分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用培訓(xùn)課件

分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法近年來分子生物學(xué)技術(shù)在各個方面得到廣泛地應(yīng)用，這些技術(shù)滲透到流行病學(xué)之中，形成了一門新的分支學(xué)科—分子流行病學(xué)。分子流行病學(xué)中重要的一點是利用合適的分型方法對分離到的病原進行分析。2分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法一種方法是否能應(yīng)用于分子分型以及其分型效果如何大致可以從以下幾個方面考慮：3分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法1、分型力是指對所分析菌株能夠得到明確的陽性結(jié)果的能力。2、重復(fù)性是指當(dāng)重復(fù)測試相同菌株時能夠得到相同結(jié)果。3、鑒別能力是指區(qū)別非相關(guān)菌株的能力。理想的分型方法應(yīng)該能識別每一無關(guān)的分析菌株。4、結(jié)果易于解釋這是非常重要的。5、快速、廉價、技術(shù)簡單。4分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法腸道致病性的分型技術(shù)大致如下：1、表現(xiàn)型分型方法。抗生素敏感性噬菌體分型5分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法2、基因分型技術(shù)，A質(zhì)粒圖譜分析B以PCR為基礎(chǔ)的分型方法，如隨機擴增多態(tài)性分析法（RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）；C限制性片段長度多態(tài)性（RFLPs）的SouthernBlot分析。D脈沖場凝膠電泳方法（PFGE）。6分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法1、抗生素敏感性試驗抗生素敏感性測試是臨床微生物實驗室常規(guī)應(yīng)用的方法，手工和自動的方法都可以做到，也可以進行嚴(yán)格地質(zhì)量控制。操作簡單，相對經(jīng)濟。7分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法如果要進行詳盡的流行病學(xué)分析，抗生素敏感性試驗資料的用途就相對有限了。這不僅是因為表現(xiàn)型有變種的存在，更是因為現(xiàn)代的醫(yī)院中，存在中非常大的抗生素的選擇壓力。一個特定的菌株，可以通過多種遺傳學(xué)機制，“突然”對某種抗生素表現(xiàn)出抗性。8分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法另一方面，如果沒有特定的選擇壓力，這些遺傳元件也可以丟失（如R因子）。所以，不同的菌株可能具有相同的抗性圖譜，在患者不同時期分離到的同一種細菌菌株，也可能會表現(xiàn)出不同的抗生素敏感性圖譜。9分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法噬菌體分型分析噬菌體裂解細菌細胞具有一定的特異性。一些噬菌體只能感染一個種或?qū)俚募毦恍┦删w可以裂解同一種細菌的不同株。因此，可以利用不同噬菌體的裂解細菌細胞的特異性，可以分離、篩選一組噬菌體，用于傳染源的追蹤和菌株的分析。10分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法缺點是除了一些參比實驗室外，很少實驗室能擁有種類比較完全的噬菌體，在應(yīng)用方面受到了很大的限制。其次，噬菌體分型技術(shù)的要求比較嚴(yán)格，需要經(jīng)驗豐富的工作人員。同時，噬菌體分型常常會遇到多樣性結(jié)果，需要仔細推敲。還有，使用認(rèn)可的噬菌體，許多菌株不能獲得滿意的結(jié)果，不得不考慮使用其它噬菌體，給結(jié)果的分析帶來困難。11分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法英國把噬菌體分析和PFGE方法結(jié)合使用，對E.coliO157：H7大腸桿菌進行分型?？梢园袳.coliO157：H7大腸桿菌至少分為66個噬菌體型。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌亦可用噬菌體分型。12分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法基因分型技術(shù)質(zhì)粒圖譜方法最先應(yīng)用于流行病學(xué)研究的以DNA為基礎(chǔ)的技術(shù)就包括質(zhì)粒的分析。分別提取分離菌株的質(zhì)粒DNA，在瓊脂糖凝膠上電泳分離，測定質(zhì)粒的數(shù)目及大小。該方法簡單經(jīng)濟，易于推廣。臨床分離的E.coliO157：H7大多數(shù)菌株都含有質(zhì)粒，可以應(yīng)用質(zhì)粒圖譜法來進行分型。13分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法然而，細菌的質(zhì)粒可以自發(fā)丟失（如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌質(zhì)粒的自然丟失率在10%左右，且這種丟失是不可逆的）、獲得質(zhì)粒。還可以在細菌之間進行接合轉(zhuǎn)移，這就使得質(zhì)粒圖譜分析的結(jié)果有時候難以解釋。另一個問題是質(zhì)粒DNA構(gòu)型可能發(fā)生改變。14分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法此外，使用質(zhì)粒圖譜分析方法不能夠區(qū)分那些分子量相同而DNA序列不同的質(zhì)粒，或分子量不同而有較高同源性的質(zhì)粒。針對這一情況，人們把質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化，再用電泳分析限制性片段的數(shù)目和大小，這樣質(zhì)粒分析的可重復(fù)性和分辨力都會得到很大的提高。15分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法基于PCR的分型系統(tǒng)隨機引物PCR（AP-PCR），也就是隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RAPD）。