醫(yī)學分子生物學(PCR)-課件

醫(yī)學分子生物學

課程主要內(nèi)容第一部分生物大分子的分離純化第二部分分子生物學常用技術(shù)（PCR、核酸分子雜交、基因測序、生物芯片等）第三部分基因工程第二部分分子生物學常用技術(shù)

(一）聚合酶鏈式反應(yīng)

(PolymeraseChainReaction,PCR)核酸(DNA,RNA)

堿基互補配對A=T,C≡G,A=U核酸變性與復(fù)性核酸合成

DNA復(fù)制（DNA－DNA），

逆轉(zhuǎn)錄（RNA－DNA）；

轉(zhuǎn)錄（DNA－RNA），

RNA復(fù)制（RNA－RNA）；——由親代DNA合成兩個相同的子代DNA的過程（DNA指導(dǎo)的DNA生物合成）。

半保留復(fù)制（semiconservativereplication）DNA復(fù)制(replication)

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義

遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，這種保守性是相對的，自然界存在遺傳變異性(堿基錯配)。生物體內(nèi)DNA復(fù)制非常復(fù)雜DNA復(fù)制-DNA的酶促合成：DNA聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶（DDDP），簡寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA分子；底物（substrate):

4種脫氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；引物（primer）:

一段RNA；DNA聚合酶——DNA生物合成

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ

）和Klenow片段

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ－復(fù)制中DNA鏈延伸

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ323個氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個氨基酸木瓜蛋白酶Klenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

N端C端FG5

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性

DNA聚合酶Ⅰ（DNA-polI）大腸桿菌DNA聚合酶I具有三個結(jié)構(gòu)域

DNA聚合酶Ⅰ

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性：①5→3

DNA聚合酶活性。②3→5

核酸外切酶活性。③5→3

核酸外切酶活性。（DNA合成）（校對）（切除RNA引物和突變序列）

DNA聚合酶催化的反應(yīng)

5

至3

的聚合活性

dTTP3'(dNMP)n+dNTP

(dNMP)

n+1+ppi3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppiT依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DDDP）

5’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’35

外切酶活性

53外切酶活性?切除引物或突變的DNA片段辨認錯配的堿基對，將其水解－校對

核酸外切酶活性

復(fù)制的保真性(fidelity)

DNA聚合酶對模板的依賴性，是子鏈與母鏈能準確配對的保證。復(fù)制過程中，復(fù)制的保真性至少依賴三種機制：1、遵守嚴格的堿基配對規(guī)律2、聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能3、復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能DNA復(fù)制-DNA的酶促合成：DNA聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶（DDDP），簡寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA分子；底物（substrate):

4種脫氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；引物（primer）:

一段RNA；如何獲得單鏈DNA模板？？多種蛋白質(zhì)參與（以大腸桿菌為例）解鏈酶（helicase）；單鏈結(jié)合蛋白（single－strandDNAbindingprotein，SSB）；DNA拓撲異構(gòu)酶（DNAtopoisomerase

）解鏈酶（helicase)

——

利用

ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解鏈方向DNA解鏈過程形成超螺旋拓撲異構(gòu)酶解除超螺旋DNA線性雙螺旋從中間解鏈上下都過度擰緊超螺旋進一步解鏈就更加困難拓撲異構(gòu)酶I切開超螺旋的單鏈，再連接成雙鏈。無需ATP。拓撲異構(gòu)酶II切開超螺旋的雙鏈，解除超螺旋，再連接成雙鏈。參與復(fù)制全過程剪切-旋轉(zhuǎn)-連接DNA生物合成條件：依賴DNA的聚合酶(DDDP)；單鏈DNA模板(template)；底物（substrate):4種dNTPs；引物（primer）DNA復(fù)制中為何需RNA引物？DNA聚合酶沒有從頭催化2個游離的脫氧核苷三磷酸聚合的能力；只能在3’-OH端與按堿基配對的dNTP進行反應(yīng)，生成磷酸二酯鍵；引物提供游離的3’-OH末端；5’

A-G

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’引物酶(primase)

在模板的復(fù)制起始部位催化NTP的聚合,

形成短片段的RNA，即引物（primer）。依賴DNA的RNA聚合酶DDRP半不連續(xù)復(fù)制（semi－discontinuousreplication）一條鏈合成是連續(xù)的（前導(dǎo)鏈），一條鏈合成是不連續(xù)的（后隨鏈）；DNA合成的方向性（5’→3’）與反向互補DNA聚合酶：53

聚合酶活性聚合反應(yīng)的方向性:

53DNA連接酶(DNAligase)崗崎片段的連接

連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。一、聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)

