酶的非水相催化-課件

Chapter8EnzymaticcatalysisinNon-aqueoussystem酶的非水相催化1ppt課件Chapter8Enzymaticcatalysis非水相酶催化反應(yīng)人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為酶只能在水相中進(jìn)行催化，而有關(guān)酶的催化理論是基于酶在水溶液中催化反應(yīng)建立起來(lái)的傳統(tǒng)的酶學(xué)理論認(rèn)為，有機(jī)溶劑是酶的變性劑、失活劑，酶在非水相中不具有催化能力20世紀(jì)初，Bourquelot等人將乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑加入到酶的水溶液中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)含水量很高時(shí)，酶仍具有一定催化活力，但比水相中低很多1936年，Sym（波蘭）報(bào)道了酯酶在有機(jī)溶劑中的催化作用，但一直存在爭(zhēng)議，未能引起科學(xué)界的重視2ppt課件非水相酶催化反應(yīng)人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步2ppt課件人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步SymE.A.,BiochemicalJournal,1936,30:609-6173ppt課件人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步3ppt課件

人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步1966年，Dostoli和Siegel分別報(bào)道胰凝乳蛋白酶和辣根過(guò)氧化物酶在幾種非極性有機(jī)溶劑中具有催化活力1975～1983年間，Buckland和Martinek等對(duì)游離酶和固定化酶在有機(jī)溶劑中合成類固醇及甾醇轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的探索1977年，Klibanov等人報(bào)道了在水/氯仿兩相體系中脂肪酶催化N-乙酰-L-色氨酸與乙醇的酯化反應(yīng)，在水中收率極低，而在兩相體系中竟達(dá)到100%1984年，Zaks和Klibanov在Science

雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于酶在有機(jī)介質(zhì)中催化條件和特點(diǎn)的文章，他們指出，只要條件適合，酶可以在非水體系中表現(xiàn)出活性，并催化天然或非天然的底物發(fā)生轉(zhuǎn)化，這一報(bào)道引起了全球科學(xué)界的關(guān)注4ppt課件人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步4ppt課件引起全球關(guān)注的“非水相酶催化”的報(bào)道Porcinepancreaticlipasecatalyzesthetrans-esterificationreactionbetweentributyrinandvariousprimaryandsecondaryalcoholsina99percentorganicmedium.Uponfurtherdehydration,theenzymebecomesextremelythermo-stable.Notonlycanthedrylipasewithstandheatingat100degreesCformanyhours,butitexhibitsahighcatalyticactivityatthattemperature.Reductioninwatercontentalsoaltersthesubstratespecificityofthelipase:incontrasttoitswetcounterpart,thedry enzymedoesnotreactwithbulkytertiaryalcohols.ZaksA.,andKlibanovA.M.,Enzymaticcatalysisinorganicmediaat100degreesC,Science,1984,224:1249-1251(DOI:10.1126/science.6729453)5ppt課件引起全球關(guān)注的“非水相酶催化”的報(bào)道5ppt課件人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步1984年之后，非水相中的酶催化研究開(kāi)始活躍起來(lái)。近年來(lái)，人們對(duì)非水介質(zhì)中的酶結(jié)構(gòu)與功能、酶作用機(jī)制、酶作用動(dòng)力學(xué)等進(jìn)行了大量研究，建立起非水酶學(xué)（non-aqueousenzymology）。同時(shí)人們還對(duì)酶催化的介質(zhì)進(jìn)行了大量研究，開(kāi)發(fā)出各種非水介質(zhì)和新的酶促反應(yīng)體系，發(fā)展出了介質(zhì)工程（mediumengineering），拓寬了酶催化反應(yīng)的應(yīng)用范圍，使酶法合成逐步發(fā)展成為與化學(xué)法合成相互補(bǔ)充的合成方法。6ppt課件人類認(rèn)識(shí)的進(jìn)步6ppt課件第一節(jié)酶的非水相催化概論非水相酶催化的優(yōu)勢(shì)增加某些底物的溶解度改變反應(yīng)平衡改變或提高酶的選擇性7ppt課件第一節(jié)酶的非水相催化概論非水相酶催化的優(yōu)勢(shì)7ppt課件酶非水相催化的幾種類型有機(jī)介質(zhì)中的酶催化

有機(jī)介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機(jī)介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功能。氣相介質(zhì)中的酶催化

