微生物限度檢查解讀

微生物限度檢查解讀第1頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月一、前言1.規(guī)定了微生物限度檢查的定義及檢查內(nèi)容。2.實驗的環(huán)境設施及操作的無菌要求。3.對檢查中使用的助溶劑、中和劑、滅活劑的作用及對微生物生長和存活的影響應進行驗證4.霉菌培養(yǎng)溫度改為23~28℃，控制菌培養(yǎng)溫度改為以35~37℃表示，細菌不變。5.增加檢驗結果的單位：10g，10ml。第2頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月二、具體內(nèi)容1.檢驗量：指明了檢驗量是一次試驗所用的量；對貴重藥、微量包裝藥可酌減，但不規(guī)定3g或5g；因沙門菌檢查的報告單位為10g或10ml，所以檢驗量應另增10g或10ml（不含陽性對照用量）。第3頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月2.供試液制備（與2000年版藥典相比的不同點）2000年版藥典2005年版藥典（1）使用0.9%無菌NaCl溶液使用pH7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖液（2）供試液制備以加一定體積表示供試液制備以加至一定體積表示（3）供試液分三類六種供試液分三類七種，但分類更合理，函蓋面更全（4）制備方法有限增加了新的制備方法，對培養(yǎng)基稀釋作了進一步詳細規(guī)定第4頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)3.1平皿法：3.1.1平皿法兩版藥典比較3.1.2平皿法菌數(shù)報告規(guī)則

3.1.3平皿法其他內(nèi)容，如陰性對照試驗等等與2000年版相同第5頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)（續(xù)）3.2薄膜過濾法(為2005年版藥典新增內(nèi)容)3.2.1操作3.2.2陰性對照試驗3.2.3培養(yǎng)和計數(shù)3.2.4菌數(shù)報告規(guī)則

第6頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.1平皿法兩版藥典比較2000年版藥典2005年版藥典（1）連續(xù)3個稀釋級連續(xù)2~3個稀釋級（2）培養(yǎng)基約15ml培養(yǎng)基約15~20ml（3）每稀釋級應作2~3個平皿每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿（4）無培養(yǎng)和計數(shù)欄增加對同級的兩個平板，當菌落數(shù)大于等于15個時，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或1倍以上第7頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.1平皿法兩版藥典比較（續(xù)）2000年版藥典2005年版藥典（5）培養(yǎng)基的適用范圍，規(guī)定比較亂，表達不清，不易理解營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于進行細菌計數(shù)；玫瑰紅瓊脂培養(yǎng)基用于進行霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于進行酵母菌計數(shù),或用于特殊品種（含蜂蜜、王漿的液體制劑）進行酵母菌計數(shù)第8頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.2平皿法菌數(shù)報告規(guī)則

2000年版藥典存在許多不足，2005年版作了較大改動1)規(guī)定取兩位有效數(shù)字報告。在計數(shù)及中間計算過程中可多保留一位。2)2005年版中：（1）與2000版相同第9頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.2平皿法菌數(shù)報告規(guī)則

(續(xù))（2）當比值≤2時，與2000年版相同，以兩級均數(shù)報告當比值>2時，規(guī)則與2000年版不同，如比值為2~5時，說明兩級之間存在較大差別，應以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)增加了比值大于5，或出現(xiàn)高稀釋級菌數(shù)大于或等于低稀釋級，應查明原因。如試液有較強的抑菌作用，就不能象上述一樣忽略，必須調(diào)整方法第10頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.2平皿法菌數(shù)報告規(guī)則(續(xù))

（3）與2000年版相同（4）與2000年版相同第11頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1.2平皿法菌數(shù)報告規(guī)則(續(xù))

3)還刪除了2000年版中不合理的3條;把培養(yǎng)基稀釋列為具抑菌活性供試品在任何情況下通用的方法，不僅僅局限于某種情況,而且方法也進行了合理的調(diào)整，取樣改為2ml，每1ml所注平皿多個(不定)第12頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2薄膜過濾法

(為2005年版藥典新增內(nèi)容)3.2.1操作：1）取相當于供試品1g（ml）的供試液[如取供試品1g（ml）或1：10供試液10ml或1：100供試液100ml]，加至適量稀釋劑，混勻，過濾2）沖洗方法、沖洗液、沖洗量（應驗證）3）每種培養(yǎng)基至少制備一張膜

第13頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2薄膜過濾法(續(xù))3.2.2陰性對照試驗:

等同于“空白試驗”，即不加供試品，按同法操作所得結果，每種培養(yǎng)基均需做。第14頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2薄膜過濾法(續(xù))3.2.3培養(yǎng)和計數(shù):

