《生物工藝學(xué)》基因工程菌的發(fā)酵-課件

生物工藝學(xué)

第十四章基因工程菌的發(fā)酵2ppt課件第一節(jié)工程菌的來(lái)源和應(yīng)用一、何謂基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。3ppt課件二、工程菌的獲得確定目的產(chǎn)物。找出產(chǎn)該產(chǎn)物的細(xì)胞。將細(xì)胞破碎后提純出全部信使RNA。這些信使中包含了該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的合成信息。利用基因擴(kuò)增技術(shù)（PCR），找出所需的目的基因。將目的基因連接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體，形成了重組DNA分子。將重組后DNA分子引入到受體細(xì)胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細(xì)胞繁殖。根據(jù)選擇性標(biāo)記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。4ppt課件三、工程菌應(yīng)具備的條件發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率的，同時(shí)是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。代謝控制容易進(jìn)行。能進(jìn)行適當(dāng)?shù)腄NA重組，并且穩(wěn)定，重組的DNA不易脫落。5ppt課件四、工程菌的應(yīng)用1，基因藥物紅細(xì)胞生成素胰島素干擾素乙肝疫苗生長(zhǎng)激素粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子6ppt課件2，其它發(fā)酵產(chǎn)品酶制劑氨基酸（蘇氨酸、色氨酸）抗生素7ppt課件第二節(jié)工程菌的培養(yǎng)就生產(chǎn)流程而言，從發(fā)酵到分離、純化目標(biāo)產(chǎn)物，工程菌和常規(guī)微生物并無(wú)太多的差異。但工程菌在保存過(guò)程中及發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，以及安全性等問(wèn)題，使得工程菌的培養(yǎng)有著自身所特有的特點(diǎn)。8ppt課件一、安全問(wèn)題關(guān)于基因工程的社會(huì)問(wèn)題，必須提到它的潛在危險(xiǎn)性。經(jīng)過(guò)重組的菌和質(zhì)粒一旦用于工業(yè)化生產(chǎn)，就不可避免地進(jìn)入自然界。這些菌能間接地危害人體健康，使治療藥物失去效用，污染環(huán)境等。因此，安全問(wèn)題是極其重要的。9ppt課件1974年，提出了DNA重組實(shí)驗(yàn)具有潛在生物危險(xiǎn)性的問(wèn)題。后來(lái)，制定了有關(guān)DNA重組實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)則，其目的是保證實(shí)驗(yàn)的安全和推動(dòng)重組DNA的研究。這些準(zhǔn)則參照了防止病原微生物污染的措施，以及根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)安全度的評(píng)定，采用物理密封(P1~P4)和生物學(xué)密封(B1和B2)兩種方法。10ppt課件物理密封是將重組菌封閉于設(shè)備內(nèi)，以防止傳染給實(shí)驗(yàn)人員和向外界擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)規(guī)模在20L以下時(shí)，物理密封由密封設(shè)施、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)組成。密封程度分為P1、P2、P3和P4級(jí)，數(shù)字越大，密封水平越高。生物學(xué)密封要求用只有在特殊培養(yǎng)條件下才能生存的宿主，同時(shí)用不能轉(zhuǎn)移至其它活細(xì)胞的載體，通過(guò)這樣組合的宿主載體系統(tǒng)，可以防止重組菌向外擴(kuò)散。按密封程度分B1和B2級(jí)，B2級(jí)的密封要求最嚴(yán)格。11ppt課件二、工程菌培養(yǎng)的特點(diǎn)工程菌工業(yè)化培養(yǎng)中，產(chǎn)物的產(chǎn)率往往比實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模為低。