在體外由引物介導(dǎo)的DNA序列酶促合成反應(yīng)，即體外DNA擴增技術(shù)。DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase，DDDP）

穆利斯

K.Mullis1945-，美國1993年諾貝爾化學獎PCR－酶促DNA合成DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase，DDDP）

－－合成DNA新鏈DNA模板：單鏈DNADNA引物：提供3’－OH末端底物：四種dNTP基本原理：類似體內(nèi)DNA復(fù)制(合成雙鏈DNA）-DNA聚合酶核酸的熱變性和退火變性-獲單鏈模板退火-單鏈模板與引物結(jié)合延伸－DNA新鏈合成指數(shù)擴增－循環(huán)多次耐熱的DDDPPCR循環(huán)–第一步

–加熱變性靶序列靶序列PCR循環(huán)-第二步–引物與靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’Taq

DNAPolymerase第1個PCR循環(huán)完成后–

得到兩個拷貝的靶序列靶序列

靶序列BiotinBiotin30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,7661cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon

PCR的主要用途

（一）目的基因的克隆，序列分析（二）基因的體外突變，多態(tài)性研究（三）DNA的微量分析PCR擴增條件

94℃,300S（預(yù)變性）

94℃,30S（變性）

25～40cycles

55~65℃,30S72℃,30~120S

（退火，與引物有關(guān)）

72℃,10min（延伸，與擴增長度有關(guān)）

45℃

65℃209bp退火溫度的選擇

梯度PCR(多溫控)

PCR反應(yīng)的影響因素：模板(DNA)聚合酶（耐熱的TaqDNA聚合酶）dNTPs（dATP，dCTP,dGTP，dTTP)

緩沖液DNA引物(10μM)

與待擴增目的基因兩端序列互補的寡核苷酸鏈，決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度。

DNA聚合酶

耐高溫保真性（防止錯配）活性（Mg2+)（3’－5’外切酶活性）

TaqDNA聚合酶

(無3’5’外切酶活性，35輪0.25%錯配，與原始模板有差別)ExTaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶，PfuDNA聚合酶等

TaqDNA聚合酶活性依賴Mg2+(激動劑)

不同的酶需不同濃度的Mg2+

Taq：Mg2+對反應(yīng)影響很大，0.5mM-1.5mM終濃度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量約增加一倍

外界影響：

EDTA鰲合Mg2+∴選較低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基團均可與Mg2+

結(jié)合，降低Mg2+有效濃度?！嗳绻麛U增產(chǎn)物或效率不理想，要注意調(diào)整合適的Mg2+濃度

Mg2+

質(zhì)粒DNA噬菌體DNA染色體DNAcDNA

較小較大通常單拷貝較小

變性較易變性較難非常大，變性難變性較易

模板用量

Plasmid:lng，Chromosome:300-500ng,cDNA:0.5-1μl注意：

模板質(zhì)量很關(guān)鍵，防止交叉污染模板DNA

dNTP

四種脫氧核苷酸，濃度必須一致終濃度：50-200M注意：不穩(wěn)定，保存時間長會失效；

與待擴增目的DNA兩端序列互補的寡核苷酸鏈，決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度。

DNA引物(primer)：解決方案:

避免反復(fù)凍融，分裝凍存；引物設(shè)計一般遵循的原則長度：15－30bp堿基分布的隨機性

G+C含量在40%－60%,Tm=4(G+C)+2(A+T)兩引物間避免互補，以防形成引物二聚體引物自身也不應(yīng)互補，以免引起自身折疊引物的3′端：不能修飾，不應(yīng)錯配引物的5′端：可加修飾位點特異性：與非特異靶區(qū)之間的同源性不能超過70%

或有連續(xù)8個互補堿基同源

人工合成短寡核苷酸片段，Tm=55℃-80℃，兩條引物Tm值要相近，最好一致。

上游Primer與下游Primer正向/反向引物

一條鏈為設(shè)計模板，5’端相同，3’端互補引物設(shè)計（一）

ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301

gttctacact

ctgatcacag

cgtttttgat

cggcgtacag

gcagaaccgt

acacagagat361

caatgtccca

gagggagact

ctgtccctga

agaccactgg

actaaacttc

agcattccct421

ctgacacagc

cctacgcaga

gcccgcagtg

cccctgctga

accaatagct

gcccgtgtga481

agggacgacc

cgcaacatca

ctgtggaccc

caaactgttt

aagaaacgga

gactccgttc541accccgcgtg

ctgtttagca

cccagcctcc

caaactgttt

aagaaacgga

gactccgttc

-3’Primer1:(5’)gatcgg

cgt

aca

ggc

agaac(3’)328-347Primer2:(5’)gaggct

ggg

tgc

taa

aca

gc(3’)569-550反向互補擴增產(chǎn)物長度：242bpPCR擴增NGF基因（大鼠）

Primer本身不要出現(xiàn)內(nèi)部互補序列－－形成發(fā)夾(Hairpin)，內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC

