第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

第十一章

抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝制藥微生物生產(chǎn)菌種如何選育？發(fā)酵過程中主要檢測的參數(shù)有哪些？發(fā)酵工藝過程如何控制？知識回顧2第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝主要內(nèi)容抗生素的概述：（1）抗生素的定義（2）抗生素的命名（3）抗生素的分類青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝：（重點(diǎn)）（1）青霉素的概述（2）生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性（3）發(fā)酵工藝過程

3第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1抗生素的定義和命名（1）抗生素的定義

早期：一般認(rèn)為來源于微生物，且主要作用于細(xì)菌感染。故認(rèn)為抗生素(antibiotics)是微生物在代謝過程中產(chǎn)的，在低濃度下就能抑制它種微生物生長和活動，甚至殺死他種微生物的化學(xué)物質(zhì)。由于抗生素的這種殺菌能力，我們曾經(jīng)把這類物質(zhì)叫做抗菌素。4第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝現(xiàn)在：來源：隨著抗生素研究和生產(chǎn)的發(fā)展，新的抗生素的來源正在擴(kuò)大?？梢允俏⑸?、植物（如蒜素、常山堿、黃連素、長春花堿、魚腥草素等）、動物（如魚素、紅血球素等）。但抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是來自微生物的大量發(fā)酵法，微生物是抗生素舞臺上的主角。作用對象：病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物、寄生蟲、藻類、腫瘤細(xì)胞等。因此不能把抗生素僅僅作為抗菌藥物。

5第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝定義：雖然抗生素已被廣泛使用，但是由于抗生素的多樣性，關(guān)于抗生素的定義在專家中一直存在著分歧。目前，一個大多數(shù)專家所接受的定義是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和動物在內(nèi)）在其生命活動過程中產(chǎn)生的或（化學(xué)合成獲得的），能在低濃度下有選擇地抑制他種生物機(jī)能的低分子量的有機(jī)物質(zhì)。狹義的定義是：抗生素是低分子量的微生物代謝產(chǎn)物，能在很低的濃度下抑制其他微生物的生長。6第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

按生物的來源：凡是在動、植物或微生物產(chǎn)生的，可按來源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素按化學(xué)結(jié)構(gòu)命名：化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)清楚的，如四環(huán)素（含有四并苯的基本母核），氯四環(huán)素（金霉素），氧四環(huán)素（土霉素）。名稱R1R2微生物來源四環(huán)素HH金色鏈霉菌金霉素HOH金色鏈霉菌土霉素ClH龜裂鏈霉菌其它：紀(jì)念意義、產(chǎn)地、俗名如正定霉素、井岡霉素、金霉素和土霉素等。（2）抗生素的命名（一般分為三類）7第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-內(nèi)酰胺環(huán)RnaturalpenicillinR=CH2-CO-8第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝β-內(nèi)酰胺環(huán)苯甲異噁唑青霉素氨芐青霉素羧芐青霉素苯氧甲基青霉素9第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝2抗生素的發(fā)展簡史2.1治療和發(fā)展我國的發(fā)展：

1953年5月1日，建立了第一個生產(chǎn)青霉素的抗生素工廠（上海第三制藥廠）；1958年6月3日，最大的抗生素聯(lián)合企業(yè)建成投產(chǎn)（華北制藥廠,石家莊），也是青霉素發(fā)酵總?cè)莘e居世界首位。目前，多為原料藥基地。但在半合成及成品藥的劑型方面與國外相比差距很大。10第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗生素濫用的重災(zāi)區(qū)中國是抗生素使用大國，也是抗生素生產(chǎn)大國：年產(chǎn)抗生素原料大約21萬噸，出口3萬噸，其余自用（包括醫(yī)療與農(nóng)業(yè)使用)，人均年消費(fèi)量138克左右(美國僅13克)。2011年4月7日是世界衛(wèi)生日，首屆合理用藥大會在這一天召開，恰好契合了世界衛(wèi)生日的主題——“抵御耐藥性：今天不采取行動，明天就無藥可用”。11第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝“后抗生素時代”如果不再控制抗生素的濫用狀態(tài)，二十一世紀(jì)人類有可能失去抗生素這個有利的治療武器，重新回到?jīng)]有抗生素的時代，所謂“后抗生素時代”。后抗生素時代是倒退，我們可能回到?jīng)]有藥物可使用的狀態(tài)，大量的傳染性疾病將危害人類的身體健康和生命。雖然這是一種悲觀的想法，但悲觀的很有道理，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥速度比新藥物開發(fā)的速度快得多，這是一個確實(shí)的現(xiàn)象。12第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝3抗生素的分類可根據(jù)生物來源、作用對象、化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、生物合成途徑等方面對抗生素進(jìn)行分類。3.1根據(jù)抗生素的生物來源分類(生物學(xué)家)（1）放線菌產(chǎn)生的抗生素：如鏈霉素、四環(huán)類（如四環(huán)素）、大環(huán)內(nèi)酯類（如紅霉素）、多烯類（如制霉菌素）