酶在氣相介質(zhì)中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。由于氣體介質(zhì)的密度低，擴(kuò)散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點(diǎn)。8ppt課件酶非水相催化的幾種類型有機(jī)介質(zhì)中的酶催化氣相介質(zhì)中的酶催化8超臨界介質(zhì)中的酶催化

酶在超臨界流體中進(jìn)行的催化反應(yīng)。超臨界流體是指溫度和壓力超過(guò)某物質(zhì)超臨界點(diǎn)的流體。離子液介質(zhì)中的酶催化

酶在離子液中進(jìn)行的催化作用。離子液（ionicliquids）是由有機(jī)陽(yáng)離子與有機(jī)（無(wú)機(jī)）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點(diǎn)。9ppt課件超臨界介質(zhì)中的酶催化離子液介質(zhì)中的酶催化9ppt課件第二節(jié)有機(jī)介質(zhì)中水和有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響有機(jī)溶劑中酶分子存在形式固態(tài)酶：以固體形式存在于有機(jī)相中冷凍干燥的酶粉固定化酶結(jié)晶酶——今后的熱點(diǎn)可溶解酶水溶性大分子共價(jià)修飾酶非共價(jià)修飾的高分子/酶復(fù)合物表面活性劑/酶復(fù)合物微乳液中的酶10ppt課件第二節(jié)有機(jī)介質(zhì)中水和有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響有機(jī)溶劑中酶微水介質(zhì)體系（micro-aqueousmediasystem）由有機(jī)溶劑和微量水組成的反應(yīng)體系，即通常所說(shuō)的有機(jī)介質(zhì)體系大部分的微量水以酶分子的結(jié)合水形式存在，對(duì)維持酶分子的空間構(gòu)象和催化活性至關(guān)重要；另一部分水分配在有機(jī)溶劑中酶以固態(tài)的形式懸浮于有機(jī)介質(zhì)中與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系水/極性有機(jī)溶劑混溶體系，水和有機(jī)相的比例都很大，酶和底物以溶解的狀態(tài)存在于此體系中強(qiáng)極性有機(jī)溶劑對(duì)酶的結(jié)構(gòu)和活力影響較大，適用的酶較少例：辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）在此類介質(zhì)中能催化酚類或芳香胺的聚合常見(jiàn)有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系

11ppt課件微水介質(zhì)體系（micro-aqueousmediasys與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系由水和疏水有機(jī)溶劑組成兩相或多相體系游離酶、親水性底物溶于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶于有機(jī)相，固定化酶則懸浮于兩相的界面；催化反應(yīng)在兩相界面進(jìn)行膠束體系正膠束體系（normalmicellessystem）水為主體，表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，酶在液相主體中，反應(yīng)在膠束兩相界面進(jìn)行反膠束體系（reversemicellessystem）有機(jī)溶劑為主體，表面活性劑的極性端朝內(nèi)，非極性端朝外，酶在反膠束內(nèi)部的水相中，反應(yīng)在膠束兩相界面進(jìn)行12ppt課件與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系12ppt課件常見(jiàn)的有機(jī)介質(zhì)體系——膠束體系示意圖13ppt課件常見(jiàn)的有機(jī)介質(zhì)體系——膠束體系示意圖13ppt課件有機(jī)介質(zhì)中水對(duì)酶催化反應(yīng)的影響微水有機(jī)介質(zhì)中水的分布和形態(tài)結(jié)合水與酶粉水合的結(jié)合水、固定載體和其他雜質(zhì)的結(jié)合水自由水溶于有機(jī)溶劑中與酶結(jié)合的水量，以及水在酶分子中的位置是影響酶的活力、穩(wěn)定性以及專一性的決定因素水對(duì)于酶催化活性構(gòu)象的獲得與保持是必須的，但水也與許多酶的失活過(guò)程有關(guān)，即水對(duì)酶催化反應(yīng)具有雙重作用14ppt課件有機(jī)介質(zhì)中水對(duì)酶催化反應(yīng)的影響微水有機(jī)介質(zhì)中水的分布和形態(tài)1水分子直接或間接地通過(guò)氫鍵、疏水鍵、范德華力等非共價(jià)相互作用來(lái)維持酶的催化活性所必需的構(gòu)象酶分子周圍水的存在（水化層），能降低酶分子中極性氨基酸殘基之間的相互作用，防止產(chǎn)生不正確的構(gòu)象必需水（essentialwater）定義：維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必須的最低水量，通常是與酶分子緊密結(jié)合的一層左右的水分子，即水化層不同酶與必需水結(jié)合的緊密程度，以及所結(jié)合的必需水?dāng)?shù)量是不同的必需水是維持酶分子間次級(jí)鍵所必需的，是維持酶構(gòu)象的“潤(rùn)滑劑”15ppt課件水分子直接或間接地通過(guò)氫鍵、疏水鍵、范德華力等非共價(jià)相互作用水對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響典型的非水酶體系中水含量通常只占0.01%，但其微小差距會(huì)導(dǎo)致酶催化活力的較大改變最適含水量：在酶催化反應(yīng)速率達(dá)到最大時(shí)的水含量酶含水量<最適含水量，酶構(gòu)象過(guò)于“剛性”而失活酶含水量>最適含水量，酶構(gòu)象過(guò)于“柔性”，因變構(gòu)而失活同一種酶，反應(yīng)系統(tǒng)的最適含水量與有機(jī)溶劑的種類、酶的純度、固定化酶的載體性質(zhì)和修飾性質(zhì)等因素有關(guān)16ppt課件水對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響16ppt課件水活度（wateractivity）為了排除溶劑對(duì)最適含水量的影響，Halling建議用“水活度”描述有機(jī)介質(zhì)中酶催化活力與水的關(guān)系水活度（Aw）體系中水的逸度（fugacity）與純水逸度之比，近似等于體系中水的蒸氣壓與相同條件下純水的蒸氣壓之比最適含水量與溶劑極性成正比，而最佳水活度與溶劑極性大小無(wú)關(guān)，故采用水活度作參數(shù)更確切Aw