減少Primer自身及引物間互補序列，一般不要超過3個互補bp

－－導(dǎo)致二聚體(dimer)

引物設(shè)計（二）

如：CCCATGCATGGAGTC

::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

修飾：

如：32P、生物素、熒光素，酶切位點等，不影響其效果

突變：模板

3’

AGCTCCATGACCCAG5'引物

5’CGCTCCATGACCCAG3'

注意：絕不可以在3'端進行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互補→不能延伸

Primer5’未端可修飾、突變:引物設(shè)計（三）

引物設(shè)計步驟：獲取包含待擴增DNA的核酸序列；引物設(shè)計軟件選擇合適引物；設(shè)計的引物序列的特異性分析；網(wǎng)絡(luò)利用核酸序列的獲得(基因組DNA序列，mRNA序列）核酸序列的比對文獻資料的獲得核酸序列數(shù)據(jù)庫

1、美國國家生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）：網(wǎng)址：http:///。2、歐洲生物信息學研究所（EuropeanBioinformaticsInstitute,EBI），以及所維護的EMBL數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/embl）。3、日本國立遺傳學研究所（JapanNationalInstituteofgeneticscenterforinformationbiology）的DDBJ數(shù)據(jù)庫（DNADataBankofJapan）(http://www.ddbj.nig.ac.jp)。

nucleotideSearchgene

unigeneHomosapiens;Rattusnorvegicus;Musmusculus;ORF（openingreadingframe）Completecds;Partialcds;MyNCBI

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GenesGenomes:24

SNPGeneView:15ClicktochangefilterselectionthroughMyNCBI.RecentActivityClearTurnOffTurnOnnervegrowthfactorAND(...nervegrowthfactorAND(betapolypeptide)(29)NGFB(15)

NGFB(127)

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1:OrdercDNAclone,LinksNGFOfficialSymbolNGFandName:nervegrowthfactor(betapolypeptide)[Homosapiens]OtherAliases:Beta-NGF,HSAN5,MGC161426,MGC161428,NGFBOtherDesignations:OTTHUMP00000013653;beta-nervegrowthfactor;nervegrowthfactor,betapolypeptide;nervegrowthfactor,betasubunitChromosome:1;Location:1p13.1Annotation:Chromosome1,NC_000001.9(115630060..115682380,complement)MIM:162030GeneID:48032:LinksNgfOfficialSymbolNgfandName:nervegrowthfactor(betapolypeptide)[Rattus

norvegicus]OtherAliases:NgfbOtherDesignations:nervegrowthfactor,betaChromosome:2;Location:2q34Annotation:Chromosome2,NC_005101.2(197625773..197632960)GeneID:3107383:OrdercDNAclone,LinksngfOfficialSymbolngfandName:nervegrowthfactor(betapolypeptide)[Xenopus(Silurana)tropicalis]OtherAliases:beta-ngf,hsan5,ngfbGeneID:1001701614:OrdercDNAclone,LinksNGFnervegrowthfactor(betapolypeptide)[Bos

taurus]OtherAliases:NGFBOtherDesignations:nervegrowthfactor,betapolypeptideChromosome:3;Location:3q23Annotation:Chromosome3,NC_007301.3(30482339..30491561)GeneID:281350MyNCBI

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taurus]OtherAliases:NGFBOtherDesignations:nervegrowthfactor,betapolypeptideChromosome:3;Location:3q23Annotation:Chromosome3,NC_007301.3(30482339..30491561)GeneID:281350引物設(shè)計

引物設(shè)計軟件

綜合使用（兩種以上）(DNAstar,primer,primerpremier5，Oligo6)

網(wǎng)絡(luò)引物設(shè)計GenBank比對，證實沒有與其他非目的DNA有高度互補。

BLAST

NCBI網(wǎng)頁的BLAST界面（序列比對）

gatcgg

cgt

aca

ggc

agaacNCBI網(wǎng)頁的BLAST2SEQUENCES界面PCR產(chǎn)物的鑒定（一）

－凝膠電泳瓊脂糖凝膠

———用于分離100－10000bp的片段;

操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高聚丙烯酰胺凝膠

———用于分離5－500bp的片段;效果好、分辨率極高，相