為提高工程菌體表達(dá)效率，需采取適當(dāng)措施，提高重組DNA在受體細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)及促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物自細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外分泌。工程菌體的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(zhì)(如某種氨基酸或維生素等)的缺陷型，有些基因工程細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程亦產(chǎn)生某些抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物。在培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)考慮控制培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分及其濃度，同時(shí)采取措施，消除抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物，以保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)。12ppt課件三、工程菌的培養(yǎng)工程菌的營(yíng)養(yǎng)控制質(zhì)粒穩(wěn)定性重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的控制及表達(dá)效率13ppt課件1，底物濃度的控制在基因工程茵培養(yǎng)過(guò)程，至少要遵循PI級(jí)物理防護(hù)的規(guī)定，因此必需進(jìn)行菌體的高密度培養(yǎng)。從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。14ppt課件2，質(zhì)粒穩(wěn)定性（1）質(zhì)粒不穩(wěn)定的類型分離性不穩(wěn)定：這是由于在細(xì)胞分裂過(guò)程中質(zhì)粒缺失分配到子細(xì)胞中而導(dǎo)致整個(gè)質(zhì)粒丟失。結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定：這是由于重組質(zhì)粒DNA發(fā)生缺失、插入或重排引起的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化。15ppt課件（2）影響質(zhì)粒穩(wěn)定的因素與質(zhì)粒穩(wěn)定有關(guān)的基因及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)自身對(duì)其穩(wěn)定性的影響宿主對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定的影響質(zhì)粒拷貝數(shù)重組質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響16ppt課件（3）使質(zhì)粒穩(wěn)定的措施組建合適載體選擇適當(dāng)宿主施加選擇壓力抗生素添加法抗生素依賴變異法營(yíng)養(yǎng)缺陷型法控制基因過(guò)量表達(dá)控制培養(yǎng)條件17ppt課件3，表達(dá)效率及質(zhì)?？截悢?shù)控制在工程菌培養(yǎng)過(guò)程中，表達(dá)效率與質(zhì)?？截悢?shù)有關(guān)。在質(zhì)粒穩(wěn)定基礎(chǔ)上，應(yīng)盡可能提高細(xì)胞內(nèi)質(zhì)?？截悢?shù)。在工業(yè)生產(chǎn)中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達(dá)到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細(xì)胞負(fù)荷，此時(shí)拷貝數(shù)較低，而比生長(zhǎng)速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質(zhì)?？截悢?shù)增加，目的基因產(chǎn)量提高。18ppt課件第四節(jié)培養(yǎng)裝置與產(chǎn)物的提取工程菌的培養(yǎng)與普通微生物的培養(yǎng)方法類似。在進(jìn)行以工業(yè)化為目的的DNA重組實(shí)驗(yàn)，以及為生產(chǎn)異種基因產(chǎn)物而培養(yǎng)重組菌時(shí)，當(dāng)然應(yīng)采用簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)系統(tǒng)?，F(xiàn)在多半使用大腸桿菌為宿主，而在一般的通氣攪拌罐中大腸桿菌能生長(zhǎng)良好。