、放線菌素類（如放線菌素D）等。（其中鏈霉菌屬最多，諾卡氏菌屬、小單孢菌次之）（2）真菌產(chǎn)生的抗生素：如青霉菌屬和頭孢菌屬等分別產(chǎn)生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黃霉素、頭孢菌素）。13第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝（3）細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：如多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌等。如多粘菌素。（4）植物或動物產(chǎn)生的抗生素：從被子植物蒜中制得的蒜素；從動物臟器中制得的魚素等。3.2根據(jù)抗生素的作用對象分類（醫(yī)生、病理學(xué)家）（1）廣譜抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G-（2）抗G+的抗生素：如青霉素，（3）抗G-的抗生素：如鏈霉素（3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素（4）抗病毒的抗生素：如四環(huán)類抗生素對立克次氏體及較大病毒有一定作用。（5）抗癌的抗生素：如阿霉素14第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.3根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類（化學(xué)家）較復(fù)雜，目前已確定結(jié)構(gòu)的抗生素習(xí)慣如下分類：（1）β-內(nèi)酰胺類抗生素：包括青霉素類，頭孢菌素類等（2）氨基糖苷類抗生素：包括鏈霉素、慶大霉素等（3）大環(huán)內(nèi)脂類抗生素：如紅霉素、麥迪加霉素（4）四環(huán)類抗生素：如四環(huán)素、土霉素（5）多肽類抗生素：如多粘菌素、桿菌肽（6）蒽環(huán)類抗生素：如阿霉素、柔紅霉素（7）喹諾酮類抗生素：如環(huán)丙沙星、諾氟沙星15第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.4根據(jù)作用機(jī)制分類此種分類的優(yōu)點(diǎn)：便于進(jìn)行理論研究，有助于了解抗生素影響病原體新陳代謝的哪些環(huán)節(jié)，從而找出治療的規(guī)律，使抗生素的使用更為合理。（1）抑制細(xì)胞壁合成的抗生素：如青霉素。（2）影響細(xì)胞膜功能的抗生素：多烯類抗生素。（3）抑制病原菌蛋白質(zhì)合成的抗生素：四環(huán)素。（4）抑制核酸合成的抗生素：如影響DNA結(jié)構(gòu)和功能的絲裂霉素C。（5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制電子轉(zhuǎn)移的抗霉素。16第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝17第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝3.5根據(jù)抗生素的合成途徑分類（1）氨基酸、肽類衍生物抗生素：如青霉素類、頭孢菌素等寡肽抗生素。（2）糖類衍生物抗生素：如鏈霉素等糖苷類抗生素。（3）以乙酸、丙酸為單位的衍生物抗生素：紅霉素等丙酸衍生物。18第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝生產(chǎn)方法：1、生物合成法：

①傳統(tǒng)方法②“工程菌”制造法③細(xì)胞融合技術(shù)法

2、化學(xué)合成法；3、生物合成加化學(xué)合成法。

4抗生素的生產(chǎn)工藝19第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

1、生物合成法：

①傳統(tǒng)方法大多數(shù)抗生素是由放線菌和霉菌產(chǎn)生的。菌種是通過從土壤中分離、篩選獲得，一般采用深層通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐生產(chǎn)。傳統(tǒng)方法目前存在很多不足，因此，人們采用基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)，對抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行了改造和重新設(shè)計，不僅可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，還可改革工藝，使抗生素產(chǎn)量成倍地增長。20第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝②“工程菌”制造法

第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麥迪紫紅素A，是美國報道的。他們將產(chǎn)放線紫紅素的部分基因插入產(chǎn)麥迪霉素的放線菌中，構(gòu)建的“工程菌”產(chǎn)生了全新的抗生素。我國新構(gòu)建的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把酰化酶基因克隆到卡那霉素產(chǎn)生菌中獲得的。新的“工程菌”生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小，對耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。21第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝③細(xì)胞融合技術(shù)法

對抗生素產(chǎn)生菌采用細(xì)胞融合技術(shù)的成果更為突出。橄欖色無孢小單孢菌細(xì)胞融合株抗生素產(chǎn)率比原菌株提高140倍。目前DNA重組技術(shù)已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，可以預(yù)見不久將來會有更多的由“工程菌”生產(chǎn)的新型抗生素問世。22第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝2、化學(xué)合成法

根據(jù)某種抗生素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，通過化學(xué)合成的方法，可生產(chǎn)部分抗生素。如：氯霉素、磷霉素等。經(jīng)過化學(xué)合成方法和控制條件的不斷深入研究，越來越多的抗生素可用化學(xué)合成法生產(chǎn)。23第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝3、生物合成加化學(xué)合成法

