苯磺酸氨氯地平血漿生物樣品檢測(cè)方法的改進(jìn)

苯磺酸氨氯地平血漿生物樣品檢測(cè)方法的改進(jìn)

苯磺酸氨基丙烯酸酯是一種新型抗劑二羥吡啶鈣離子抗劑。對(duì)血管的選擇性很高。主要用于周長(zhǎng)手術(shù)，也可擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腎臟動(dòng)脈。該藥物適用于各型高血壓的治療,也可用于穩(wěn)定型心絞痛患者。目前,已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道苯磺酸氨氯地平血漿生物樣品檢測(cè)方法,主要包括高效液相色譜紫外檢測(cè)(HPLC-UV)材料和方法藥物和試劑結(jié)果1內(nèi)源性基質(zhì)的提取回收率結(jié)果表明,不同的堿化劑對(duì)提取回收率存在影響,但對(duì)基質(zhì)效應(yīng)影響甚微。圖2A表明飽和碳酸氫鈉和碳酸鈉對(duì)基質(zhì)效應(yīng)無(wú)明顯影響,但在飽和碳酸鈉條件下,分析物提取回收率更高。由圖2B可知,飽和碳酸鈉不同用量對(duì)提取回收率有一定的影響,當(dāng)堿化劑的用量從40μL增加至80μL后,高濃度質(zhì)控樣品氨氯地平提取回收率從58%升高至72%,但飽和碳酸鈉不同用量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)影響沒(méi)有顯著差異(圖2C)。不同萃取溶劑的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)也存在明顯差別,結(jié)果見(jiàn)圖2D。正己烷萃取處理的血漿樣品基質(zhì)效應(yīng)最低,但其提取回收率僅為25%。與乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚相比,甲基叔丁基醚可明顯改善基質(zhì)效應(yīng),且具有較高的提取回收率。此外,萃取時(shí)間不會(huì)明顯影響基質(zhì)效應(yīng)(圖2E)與提取回收率(圖2F)。改變色譜分離條件可顯著降低基質(zhì)效應(yīng)(圖2G)。采用等度洗脫方式,低、中、高濃度質(zhì)控樣品基質(zhì)因子分別為96%、79%和72%,采用梯度洗脫方式低、中、高濃度基質(zhì)因子分別為94%、96%和94%提示血漿基質(zhì)效應(yīng)可通過(guò)改變色譜分離條件實(shí)現(xiàn)。如圖3所示,在等度洗脫條件下,分析物的保留時(shí)間為1.4min。柱后灌注的結(jié)果表明在分析物保留時(shí)間前后質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)均被抑制,且在2.5min處仍存在明顯的信號(hào)抑制,表明血漿中內(nèi)源性基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)存在顯著的影響。改用梯度洗脫分析物的保留時(shí)間延長(zhǎng)至1.7min,但峰形明顯改善。比較等度洗脫與梯度洗脫模式下定量下限信噪比,檢測(cè)靈敏度提高2.5倍。此外,影響基質(zhì)效應(yīng)的內(nèi)源性可與分析物實(shí)現(xiàn)分離,在此條件下的分析物保留時(shí)間處無(wú)質(zhì)譜信號(hào)抑制現(xiàn)象。2方法學(xué)的檢驗(yàn)2.1專業(yè)分析物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均約為1.7min,空白血漿樣品的色譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)干擾峰,在本條件下待測(cè)物的分離與測(cè)定不受影響。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限結(jié)果表明,苯磺酸氨氯地平在0.1~20.0μg?L2.3剩余效果在最高濃度校正標(biāo)樣進(jìn)樣分析完成后,進(jìn)樣分析一個(gè)空白樣品,空白樣品色譜圖中未發(fā)現(xiàn)分析物與內(nèi)標(biāo)殘留,本方法不存在殘留效應(yīng)。2.4準(zhǔn)確度和精密度苯磺酸氨氯地平定量下限、低、中、高濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)與批間精密度和準(zhǔn)確度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)均小于15%,定量下限相對(duì)偏差(|RE|)在20%內(nèi),低、中、高濃度質(zhì)控樣品|RE|<11%。2.5加收率驗(yàn)證苯磺酸氨氯地平回收率在83.5%~88.2%之間,內(nèi)標(biāo)回收率為88.3%。低、中、高濃度苯磺酸氨氯地平和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子分別為(93.9±1.8)%,(95.8±4.9)%,(93.9±1.5)%和(97.9±5.3)%。