實驗三離心技術(shù)及酶學(xué)實驗

實驗三離心技術(shù)及酶學(xué)實驗第1頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月概念生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術(shù)。沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度，離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備。第2頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)基本原理離心力當(dāng)一個粒子(生物大分子或細胞器)在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：第3頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月相對離心力（RCF）通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，所以稱為相對離心力。在離心場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980cm/s2）。第4頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2r(rpm-revolutionsperminute為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min)低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示高速離心時則以“g”表示第5頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)離心機的主要構(gòu)造和類型

工業(yè)用離心機離心機制備性離心機實驗用離心機分析性離心機第6頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月一、制備性離心機的三類1．普通離心機：最大轉(zhuǎn)速6000rpm左右2．高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速為20000～

25000rpm（r/min）3．超速離心機：轉(zhuǎn)速可達50000～80000rpm，超速離心機裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機的主要區(qū)別。第7頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月二、轉(zhuǎn)頭1．角式轉(zhuǎn)頭

第8頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月2．蕩平式轉(zhuǎn)頭：

這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶(離心套管)構(gòu)成。

3．區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：

區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。

4．垂直轉(zhuǎn)頭：

其離心管是垂直放置的。

5．連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：

轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。第9頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月三、離心管

塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。第10頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學(xué)腐蝕。但用時也應(yīng)避免接觸強腐蝕性的化學(xué)藥品，如強酸、強堿等。離心管蓋離心前必須蓋嚴，配平時需帶管蓋重量防止樣品外泄、揮發(fā)支持離心管，防止離心管變形第11頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月制備性超速離心的分離方法差速沉降離心法逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替進行離心，使不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒優(yōu)點：操作簡便缺點：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活第12頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月密度梯度區(qū)帶離心法（區(qū)帶離心法）定義：將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。優(yōu)點：分理效果好、適應(yīng)范圍廣、顆粒不會擠壓變形保持活性缺點：離心時間長、需制備惰性梯度介質(zhì)溶液、操作嚴格不易掌握第13頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月五、離心操作的注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。第14頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。離心過程中不得隨意離開第15頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗內(nèi)容酶的提取及比活性測定第16頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月一、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)的分離純化及比活性測定

[目的]1．掌握AKP分離純化的實驗原理、方法及注意事項

2．了解檢測AKP活性測定的原理和方法。第17頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月方法酶的本質(zhì)：蛋白質(zhì)鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電泳第18頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月酶組織細胞：先破碎細胞，再用一定的試劑提取體液：直接提取方法物理方法化學(xué)方法第19頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月原則制備的原料初期采用、后期采用方法影響因素第20頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月影響因素pH：最適pH溫度：低溫時酶比較穩(wěn)定，有機溶劑需預(yù)冷氧化：－SH對某些酶的活性必需，加入還原劑重金屬離子污染：與－SH發(fā)生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，PMSF、DFP介質(zhì)的極性和離子強度：疏水最穩(wěn)定pH第21頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月評估指標酶的純度－－用比活性代表定義：單位重量（mg）蛋白樣品中所含酶的活性單位表示方法：每mg蛋白質(zhì)所具有酶的活性單位測定方法：①每ml樣品中的蛋白質(zhì)mg數(shù)②每ml樣品中酶的活性單位酶的活性單位：酶促反應(yīng)在單位時間（秒、分鐘、小時）內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。第22頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月酶的回收率提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴隨部分酶的損失。在保證純度的前提下，應(yīng)盡可能提高酶的收率。第23頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

[原理]

機械破碎法制備肝勻漿

勻漿液低濃度醋酸鈉：低滲破膜

低濃度醋酸鎂：保護和穩(wěn)定AKP

有機溶劑沉淀法分離純化AKP

加入不同有機溶劑，重復(fù)離心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白質(zhì)

33％丙酮(30％乙醇)：AKP溶解

50％丙酮(60％乙醇)：AKP不溶解

(一)堿性磷酸酶的分離提純

第24頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月[操作步驟]

25g肝組織剪碎

+0.01M醋酸鎂-醋酸鈉溶液75ml，勻漿機中勻漿取肝勻漿4ml(A液）A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性A2：取0.1mlA液+4.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度

+2ml正丁醇，混勻2min，室溫置30min，離心（2500rpm)5min下清液（吸?。┏恋恚墸?/p>

+等體積丙酮，離心（2000rpm)5min

上清液（棄）沉淀

+0.5M醋酸鎂2ml溶解（B液）第25頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月[操作步驟]

B液

+95%冷乙醇至30%，離心（2500rpm）5min上清液（吸?。┏恋恚墸?/p>

+95%冷乙醇至60%，離心（2500rpm）5min上清液（棄）沉淀

+0.01M醋酸鎂-醋酸鈉2ml,溶解（C液）

C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性

C2：取0.1mlC液+0.1ml生理鹽水，待測蛋白濃度

B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性B2：取0.1mlB液+0.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度第26頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月加入有機溶劑計算公式設(shè)加入Xml95%乙醇※至終濃度30%30%（B液體積+X）=95%×XX=30%B液體積÷95%-30%=0.462B液體積※至終濃度60%60%（上清液體積+X）－30%上清液體積=95%XX=（60%-30%）上清液體積÷95%-60%=0.867上清液體積第27頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月[注意事項]各步加入有機溶劑量要準確。否則會影響整個實驗結(jié)果。操作要在低溫下進行加入有機溶劑時要慢慢滴加，充分攪拌，避免局部濃度過高而引起升溫和變性。加入有機溶劑混勻后不宜放置過久，應(yīng)立即離心。離心析出的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即將溶于適量的緩沖液中，以避免酶活力的喪失。第28頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)堿性磷酸酶的比活性測定[原理]比活性的定義單位重量的蛋白質(zhì)樣品中所含的酶活性單位。通常用每毫克蛋白質(zhì)具有的酶活性單位來表示。用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純化成功與否的評價指標之一。第29頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月測定樣品的比活性必須測定：每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。第30頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶活性

AKP4-氨基安替比林磷酸苯二鈉酚醌衍生物（紅色）鐵氰化鉀根據(jù)紅色的深淺用比色法測定酚的含量。37℃保溫15分鐘產(chǎn)生1μg酚者為1個酶活性單位。第31頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月第32頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量回顧實驗原理（實驗講義第60頁）。第33頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

[操作步驟]

1.AKP活性單位測定取試管5支，按下表操作：試劑（ml）空白管標準管ABC0.04mol/L基質(zhì)液1.01.01.01.01.0pH10碳酸緩沖液0.50.50.50.50.537℃水浴保溫5分鐘蒸餾水0.1____酚標準液（0.1mg/ml）_0.1___測定液__A1液0.1B液0.1C1液0.1混勻，立即置于37℃水浴保溫15分鐘第34頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月加0.2MNaOH溶液1ml加0.3%4-氨基安替比林1ml,0.5%鐵氰化鉀溶液2ml，混勻，室溫10min，各溶液進行A510測定計算：酶活性單位/ml=A標本/A標準×C標準（0.1）×稀釋倍數(shù)

[操作步驟]第35頁，課件共38頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.蛋白質(zhì)含量測定

取試管5支，按下表操作試劑（ml）空白管標準管ABC生理鹽水0.1標準蛋白溶液0.1樣品A2液0.1B2液0.1C2液0.1考馬斯亮藍試劑5.05.05.05.05.0室溫5min，各管進行A595測定計算：樣品中蛋白質(zhì)的含量（μl）=A樣品/A標