使用那些不針對任何已知遺傳位點的短引物（通常8-10bp），可以隨機地與染色體DNA結(jié)合，并有足夠的親和力啟動聚合酶反應(yīng)。16分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法然而，在實踐中，用AP-PCR獲得可重復(fù)的高分辨力的結(jié)果還存在一定的困難。第一，如果條帶的強弱可以證明菌株之間的差異時，我們很難比較和解釋圖譜；第二，由于某些產(chǎn)物可能代表效率相對低的反應(yīng)，技術(shù)因素的微小改變就可以導(dǎo)致不同的擴增反應(yīng)中一個特定菌株產(chǎn)生的實際片段差別很大。17分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法另外一個影響RAPD可重復(fù)性的因素或許是由質(zhì)粒編碼的片段的擴增，質(zhì)粒是可以丟失或獲得的，有文獻報道質(zhì)粒的影響很小?？芍貜?fù)性差是問題，導(dǎo)致了分辨力的降低，極大地妨礙了不同實驗室之間結(jié)果的比較。一些報道提出使用固定濃度的純化DNA可以提高可重復(fù)性，從而使此方法有了較好的應(yīng)用，但操作起來很困難很煩瑣。18分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法擴增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）技術(shù)。AFLP的原理：用特異性的酶將細菌染色體組消化之后，對其消化片段進行選擇性擴增。19分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法此技術(shù)包括三個步驟：（1）將DNA酶切，并在酶切片段兩端連接上寡聚核苷酸接頭，（2）對一組限制性片段進行選擇性擴增，（3）對擴增片段進行凝膠分析。20分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法其引物是根據(jù)接頭和酶切位點的序列來確定的。由于其引物延伸至限制性片段內(nèi)部，所以只有限制性位點兩側(cè)的核苷酸序列與引物延伸端匹配的片段才能被擴增，這樣就實現(xiàn)了選擇性擴增。使用這種方法，在不知道核苷酸序列的情況下，就可以應(yīng)用PCR觀察到一組限制性片段。21分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法從理論上來講，AFLP可以應(yīng)用于所有的細菌且重復(fù)性和分辨力都好。有報道應(yīng)用于E.coliO157：H7的分子分型。他們認(rèn)為，AFLP技術(shù)可以作為E.coliO157：H7分子流行病學(xué)研究的一種方法。22分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法核糖體分型（Ribotyping）Ribotyping指一種特殊的SouthernBlot分析法。在此方法中，用與核糖體操縱單元有關(guān)的RFLP來對菌株進行分析。23分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法總的來說，核糖體分型方法穩(wěn)定、可重復(fù)。在一般情況下，來源于一個暴發(fā)的菌株有相同的核糖體型.。然而，流行病學(xué)上無相關(guān)性的菌株經(jīng)常有相同的圖譜，這就直接限制了該方法的應(yīng)用.。24分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用核糖體分型（Ribotyping）Ribotyping指一種特殊的SouthernBlot分析法。在此方法中，用與核糖體操縱單元有關(guān)的RFLP來對菌株進行分析。在國際上已有完全自動化的儀器，如美國杜邦公司生產(chǎn)的RiboPrinterMicrobialCharacterizationSystem，操作快速簡便，完全排除了人為因素對實驗結(jié)果的影響，重復(fù)性好結(jié)果穩(wěn)定。25分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用其操作過程可簡述為：將純化的細菌培養(yǎng)物用儀器自帶的取樣棒蘸取并加入樣品緩沖液中，置于熱處理器上滅活，然后加入細胞裂解液使細菌DNA釋放。按照操作程序打開儀器，將樣品和試劑放到固定的位置，該儀器便可進行如下的自動操作：酶切→電泳→轉(zhuǎn)膜，電泳和轉(zhuǎn)膜同時完成。轉(zhuǎn)好的膜與結(jié)合了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的探針結(jié)合（雜交），數(shù)碼照相系統(tǒng)通過捕獲化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，對所發(fā)出的光進行拍照，這樣我們即可得到最后的結(jié)果。26分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用我們利用這一系統(tǒng)提供的核糖體基因DNA指紋的相似度值和鑒定結(jié)果，便可進行分型。我們利用本系統(tǒng)對我國分離的部分O：3，O：9小腸結(jié)腸炎耶爾森菌進行了分型，這種分型基本上和血清型相符合（見圖）。27分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用28分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法五、脈沖電場凝膠電泳（PFGE）這一方法在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大DNA分子便滯留在爬行管里，直至沿新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子越大，這種重排所需要的時間就越長。若DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA分子就可以按其大小分開。29分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法30分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法