值較小有機(jī)溶劑中鍵合到酶上的水量與在空氣中鍵合到酶上的水量非常相似，表明有機(jī)溶劑沒(méi)有直接影響水與酶緊密結(jié)合Aw

值較大有機(jī)溶劑使酶結(jié)合的水量減少（溶劑與鍵合位點(diǎn)的水分子發(fā)生直接競(jìng)爭(zhēng)）17ppt課件水活度（wateractivity）17ppt課件有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響有機(jī)溶劑通過(guò)與水、酶、底物和產(chǎn)物的相互作用，直接或間接影響酶的活性和穩(wěn)定性有機(jī)溶劑主要通過(guò)以下三種途徑發(fā)生作用(1)有機(jī)溶劑與酶直接發(fā)生作用，通過(guò)干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性被抑制或酶的失活(2)有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的底物/反應(yīng)產(chǎn)物相互作用，影響正常反應(yīng)的進(jìn)行(3)有機(jī)溶劑直接和酶分子周圍的水相互作用18ppt課件有機(jī)溶劑對(duì)酶催化反應(yīng)的影響18ppt課件對(duì)酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響酶分子與溶劑的直接接觸，其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生不可忽視的變化例：枯草桿菌蛋白酶在乙腈中，有12個(gè)乙腈分子結(jié)合到酶分子中，其中有4個(gè)是原來(lái)水分子結(jié)合的位點(diǎn)對(duì)酶活性中心結(jié)合位點(diǎn)的影響減少整個(gè)活性中心的數(shù)量，活性中心數(shù)目喪失的多少取決于溶劑的疏水性強(qiáng)弱溶劑分子能滲透入酶的活性中心，與底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心的結(jié)合位點(diǎn)，降低活性中心的極性，增加酶與底物的靜電斥力例：甲醇可進(jìn)入辣根過(guò)氧化物酶的活性中心，與鐵卟啉配位結(jié)合19ppt課件對(duì)酶分子表面結(jié)構(gòu)的影響19ppt課件對(duì)酶活性的影響——溶劑極性與酶活力的關(guān)系溶劑對(duì)底物和產(chǎn)物分配的影響酶的“必需水”層是底物、產(chǎn)物分布的中介有機(jī)溶劑能改變酶分子“必需水”層中底物或產(chǎn)物的濃度有機(jī)溶劑極性小，疏水性強(qiáng)，疏水性底物難于進(jìn)入“必需水”層有機(jī)溶劑極性強(qiáng)，親水性強(qiáng)，疏水性底物在有機(jī)溶劑中溶解度太低20ppt課件對(duì)酶活性的影響——溶劑極性與酶活力的關(guān)系20ppt課件底物專一性有機(jī)介質(zhì)中酶活性中心結(jié)合部位與底物的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，致使酶的底物特異性發(fā)生改變解釋：疏水性的相對(duì)強(qiáng)弱第三節(jié)酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性21ppt課件底物專一性第三節(jié)酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性21ppt課件不同的有機(jī)介質(zhì)，酶的底物專一性也不一樣極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑中，疏水性較強(qiáng)的底物易反應(yīng)極性較弱的有機(jī)溶劑中，疏水性較弱的底物易反應(yīng)22ppt課件不同的有機(jī)介質(zhì)，酶的底物專一性也不一樣22ppt課件對(duì)映體選擇性對(duì)映體選擇性（enantioselectivity）是酶在對(duì)稱的外消旋化合物中識(shí)別一種異構(gòu)體的能力大小的指標(biāo)。酶在水溶液中催化的對(duì)映體選擇性較強(qiáng)，而在疏水性強(qiáng)的有機(jī)介質(zhì)中對(duì)映體選擇性較差23ppt課件對(duì)映體選擇性23ppt課件區(qū)域選擇性區(qū)域選擇性（regioselectivity），即酶能夠選擇性地催化底物分子中某個(gè)區(qū)域的基團(tuán)優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)化學(xué)鍵選擇性鍵選擇性（chemoselectivity），即同一個(gè)底物分子中有兩種以上化學(xué)鍵可與酶反應(yīng)，酶對(duì)其中一種優(yōu)先反應(yīng)鍵選擇性的意義：可在不需要基團(tuán)保護(hù)的情況下對(duì)特定部位的基團(tuán)進(jìn)行衍生化24ppt課件區(qū)域選擇性24ppt課件熱穩(wěn)定性許多酶在有機(jī)介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性比在水溶液中的好部分酶在有機(jī)介質(zhì)中能耐受高熱有機(jī)溶劑中酶的熱穩(wěn)定性還與介質(zhì)中水含量有關(guān)水含量高，穩(wěn)定性低25ppt課件熱穩(wěn)定性25ppt課件pH特性“pH記憶”（pHimprinting）現(xiàn)象在有機(jī)介質(zhì)中，酶所處的pH環(huán)境與酶在凍干、溶劑沉淀或吸附到載體上之前所使用的緩沖液的pH相同，也稱“pH印跡”原因——“必需水”在有機(jī)溶劑中酶分子表面的“必需水”只要在特定的pH和離子強(qiáng)度下，酶分子活性中心周圍的基因才能處于最佳的離子化狀態(tài)，當(dāng)酶分子從水溶液轉(zhuǎn)移到有機(jī)介質(zhì)時(shí)，原有的解離狀態(tài)不變，被保持在有機(jī)介質(zhì)中26ppt課件pH特性26ppt課件第四節(jié)有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制