19ppt課件一、培養(yǎng)罐作為基因重組體的培養(yǎng)裝置，與一直沿用的通氣攪拌培養(yǎng)罐要有區(qū)別，即不僅要防止外部微生物侵入罐內(nèi)，還必須采用不使培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。按實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則，可把這類密閉型通氣攪拌式培養(yǎng)罐劃分為操作液量20L以上和20L以下兩種?，F(xiàn)今使用的微生物培養(yǎng)裝置，按其滅菌法又可分兩類。一是在高壓滅菌器中進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)罐的滅菌，罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多；另一類是20L以上的培養(yǎng)罐，一般為不銹鋼制品，多采用通新鮮蒸氣進(jìn)行滅菌。20ppt課件二、工程菌外漏的防范首先應(yīng)了解培養(yǎng)微生物在普通通氣攪拌罐中可能發(fā)生外漏的部位和操作。歸納起來(lái)有：排氣，機(jī)械密封，接種，取樣，培養(yǎng)后的滅菌(通入濕熱蒸氣)，排液(輸至下一工序)。21ppt課件1，排氣22ppt課件2，機(jī)械密封考慮培養(yǎng)液外漏的情況，培養(yǎng)基因工程菌時(shí)，以用上部攪拌的雙機(jī)械密封為好。23ppt課件3，取樣普通培養(yǎng)罐的取樣管道在取樣時(shí)會(huì)流出樣品。取樣后對(duì)樣品管道滅菌時(shí)，未滅菌的培養(yǎng)液污水被排至排水管內(nèi)。對(duì)此，必須采取措施，如用取樣工具進(jìn)行取樣。此法可在培養(yǎng)液不接觸外界的條件下取樣。24ppt課件4，培養(yǎng)后的滅菌培養(yǎng)后對(duì)培養(yǎng)液和管道等進(jìn)行滅菌時(shí)，一開(kāi)始流出的末滅菌排水有可能存在活的重組菌。取樣、排液的管道中能產(chǎn)生這類排水，因此，一定要另行安裝排水管并與廢液滅菌貯槽等相連接，以便排放污水。25ppt課件5，接種向罐內(nèi)直接接種的方法是不安全的。簡(jiǎn)單的安全接種法是將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連接后，用無(wú)菌空氣加壓壓入的方法。另一種方法是先把種子液在安全柜內(nèi)移至供接種用的小罐內(nèi)，再將其與培養(yǎng)罐連接，用蒸汽對(duì)連接部分滅菌后，把種子罐中的種子液接入培養(yǎng)罐內(nèi)。26ppt課件6，排液培養(yǎng)后要將培養(yǎng)液輸送至貯罐等下一道工序，這時(shí)也有可能產(chǎn)生氣溶膠和重組菌的擴(kuò)散。安全的方法是在培養(yǎng)開(kāi)始前就將排液口與下段工序相連接并進(jìn)行滅菌，這樣培養(yǎng)一結(jié)束即可直接輸送培養(yǎng)液。如果排液口未與下段工序相連那就應(yīng)與連結(jié)廢液滅菌罐的排水管道相接，這樣就安全了。27ppt課件三、培養(yǎng)罐的管道布局下圖表示重組菌培養(yǎng)罐(P2、P3級(jí))的整體流程圖。重組菌培養(yǎng)罐中，凡有可能外漏重組菌的部分都與排污管道相連。圖中所示的管路能分離并排出污染重組菌的污水。28ppt課件四、基因工程產(chǎn)品的提取和精制

傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品在提取和精制上的不同，主要表現(xiàn)在下列兩方面：傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品多為小分子(工業(yè)用酶除外，但它們對(duì)純度要求不高，提取方法較簡(jiǎn)單)，其理化性能，如平衡關(guān)系等數(shù)據(jù)都已知，因此放大比較有根據(jù)；相反，基因工程產(chǎn)品都是大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)?；蚬こ坍a(chǎn)品大多處于細(xì)胞內(nèi)，提取前需將細(xì)胞破碎，增添了很多困難。29ppt課件另外，對(duì)于基因工程產(chǎn)品，還應(yīng)注意生物安全(biosafety)問(wèn)題，即要防止菌體擴(kuò)散，特別對(duì)前面幾步操作，一般要求在密封的環(huán)境下操作。例如用密封操作的離心機(jī)進(jìn)行菌體分離時(shí)，整個(gè)機(jī)器處在密閉狀態(tài)，在排氣口裝有一無(wú)菌過(guò)濾器，同時(shí)有一根空氣回路以幫助平衡在排放固體時(shí)系統(tǒng)的壓力，無(wú)菌過(guò)濾器用來(lái)排放過(guò)量的氣體和空氣，但不會(huì)使微生物排放到系統(tǒng)外。