中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所31分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用32分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法盡管PFGE在許多病原體的分子流行病學(xué)研究中表現(xiàn)出很好的分辨能力，但是具體到應(yīng)用它本身就存在著明顯的缺點，此種方法耗時、耗力而且對設(shè)備的要求也很嚴(yán)格。況且，當(dāng)PFGE的圖形匹配得不是很好的時候，其結(jié)果依然難以解釋。況且，也不能夠僅僅以PFGE的結(jié)果為依據(jù)。33分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法在實際應(yīng)用過程中，任何單一的方法所得出的結(jié)論都具有片面性，所以，聯(lián)合應(yīng)用幾種方法是目前較為理想的分子分型方法。35分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法這其中又以PFGE與其它方法相結(jié)合的效果為最佳，先用分辨力較低的方法進行初篩，然后用分辨力較高的方法進行進一步的分型，這是目前大多數(shù)實驗室所采取的策略。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進步，會有更好的方法問世。36分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用細菌的分子分型方法我國部分地區(qū)分離到的E.coliO157:H7菌株的PFGE圖譜37分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用E.coliO157：H7的分子分型方法病人身上分離到的無毒株的E.coliO157：H7的PFGE圖譜38分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用E.coliO157：H7的分子分型方法病人身上分離到的有毒株的E.coliO157：H7的PFGE圖譜39分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用E.coliO157：H7的分子分型方法徐州地區(qū)E.coliO157:H7動物糞便分離株P(guān)FGE圖譜40分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用ICDC,ChinaCDC41分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用基因芯片的分子診斷研究基因芯片技術(shù)是90年代興起的一項前沿生物技術(shù),它可以將生物學(xué)中許多不連續(xù)的分析過程,移植到固相的介質(zhì)芯片上,并使其連續(xù)化和微型化。由于它橫跨生命信息、生物物理等眾多研究領(lǐng)域,涉及生命科學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計算機科學(xué)、統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)等諸多自然學(xué)科,故已成為當(dāng)今多學(xué)科交叉、綜合的前沿研究熱點。1雜交模型的建立現(xiàn)有病原體的分子生物學(xué)檢測方法通常需36~48小時Real-timePCR可在1h內(nèi)得到結(jié)果，但有其局限性基因芯片可同時檢測多個病原體的許多參數(shù)選擇的探針具有敏感、重復(fù)性好的雜交信號2其它實驗條件的探索和優(yōu)化42分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

基因芯片的分子診斷研究

基本的技術(shù)路線點樣以及結(jié)果分析所用的儀器設(shè)備1點樣儀SDDC-2arrayer（VIRTEK）- 0,6nlperspot(spacing=0,5mm)- 108to1013oligonucleotides/μl(~105to1010oligos/spot)2掃描儀ScanArray4000XL（GSILumonics）43分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用基因芯片的分子診斷研究探針和引物的設(shè)計與合成

引物在目的基因片段上的位置

44分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用基因芯片的診斷開發(fā)工作探針的合成、修飾及固定20mers探針，5’-端氨基修飾靶DNA的擴增與熒光標(biāo)記

dUTP-Cy3PCR產(chǎn)物的純化與測定45分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用基因芯片的分子診斷研究雜交及檢測20μl雜交混合液：6XSSPE，1%SBA，0.01%PVP，0.01%SDS，25%Formamide13mmHybri-wellchamber芯片的清洗和干燥熒光掃描以及結(jié)果分析（ScanArray4000XL，QuantArraysoftware）46分子分型方法在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用基因芯片的分子診斷研究其它實驗條件的探索和優(yōu)化

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簡易芯片的制作功能化的芯片比較昂貴（1~10$/片），Kumaretal(NucleicAcidsRes28:e71,2000)等人報告了一種方法，可以把普通顯微鏡用載玻片經(jīng)3-mercaptopropyl-trimethoxysilane活化后，與5‘-末端巰基(-SH)修飾的寡核苷酸直接結(jié)合，將捕獲探針固定在載玻片上，此方法具有簡單、快速、背景干擾小等優(yōu)點。

2化學(xué)發(fā)光法檢測的探索通常，基因芯片的結(jié)果是通過數(shù)字化的激光掃描儀對熒光信號進行讀取和分析的，如Cy3,Cy5,Alexa594等。但熒光掃描儀價格昂貴而且我們的實驗表明該技術(shù)在自動化方面有欠缺，為了適應(yīng)臨床實驗室以及結(jié)合微流體（microfluidic）裝置的應(yīng)用，需要開展更簡單的檢測方法。- WesternBlue