酶的選擇依據(jù)酶活力高低反應(yīng)速率和反應(yīng)時(shí)間酶的穩(wěn)定性可重復(fù)使用的次數(shù)酶催化的選擇性產(chǎn)物中某種異構(gòu)體的產(chǎn)率和純度底物的選擇和濃度控制底物的極性與溶解度底物專一性的變化底物的可接近程度底物在溶劑與“必需水”中的分配情況底物的抑制情況27ppt課件第四節(jié)有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制酶的選擇依據(jù)27有機(jī)溶劑的選擇溶劑極性判據(jù)

——介電常數(shù)（）

——疏水性參數(shù)（lgP）溶劑極性應(yīng)適中與水混溶的有機(jī)介質(zhì)含量28ppt課件有機(jī)溶劑的選擇28ppt課件含水量的控制水活度的控制：向干燥的反應(yīng)器中直接加入某種高水合鹽可獲得恒定的水活度原理高水合鹽在初始階段釋放結(jié)合水到體系中，供給酶必需水，本身變?yōu)榈退消}反應(yīng)后期，此低水合鹽結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的水變?yōu)楦咚消}，保持了體系的水活度29ppt課件含水量的控制29ppt課件溫度的控制溫度升高，最適溫度變化？溫度升高，立體選擇性變化？pH和離子強(qiáng)度的控制最適pH值酶在冷凍干燥過(guò)程中，pH狀態(tài)發(fā)生變化冷凍干燥保護(hù)劑在酶液凍干之前或催化過(guò)程采取保護(hù)措施，可加有機(jī)相緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)的pH值30ppt課件溫度的控制30ppt課件有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)水分子含量少，酶分子的構(gòu)象更具有“剛性”引起酶變性的很多因素，與水的存在有關(guān)，有機(jī)溶劑可增加穩(wěn)定性降低了有水參加的副反應(yīng)省略產(chǎn)物分離萃取過(guò)程，提高收率31ppt課件有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)31ppt課件第五節(jié)酶非水相催化的應(yīng)用常見(jiàn)部分酶在非水相催化中的應(yīng)用32ppt課件第五節(jié)酶非水相催化的應(yīng)用常見(jiàn)部分酶在非水相催化中的應(yīng)用32手性技術(shù)領(lǐng)域——手性藥物