2.6穩(wěn)定性2.7交叉干擾3人體藥代動(dòng)力學(xué)研究與生物等效評(píng)估藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。AUC綜上所述,受試制劑與參比制劑具有生物等效性,受試制劑與參比制劑為生物等效制劑。內(nèi)源性基質(zhì)的選擇在人體生物等效性或臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中,LC-MS/MS技術(shù)被廣泛應(yīng)用,而基質(zhì)效應(yīng)也是檢測(cè)過(guò)程中不可忽視的問(wèn)題目前常用的樣品前處理方法包括蛋白沉淀,液液萃取和固相萃取等。蛋白沉淀法由于氨氯地平分子式中有兩個(gè)酯基團(tuán),遇強(qiáng)堿(如氫氧化鈉)不穩(wěn)定。參考相關(guān)文獻(xiàn),本研究考察了飽和碳酸鈉和碳酸氫鈉兩種弱堿對(duì)提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響。在飽和碳酸鈉作用下,血漿中氨氯地平更多以分子形式存在,有利于氨氯地平從血漿樣品向有機(jī)相的轉(zhuǎn)移,提高提取回收率。飽和碳酸鈉和碳酸氫鈉對(duì)基質(zhì)效應(yīng)影響沒(méi)有顯著差異。本實(shí)驗(yàn)改變樣品前處理方法與選用同位素內(nèi)標(biāo)可改善相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)、提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的精密度,但絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)與準(zhǔn)確度都不能得到改善目前,評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有柱后灌注法和提取后加入法。柱后灌注法能直觀地顯示內(nèi)源性基質(zhì)對(duì)待測(cè)物在色譜保留時(shí)間處質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)的影響,為提取后加入法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)起到很好的補(bǔ)充作用。本實(shí)驗(yàn)采用柱后灌注法證明血漿中內(nèi)源性基質(zhì)在等度洗脫的條件下對(duì)氨氯地平分析物色譜保留前后均存在明顯抑制情況,提示可通過(guò)改變色譜分離條件改善血漿中內(nèi)源性基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)信號(hào)的影響。本研究采用改變色譜條件由原來(lái)的等度洗脫轉(zhuǎn)為梯度洗脫,利用色譜柱分離內(nèi)源性干擾物和分析物,解決了本方法中存在的基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題。在分析開(kāi)始,利用高水相將極性較大、保留較弱的內(nèi)源性物質(zhì)先洗脫;再緩慢升至高有機(jī)相,讓分析物在此過(guò)程中被洗脫;分析物洗脫后再將高有機(jī)相維持0.7min,使得極性較小的內(nèi)源性物質(zhì)洗脫,可避免其對(duì)后續(xù)樣品分析的干擾。相比于等度洗脫,梯度洗脫方法同時(shí)考慮到基質(zhì)中弱極性和強(qiáng)極性內(nèi)源性干擾物,在避開(kāi)內(nèi)源性干擾物對(duì)本分析樣品干擾的同時(shí)也消除了弱極性物質(zhì)如磷脂等對(duì)后續(xù)樣品檢測(cè)的干擾。柱后灌注結(jié)果也直觀證明,在梯度洗脫條件下內(nèi)源性基質(zhì)對(duì)氨氯地平分析物檢測(cè)不存在干擾現(xiàn)象。由于氨氯地平分子式中的1,4-二氫吡啶環(huán)在光照下易發(fā)生二氫吡啶環(huán)芳構(gòu)化反應(yīng),所以本研究考察了苯磺酸氨氯地平工作溶液光照6h穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在日光燈下照射6h,苯磺酸氨氯地平的穩(wěn)定性控制在(98.24±3.36)%到(99.96±3.66)%之間,其穩(wěn)定性不受光照的干擾,所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程不需要馮仕銀等本文在已報(bào)道方法的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化,比較系統(tǒng)地研究了不同影響因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)中基質(zhì)效應(yīng)的影響,考察了苯磺酸氨氯地平的光穩(wěn)定性,通過(guò)優(yōu)化色譜分離條件消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確定量的影響建立了經(jīng)濟(jì)、方便、特異、準(zhǔn)確、可信的定量分析方法,可用于苯磺酸氨氯地平人體生物等效性研究。