30ppt課件生物反應(yīng)器的比擬放大制作人：FranklinGangChen2003年11月組員:羅旭余虎姚鵬劉朝芬楊喆謝青蘭31ppt課件生物反應(yīng)器的比擬放大（一）生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介（二）生物反應(yīng)器放大的目的（三）生物反應(yīng)器的放大原則（四）生物反應(yīng)器的放大方法（五）發(fā)酵罐的比擬縮?。┥锘ぐl(fā)展現(xiàn)狀與未來(lái)32ppt課件生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介生物反應(yīng)器是生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵設(shè)備，每一種生物反應(yīng)獲得的產(chǎn)品都離不開(kāi)它。一項(xiàng)生物技術(shù)能否實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，很大程度上依賴于所用反應(yīng)器的效率。在生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與操作中，至少要考慮以下兩方面的問(wèn)題：（1）生物化學(xué)和生物能量學(xué)的問(wèn)題（2）該技術(shù)所涉及的生物反應(yīng)過(guò)程33ppt課件生物反應(yīng)器簡(jiǎn)介生物反應(yīng)器是使生物技術(shù)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品、生產(chǎn)力的關(guān)鍵設(shè)備，其在生物過(guò)程中處于中心地位。生物工業(yè)中使用的生物反應(yīng)器有多種形式。傳統(tǒng)生物工業(yè)中使用的生物反應(yīng)器稱為“發(fā)酵罐”（fermenter）。上個(gè)世紀(jì)70到80年代，“生物反應(yīng)器”這一稱呼開(kāi)始出現(xiàn)，并逐漸被人們廣泛接受和大量運(yùn)用。生物反應(yīng)器的種類比較多，不僅包括傳統(tǒng)的發(fā)酵罐、酶反應(yīng)器，還包括固定化酶或細(xì)胞反應(yīng)器、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器和光合生物反應(yīng)器等等。34ppt課件35ppt課件生物反應(yīng)器放大的目的一個(gè)生物反應(yīng)過(guò)程的開(kāi)發(fā)，通常是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模、中試規(guī)模優(yōu)化研究的基礎(chǔ)上最后才在大型生產(chǎn)設(shè)備中投入生產(chǎn)的。但在不同大小的反應(yīng)器中進(jìn)行相同的生物反應(yīng)時(shí)，在生物反應(yīng)器質(zhì)量、熱量和動(dòng)量傳遞上的差別，有可能導(dǎo)致反應(yīng)速率以及反應(yīng)時(shí)具體過(guò)程的差異，從而導(dǎo)致反應(yīng)的異化。因此，生物反應(yīng)器的比擬放大是生物化學(xué)工業(yè)中的一個(gè)重要研究課題。36ppt課件生物反應(yīng)器的放大原則（一）生物反應(yīng)器的類型很多，所適用的體系也各異，因此生物反應(yīng)器的放大是比較復(fù)雜的。下面就介紹一些放大準(zhǔn)則。（1）幾何相似即按小的與大的裝置各部分幾何尺寸比例大致相同放大。但是，為了避免設(shè)備直徑過(guò)大，大設(shè)備的高徑比往往大一些。（2）恒定等體積功率放大由Pg/V恒定而確定攪拌轉(zhuǎn)速。37ppt課件生物反應(yīng)器的放大原則（二）（三）恒定傳氧系數(shù)kLa放大這個(gè)方法抓住了傳氧這一關(guān)鍵因素，目前應(yīng)用很多。具體應(yīng)用中要注意幾個(gè)問(wèn)題。

1.小試中要測(cè)得準(zhǔn)確的kLa值，選擇合適的計(jì)算公式。

2.注意各計(jì)算kLa公式在放大中參數(shù)的變化及適用范圍。

3.按照計(jì)算P0/Pg選擇通氣比，計(jì)算Vs求kL來(lái)計(jì)算38ppt課件39ppt課件生物反應(yīng)器的放大原則（三）（四）恒定剪切力恒定葉端速度放大剪切力與攪拌槳葉端速度成正比，在恒定體積功率放大時(shí)一般維持n3d2不變（n為攪拌槳轉(zhuǎn)速、d為攪拌槳直徑）（五）恒定的混合時(shí)間tM放大另外，還有人主張考慮NRe及動(dòng)量因子來(lái)放大等，這里就不一一介紹了。40ppt課件生物反應(yīng)器的放大方法生物反應(yīng)器的比擬放大，要對(duì)具體情況做具體分析。根據(jù)不同的需要來(lái)確定放大準(zhǔn)則，再選取合適的方法。