手性（chirality）化合物，是指化學(xué)組成相同，而其立體結(jié)構(gòu)互為對(duì)映體的兩種異構(gòu)體化合物。手性藥物，是指只含單一對(duì)映體的藥物。33ppt課件手性技術(shù)領(lǐng)域——手性藥物手性（chira手性藥物對(duì)映體的藥效差異34ppt課件手性藥物對(duì)映體的藥效差異34ppt課件1960年代“反應(yīng)停”事件

反應(yīng)停是抗妊娠反應(yīng)的鎮(zhèn)靜藥沙利度胺的俗稱。孕婦在懷孕一二個(gè)月之間，服用了反應(yīng)停的母親生出畸形兒。這種嬰兒手腳比正常人短，甚至根本沒(méi)有手腳。截至1963年，在世界各地由于服用該藥物而誕生了12000多名畸形嬰兒。這種藥物的(R)-構(gòu)型是安全有效的，而(S)-構(gòu)型被妊娠婦女服用后卻能造成短肢畸胎。35ppt課件1960年代“反應(yīng)停”事件反應(yīng)停是抗妊娠反例1：環(huán)氧丙醇衍生物的酶法拆分重要的C3

手性合成中間體，用于合成-受體阻斷劑類藥物、HIV蛋白酶抑制劑、抗病毒藥物等采用豬胰脂肪酶（PPL）在有機(jī)溶劑中進(jìn)行拆分36ppt課件例1：環(huán)氧丙醇衍生物的酶法拆分36ppt課件例2：布洛芬（ibuprofen）的酶法拆分采用脂肪酶，在80%異辛烷與20%甲苯組成的混合溶劑中，可以得到較高e.e.

值的(S)-布洛芬添加少量極性溶劑如DMF，e.e.

值可提高至91%37ppt課件例2：布洛芬（ibuprofen）的酶法拆分37ppt課件手性聚合物制備手性聚合物，亦稱“旋光性聚合物(opticallyactivepolymer)”，其分子中存在構(gòu)型或構(gòu)象上的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，因此具有旋光性質(zhì)聚合物旋光性的來(lái)源手性單體聚合得到：如氨基酸蛋白質(zhì)聚合物分子的手性構(gòu)象：如DNA雙螺旋手性聚合物具有特殊的光、電、磁性等特征，可作為特殊的功能性材料使用采用脂肪酶可在有機(jī)介質(zhì)中通過(guò)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成手性聚合物38ppt課件手性聚合物制備38ppt課件可降解高分子可降解高分子是指在一定條件下，能被生物體侵蝕或代謝而降解的聚合物材料可降解高分子用途廣泛39ppt課件可降解高分子39ppt課件可降解高分子內(nèi)酯的開(kāi)環(huán)聚合40ppt課件可降解高分子40ppt課件可降解高分子聚糖酯的合成41ppt課件可降解高分子41ppt課件光電功能材料辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP，EC1.11.1.7）HRP是一種糖蛋白，在辣根中該酶的含量很高，故名HRP以鐵卟啉為輔基，在過(guò)氧化氫存在時(shí)能催化苯酚、苯胺及其取代物生成自由基，并引發(fā)自由基聚合42ppt課件光電功能材料42ppt課件光電功能材料HRP催化酚的聚合自由基聚合階段自由基鏈傳遞階段43ppt課件光電功能材料自由基聚合階段自由基鏈傳遞階段43ppt課件光電功能材料發(fā)光聚合物——聚對(duì)苯基苯酚的合成

酶法合成的聚酚具有較高的三階非線性光學(xué)系數(shù)X(3)，是重要的非線性光學(xué)材料。44ppt課件光電功能材料酶法合成的聚酚具有較高的三階非線光電功能材料導(dǎo)電聚合物——聚酚胺的合成酶法合成的聚酚胺類物質(zhì)具有電子共軛結(jié)構(gòu)，通過(guò)摻雜表現(xiàn)出一定的導(dǎo)電性HRP能夠以過(guò)氧化氫為電子受體，專一地催化氨基酚類物質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，并引發(fā)聚合45ppt課件