8min，倒出升汞，使用無菌水沖洗3到5次，每次5min左右后放入培養(yǎng)皿備用。1.2.3培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件1.1.2培養(yǎng)基各種培養(yǎng)基的激素濃度如表1所示:表1、培養(yǎng)基激素濃度2,4-D(mg/L)KT(mg/L)6-BA(mg/L)9-10009-200.50.59-301.01.09-40.500.59-50.50.51.09-60.51.009-71.001.09-81.00.509-91.01.00.5基本培養(yǎng)基為：MS+蔗糖3%+瓊脂0.8%（以上培養(yǎng)基PH均為5.8，在121°C下經(jīng)1.1kg/cm高壓濕熱滅菌15min）溫度25C左右的溫室培養(yǎng)，每天光照14h。每周定期觀察成熟胚額培養(yǎng)情況，愈傷組織的誘導(dǎo)情況、生長情況、是否污染等，并做好統(tǒng)計(jì)。2、結(jié)果與分析2.1愈傷組織培養(yǎng)情況培養(yǎng)一周后材料表面出現(xiàn)粘膜，出現(xiàn)了愈傷組織，呈少量白色和綠色的愈傷。第二到四周后，愈傷組織更加明顯，誘導(dǎo)現(xiàn)象更明顯，呈現(xiàn)黑色，青色的愈傷組織，有些出現(xiàn)了染菌的現(xiàn)象，處理完，余下的繼續(xù)觀察培養(yǎng)。表二為接種四周后培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的材料統(tǒng)計(jì)表表2各培養(yǎng)基的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2,4-D(mg/L)KT(mg/L)6-BA(mg/L)接種數(shù)出芽數(shù)愈傷數(shù)死亡數(shù)愈傷率9-10004814102420.83%9-200.50.54617111817.74%9-301.01.0624413020.97%9-40.500.5848741088.10%9-50.50.51.0321214743.75%9-60.51.005714411571.93%9-71.001.045729864.44%9-81.00.50320151746.88%9-91.01.00.531125480.65%愈傷率=（愈傷數(shù)/接種數(shù)）X100%2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析表見表3極差記為R。R1>R2>R3,說明三個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)成熟胚培養(yǎng)的影響效果的大小為2,4-D的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響最大，KT次之，6-BA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響是最小的。2,4-D的最優(yōu)濃度為0.5mg/L；對(duì)于因素KT的最優(yōu)濃度為1.0mg/L；對(duì)于因素6-BA的最優(yōu)濃度為0.5mg/L由正交分析得出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方為MS+2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.8%。表3直觀分析表所在列因素12,4-D2KT36-BA4試驗(yàn)誤差試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)1111120.83試驗(yàn)2122217.74試驗(yàn)3133320.97試驗(yàn)4212388.1試驗(yàn)5223143.75試驗(yàn)6231271.93試驗(yàn)7313264.44試驗(yàn)8321346.88試驗(yàn)9332180.65均值119.84757.79046.54748.410均值267.92736.12362.16351.370均值363.99057.85043.05351.983極差48.08021.72719.1103.5732.3 由直觀分析表做出的效應(yīng)曲線圖見表4隨著2,4-D濃度的增加，誘導(dǎo)率先上升后下降，說明2,4-D的最適濃度在0.5mg/L附近，在研究范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中KT濃度的升高，誘導(dǎo)率先降

低再升高，說明KT的最適濃度在1.0mg/L之后，隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)率先上升后下降，最高點(diǎn)在0.5mg/L。當(dāng)實(shí)驗(yàn)低于這個(gè)值的時(shí)候，誘導(dǎo)率隨著其濃度增加增加，高于此值時(shí)候，誘導(dǎo)率隨濃度的增加而減少，因此0.5mg/L是最適合的值對(duì)于2,4-D和6-BA。而KT的存在對(duì)培養(yǎng)基影響不大。表4效應(yīng)曲線圖2.4 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出的方差分析表見表5將偏差平方和記為S。F比(2,4-D)>1，F(xiàn)比(KT)VI，F(xiàn)比(6-BA)V1，F(xiàn)比(試驗(yàn)誤差)V1，利用正交小助手的幫助下分析，生長物質(zhì)的影響對(duì)小麥愈傷組織的誘導(dǎo)率都不是太顯著，只有2,4-D在KT)>S(6-BA)>S(試驗(yàn)誤差)可知，因素影響的主次順序?yàn)?,4-D0.5mg/L的時(shí)候?qū)π←溄M織的誘導(dǎo)率是最高的。在適當(dāng)?shù)臈l件下，包括預(yù)處理，時(shí)間，溫度對(duì)小麥種子的出愈率都有好的影響。表5方差分析表因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性2,4-D4275.81822.9184.460KT941.49620.6434.4606-BA621.27620.4244.460試驗(yàn)誤差21.90620.0154.460誤差5860.5083、結(jié)論與討論本次實(shí)驗(yàn)里，利用小麥成熟胚培養(yǎng)技術(shù)獲得其愈傷組織以及實(shí)現(xiàn)耐鹽突變體的篩選，其中本實(shí)驗(yàn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法尋找最合適形成愈傷組織的因素和水平。以媒生0308為材料，討論9種培養(yǎng)基和3種激素配比對(duì)小麥成熟胚離體培養(yǎng)的影響及用紫外燈光線照射所產(chǎn)生的耐鹽突變體的篩選，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列計(jì)算及其分析，得出結(jié)論2,4-D的濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響最大，及最優(yōu)的培養(yǎng)基配方是MS+2,4-D0.5mg/L+KT1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.8%。參考文獻(xiàn)【1】賀杰;常景玲;小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生體系的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年05期【2】唐宗祥;張懷瓊;張懷渝;晏本菊;任正隆;影響小麥成熟胚形成