具體的放大方法主要有以下幾種：（一）以kLa為基準(zhǔn)的比擬放大法（二）以Po/V相等為準(zhǔn)則的比擬放大（三）其他的比擬放大方法41ppt課件以kLa為基準(zhǔn)的比擬放大法有的菌種在深層發(fā)酵時(shí)耗氧速率很快，因此溶氧速率能否與之平衡就可能成為生產(chǎn)的限制性因素。耗氧速率可以用實(shí)驗(yàn)法測(cè)定。在小型試驗(yàn)發(fā)酵罐里進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程，用適當(dāng)?shù)膬x器記錄發(fā)酵液中的溶氧濃度。42ppt課件43ppt課件以Po/V相等為準(zhǔn)則的比擬放大對(duì)于溶氧速率控制的非牛頓發(fā)酵液系統(tǒng)，把Po/V相等作為比擬放大的準(zhǔn)則就非常方便，同時(shí)也避免了微生物參與所帶來(lái)的計(jì)算kLa的困難。值得注意的是，Po/V與傳質(zhì)系數(shù)之間的確存在著重要的關(guān)系，但Po/V相等并不意味著kLa相等。二者之間沒(méi)有必然的聯(lián)系。44ppt課件其他的比擬放大方法（一）恒周線速度

絲狀菌發(fā)酵受剪率、特別是攪拌葉輪尖端線速度的影響較為明顯。如果僅僅保持kLa相等或Po/V相等，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的失誤。在Po/V相等的條件下，D/T比越小，造成的剪率越大，也有利于菌絲團(tuán)的破碎和氣泡的分散，這對(duì)于產(chǎn)物抑制的發(fā)酵有重要意義。所以，對(duì)于這類發(fā)酵體系，攪拌渦輪周線速度也被認(rèn)為是比擬放大的基準(zhǔn)之一。45ppt課件其他的比擬放大方法（二）恒混合時(shí)間

混合時(shí)間的定義是把少許具有與攪拌罐內(nèi)的液體相同物性的液體注入攪拌罐內(nèi)，兩者達(dá)到分子水平的均勻混合所需要的時(shí)間。混合時(shí)間主要與發(fā)酵液的粘度有關(guān)，通常，低粘度的液體混合時(shí)間要少于高粘度的液體。另外，放大罐的體積越大，混合時(shí)間就越長(zhǎng)。46ppt課件其他的比擬放大方法由此可以看出，比擬放大雖然必須以理性知識(shí)為基礎(chǔ)，但也離不開(kāi)豐富的實(shí)際運(yùn)轉(zhuǎn)經(jīng)驗(yàn)，特別是對(duì)于非牛頓流體發(fā)酵系統(tǒng)尤其如此。直到最近，比擬放大的現(xiàn)狀仍然如此。47ppt課件發(fā)酵罐的比擬縮小在不少情況下，大型的生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵罐是已有的，而用實(shí)驗(yàn)室的搖平去篩選生產(chǎn)用菌株。但有的時(shí)候，搖瓶中的環(huán)境條件與大型發(fā)酵罐有很大的不同，這就導(dǎo)致很多生產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)中的不符合。比擬縮小就是將現(xiàn)有的生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐比擬縮小至實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。目的就是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模中實(shí)現(xiàn)大型反應(yīng)器的微生物生長(zhǎng)活動(dòng)的環(huán)境條件。這就為現(xiàn)有的生產(chǎn)規(guī)模提供了優(yōu)良的菌種篩選和選育的場(chǎng)所，也為工藝條件的優(yōu)化提供服務(wù)。比擬縮小的原理、方法與比擬放大相同。48ppt課件生物化工發(fā)展現(xiàn)狀與未來(lái)（一）國(guó)外生物化工產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)（二）我國(guó)生物化工主要產(chǎn)品發(fā)展方向（三）國(guó)內(nèi)外的生物公司49ppt課件國(guó)外生物化工產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)生物化學(xué)轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，具有原料易得、反應(yīng)條件溫和、選擇性高和環(huán)境污染小的優(yōu)點(diǎn)。特別是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，已使生物化工成為21世紀(jì)最高生命力的產(chǎn)業(yè)。生物技術(shù)是振興化工的一個(gè)重要方面。美國(guó)確定2020年化學(xué)工業(yè)技術(shù)發(fā)展方向是：以催化為中心的化學(xué)合成技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食