許多細(xì)菌逐漸出現(xiàn)了抗藥性，已經(jīng)證實(shí)某些抗藥性因子位于細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒上，質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌之間轉(zhuǎn)移，結(jié)果抗性菌日益增多，抗生素療效就越來越低。為了對付細(xì)菌的抗藥性，科學(xué)家對原有的抗生素進(jìn)行了“整容手術(shù)”，細(xì)菌因再無法識別改頭換面的抗生素而被抑制或殺死?，F(xiàn)在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大腸桿菌）高效率的生產(chǎn)半合成抗生素。臨床現(xiàn)在使用的貴重特效藥物先鋒霉素（頭孢菌素類）、氨芐青霉素，就是這類半合成抗生素類藥物。國外已有幾十種這類藥物在實(shí)驗(yàn)室研制成功。24第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗生素制備的一般流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制成品檢驗(yàn)前體發(fā)酵階段提取階段成品包裝25第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝5青霉素概述26第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素的理化性質(zhì)青霉素本身為一元酸，可與鉀、鈉、鎂、鈣、鋁和銨等化合成鹽類。易溶于水，游離酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有機(jī)溶劑。游離酸或鹽類的水溶液均不穩(wěn)定，極易失去抗菌效力。不耐熱，一般保存于冰箱中，但青霉素鹽的結(jié)晶純品，在干燥條件下可于室溫保存數(shù)年。青霉素的抗菌效力與其分子中的β-內(nèi)酰胺環(huán)有關(guān)。27第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝抗菌作用和臨床應(yīng)用青霉素主要抑制G+菌，但對某些G-菌，螺旋體及放線菌也有強(qiáng)大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，溶血性鏈球菌傳染癥如腹膜炎、產(chǎn)褥熱，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。28第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝菌種：產(chǎn)黃青霉生長發(fā)育分七個階段：Ⅰ—Ⅳ期：菌絲生長期，適宜做種子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期：菌絲體自溶期。5.1青霉素生產(chǎn)菌的特性點(diǎn)青霉29第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素產(chǎn)生菌的生長過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長期青霉素分泌期菌絲自溶期30第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。 第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類脂肪小顆粒。 第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜堿性很強(qiáng)。

第4期：空泡，嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體 消失，青霉素產(chǎn)量最高。 第6期：個別細(xì)胞自溶，胞內(nèi)無顆粒，釋放氨，

pH上升。 第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。發(fā)酵培養(yǎng)下的生長過程及細(xì)胞學(xué)變化第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

鏡檢控制規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。第6期到來之前結(jié)束發(fā)酵。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝帶放補(bǔ)料工6.1青霉素生產(chǎn)流程結(jié)晶器種子罐1和2米孢子預(yù)處理罐過濾器發(fā)酵罐萃取器蒸發(fā)器工業(yè)鹽提煉工藝藝發(fā)冷凍干燥孢子瓊脂斜面酵

培養(yǎng)基制備無菌空氣冷至15℃6.青霉素發(fā)酵工藝過程第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

(1)、生產(chǎn)孢子制備斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，最適溫度25-26℃，培養(yǎng)6-8天，形成單菌落。再傳斜面，培養(yǎng)7天，形成綠色斜面孢子。 米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基 上，生長7天，25℃

注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試 驗(yàn)，測定效價及雜菌情況。6.2青霉素發(fā)酵工藝過程第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝(2)、種子罐培養(yǎng)工藝

一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。

培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；充分?jǐn)嚢?00-350rpm；

pH自然，溫度27±1℃,40h

二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％ 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。 通氣量1:1-1.5；攪拌250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h

質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝(3)、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝

三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％ 培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨， 硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.

參數(shù)條件： 通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小時:pH6.4-6.6，26℃；

60小時后:pH6.7,24℃。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝6.3發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制

操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵 發(fā)酵罐：100m3，裝料80m3.

帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。 發(fā)酵周期：180-220h發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補(bǔ)糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo)，不同時期分段控制。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝過程控制——補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度

前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物

40小時后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。 碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝a.流加碳源控制

根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。 葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成 速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至 引起自溶。

(1)培養(yǎng)基第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝b.流加氮源控制

玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。 補(bǔ)加無機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素 氨基氮濃度：0.01-0.05%。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝c.鹽離子控制

無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。 鐵對青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。 罐壁涂環(huán)氧樹脂保護(hù)層。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝d.添加青霉素側(cè)鏈前體

時期：合成階段 種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、 苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制細(xì)胞生長和青霉素合成。 策略：低濃度流加 濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%

控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

(2).溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素25℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝(3).pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝(4).溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝(5).消沫

天然油脂：玉米油； 化學(xué)消沫劑：泡敵。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝7青霉素的提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝(1)、預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液濃度較低：10－30Kg/m3含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

(2)、過濾鼓式真空過濾機(jī)過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過濾機(jī)過濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