苯磺酸氨氯地平對(duì)照品(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1A,含量≥99.9%),由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;內(nèi)標(biāo)d電噴霧離子源和高效液相色譜儀API4000Qtrap,AB四級(jí)桿線性離子阱混合質(zhì)譜儀:美國(guó)AppliedBiosystemsSCIEX公司,配備電噴霧離子源(electrosprayionization,ESI)以及Analyst1.6.1數(shù)據(jù)處理軟件;日本Shimadzu公司ProminenceUFLC型高效液相色譜儀:包括LC-30AD系統(tǒng)泵;本實(shí)驗(yàn)中用到的其他設(shè)備包括分析天平(十萬(wàn)分之一),藥動(dòng)學(xué)分析軟件為DAS2.1.1。色譜柱及預(yù)柱選用WelchUltimateXB-C18色譜柱(100mm×2.1mm,3μm);預(yù)柱為菲羅門(mén)C18保護(hù)柱(4mm×2.0mm,3μm);柱溫為40℃;用2mmol·L溶液制備對(duì)照品溶液:用甲醇配制10.0g·L甲基叔丁基醚法精密吸取空白血漿200μL,置2mL離心管中,加入飽和碳酸鈉溶液80μL,渦旋30s,再加入甲基叔丁基醚1mL,渦旋混合10min,于4℃10000r·minlc-ms/ms分析精密吸取待測(cè)血漿200μL,置2mL離心管中,精密加入內(nèi)標(biāo)工作液20μL,渦旋30s后,加入飽和碳酸鈉溶液80μL,渦旋30s,然后按照“空白血漿樣品處理”方法處理,進(jìn)行LC-MS/MS分析。對(duì)基本影響的研究堿性劑的選擇和劑量的優(yōu)化按照上述血漿樣品處理方法,考察飽和碳酸氫鈉和碳酸鈉以及不同用量飽和碳酸鈉作用下的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。萃取劑的篩選選用乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、正己烷以及甲基叔丁基醚作為萃取劑,考察不同萃取劑對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響。萃取時(shí)間的影響分別在等度洗脫與梯度洗脫條件下,考察渦旋萃取3min與10min對(duì)基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響。柱后注射法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)采用柱后灌注法專業(yè)考察6份來(lái)自不同個(gè)體的空白血漿樣品、空白血漿加苯磺酸氨氯地平和內(nèi)標(biāo)樣品的色譜圖觀察圖譜在氨氯地平和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處是否出現(xiàn)干擾峰。標(biāo)準(zhǔn)曲線取空白血漿200μL,加入內(nèi)標(biāo)工作溶液20μL,配制苯磺酸氨氯地平分析物系列濃度的血漿校正標(biāo)樣,以分析物峰面積A限制平行配制6份0.1μg?L剩余效果按照0.1μg?L準(zhǔn)確度和精度取苯磺酸氨氯地平低、中、高濃度的血漿質(zhì)控樣品,每一濃度配制6份樣品,連續(xù)測(cè)定3批,計(jì)算批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度與精密度。提取回收率與基本效果之間的關(guān)系分別配制苯磺酸氨氯地平低、中、高3個(gè)濃度(0.3、3.0和16.0μg?L對(duì)照品穩(wěn)定性考察考察苯磺酸氨氯地平低、中、高3個(gè)血漿樣品室溫放置6h、-80℃凍融循環(huán)3次、-80℃冷凍放置80天、4℃放置24h穩(wěn)定性以及苯磺酸氨氯地平對(duì)照品溶液室溫放置24h、光照6h、儲(chǔ)備液于-80℃放置3個(gè)月穩(wěn)定性。將各樣品按上述考察條件放置后,進(jìn)行處理分析。計(jì)算血漿樣品在上述條件下的準(zhǔn)確度,考察其穩(wěn)定性。交叉干擾分別配制含20.0μg?L血樣、血漿的準(zhǔn)備健康男性受試者21名入選并隨機(jī)分為兩組,一組11人,另一組10人。由本人簽署知情同意書(shū),經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采用單劑量雙交叉試驗(yàn),清洗期為3周。受試者于試驗(yàn)前一日晚餐后開(kāi)始禁食,試驗(yàn)當(dāng)日晨間空腹服用宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司研制的苯磺酸氨氯地平片(受試制劑,5mg/片)2片或輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)的苯磺酸氨氯地平片(商品名:絡(luò)活喜,參比制劑