與平皿法相同。但每張濾膜上菌數(shù)應不得過100個，如果超過100個，也就是每1g（ml）供試品含菌量較多，可取適宜稀釋級供試品1ml檢查，例如，1：10取10ml檢查，菌落150個（150個/g），則改用1：10取1ml檢查，菌落為15個（150個/g）第15頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2薄膜過濾法(續(xù))3.2.4菌數(shù)報告規(guī)則:1)報告每1g（ml）供試品菌落數(shù)；2)若膜上無菌落生長時，如果（每張膜過濾1g(ml)供試品或1：10×10ml供試液，如每張膜過濾1：10×10ml供試液，則報告<10個，依此類推，為<1乘以稀釋倍數(shù)第16頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月4.控制菌檢查1)大腸菌基本相同，主要修改是：當MUG和靛基質(zhì)兩項中有一項為陽性時，大腸菌的進一步確認通過大腸菌菌落形態(tài)特征比較進行鑒別排除，增加大腸菌形態(tài)特征，對進一步確認做什么生化試驗不作硬性規(guī)定（是否妥？），所以原有的生化試驗結果判斷刪除了。第17頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月4.控制菌檢查(續(xù))2)增加大腸菌群檢查。3)沙門、金葡、綠膿也和大腸菌一樣作了調(diào)整，大同小異。沙門菌規(guī)定取供試品10g（ml），另加陽性對照10g（ml）。4)增加了梭菌檢查（無論試管或平皿都要注意厭氧條件培養(yǎng)）。第18頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月5.微生物限度標準（略）主要變化是由按劑型控制改為按給藥途徑控制。

第19頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月6.方法驗證6.1細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證：1)菌液制備（略）2)驗證方法：主要分四組，測得四組數(shù)據(jù)。①供試品對照組：按擬定的菌落計數(shù)方法，準確測定規(guī)定量(與試驗組的相同)的供試液中的菌落數(shù)，得供試品的已知含菌數(shù)----相當于已知供試品的含量。②菌液組：測定所加的試驗菌的菌數(shù)----相當于精密稱定對照品，得對照品的已知加入量。第20頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月6.方法驗證(續(xù))③試驗組（操作略）：取已知含菌數(shù)的供試液（試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml）和一定量的試驗菌，進行測定。測得試驗組的總菌量，測定兩份（兩個平皿），求平均值計算試驗組的回收率：試驗組-供試品對照組（加入試驗菌的測定值）菌液組（加入試驗菌的已知值）

（應≥70%）第21頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月6.方法驗證(續(xù))④稀釋劑對照組：以相應稀釋液替代供試品，按③試驗組同法測定計算稀釋劑對照組的回收率：稀釋劑對照組（加入試驗菌的測定值）菌液組（加入試驗菌的已知值）

（應≥70%）第22頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

上述整個試驗應至少進行3次獨立的平行試驗，即分別平行取來自同一批樣品的三份供試品，平行操作，作三次驗證測定。每次驗證試驗的試驗組和稀釋對照組回收率必須兩項同時≥70%，所被驗證的檢查法成立，否則……第23頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月6.2控制菌的驗證

根據(jù)各品種項下微生物限度檢查標準中規(guī)定檢查的控制菌，進行相應的驗證；根據(jù)檢查的控制菌選擇對應的驗證菌，大腸菌群選大腸埃希菌。試驗分二組第24頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

①試驗組（操作略）：規(guī)定量一般為1：10供試液10ml（相當于1g或1ml供試品），沙門菌除外。取供試液、試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中。按擬定方法檢查。第25頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

②陰性菌對照組：檢查大腸、大腸菌群、沙門----金葡為陰性檢查綠膿、金葡、梭菌----大腸為陰性進行陰性試驗時，取供試液及陰性對照菌，然后按控制菌檢查的方法進行試驗，例如，驗證控制菌大腸菌的檢查方法時，應取供試液及金葡菌，按大腸菌檢查方法進行增菌檢查，應不得檢出金葡菌。本陰性菌對照組試驗的目的是為了驗證大腸菌檢查方法的專屬性第26頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月7.總結

作為研發(fā)者，需要做的工作是：(1)．建立方法；(2)．驗證方法；(3)．制訂質(zhì)量標準

作為檢驗者，應該做的工作是：

--按制訂的方法（質(zhì)量標準）檢驗

第27頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月10號資料（質(zhì)量標準研究資料）(1)實驗儀器、試藥（包括培養(yǎng)基、稀釋液、沖洗液、菌液……，包括培養(yǎng)基的相關試驗）(2)根據(jù)什么原因、理由、依據(jù)擬定的方法第28頁，課件共31頁，創(chuàng)作于2023年2月

(3)按藥典要求進行驗證，主要實驗操作(4)驗證數(shù)據(jù)、結果，列表表示(5)得出